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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되어 있는 piperine이 인간 위암세포 AGS의 증식과 세포사멸에 미치는 영향을 확인하고, 이러한 효과에 있어서 Akt 신호전달경로와 Bcl-2 family의 역할에 관해서 확인하고자 하였다.
- 본 연구는 후추과 식물의 주성분인 piperine이 위암세포 AGS의 항암 효과에 미치는 영향을 확인하기 위해 수행되었다. Piperine에 의한 위암세포 AGS의 생존율을 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 농도 의존적으로 암세포의 생존율이 감소하는 것을 확인하였다.
제안 방법
- Akt와 apoptosis 관련 단백질의 역할을 확인하기 위해 LY294002(Akt inhibitor) 20 μM과 piperine 0, 150 μM의 농도로 병행 또는 단독으로 처치한 후 24시간 동안 배양하여 단백질을 추출하였다.
- MTT assay를 통해 확인한 위암세포 AGS의 생존율 억제가 apoptosis에 의한 결과인지를 확인하기 위해 piperine을 위암세포 AGS에 0, 100, 150 μM 농도로 24시간 처치한후 DAPI 염색을 하여 형광현미경으로 관찰하였다(Fig. 3A).
- Membrane은 5% skim milk로 1시간 30분간 blocking 한 후 anti-p53, anti-Bax, anti-Bcl-2, anti-XIAP, anti-PARP, anti-caspase-9, anti-Akt, antip-Akt, anti-β-actin의 1차 항체를 각각 첨가하여 4°C에서 overnight 하였다.
- Piperine에 의한 apoptosis와 Akt signaling pathway 단백질 발현을 확인하기 위해 piperine을 0, 100, 150 μM의 농도로 처치하였다.
- Piperine을 0, 100, 150 μM 의 농도로 처치하여 24시간 동안 배양한 다음 PBS로 두 번 washing 한 후 4% paraformaldehyde 용액으로 15분간 고정하였다.
- Piperine이 위암세포 AGS 생존에 미치는 영향을 확인하기 위해 piperine을 0, 50, 100, 150, 200 μM의 농도로 처치하여 MTT assay를 수행하였다.
- 그 후 2차 항체 anti-rabbit IgG를 첨가하여 2시간 반응시켰다. 각 protein band는 ECL detection reagents(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 실험 결과를 확인하였다.
- Piperine을 0, 100, 150 μM 의 농도로 처치하여 24시간 동안 배양한 다음 PBS로 두 번 washing 한 후 4% paraformaldehyde 용액으로 15분간 고정하였다. 다시 한 번 washing 한 후 PBS에 10배로 희석한 DAPI 시약을 2 mL씩 처치하여 형광현미경(Zeiss Fluorescence Microscope, Thornwood, NY, USA)으로 200배 시야에서 관찰하였다.
- 위암세포 AGS를 96 well plate에 2×104 cells/mL로 분주한 후 세포가 plate에 붙을 수 있도록 24시간 동안 배양시킨 다음, piperine을 0, 50, 100, 150, 200 μM의 농도로 처치하였다.
- 이전 실험 결과를 통해 위암세포 AGS에 piperine을 처치한 투여군에서 암세포의 생존율 억제와 apoptosis 양성세포의 유의적인 증가를 관찰하였으므로, western blotting을 통해 apoptosis 조절에 관여하는 단백질들의 발현 정도를 확인하였다. Piperine을 0, 100, 150 μM의 농도로 24시간 처치하여 apoptosis 경로에 관여하는 단백질의 발현을 대조 군과 비교한 결과 p53, Bax, cleaved-PARP, cleavedcaspase-9의 발현은 증가하였고, Bcl-2, XIAP의 발현은 감소하였다(Fig.
- 추출한 단백질을 전기영동 과정을 거친 후 skim milk로 1시간 30분간 blocking 하고 antip-Akt, anti-Bax, anti-Bcl-2, anti-PARP, anti-β-actin 의 1차 항체와 2차 항체 anti-rabbit IgG를 첨가하여 반응시킨 다음, 각 protein band는 ECL detection reagents를 이용하여 실험 결과를 확인하였다.
대상 데이터
- 1차 항체 anti-Bax, anti-Bcl-2, anti-PARP, anti-p53, anti-XIAP, anti-Akt, anti-p-Akt, anti-caspase9, anti-β-actin과 2차 항체 anti-rabbit IgG는 Cell Signal ing Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 1. The structure of piperine (C17H19NO3).
- 본 연구에 사용된 위암세포 AGS는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포배양에 사용된 RPMI-1640은 Welgene(Gyeonsan, Korea) 에서 구입하였고, fetal bovine serum과 streptomycin/ penicillin은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용된 위암세포 AGS는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포배양에 사용된 RPMI-1640은 Welgene(Gyeonsan, Korea) 에서 구입하였고, fetal bovine serum과 streptomycin/ penicillin은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 본 연구에 사용한 piperine(Fig.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균치와 표준편차를 사용하여 나타내고 각 군간 비교는 one-way ANOVA에 이은 t-test 분석을 시행하였다. 대조군과 비교하여 P값이 0.
이론/모형
- Akt 억제제인 LY294002와 piperine을 병행 또는 단독으로 처치했을 때 Akt의 억제에 따른 p-Akt와 apoptosis 관련 단백질의 발현 양상을 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 LY294002 또는 piperine을 단독으로 처치했을 때 p-Akt와 Bcl-2의 발현은 감소하였고, Bax와 cleaved-PARP의 발현은 증가하였다.
- 이러한 암세포의 생존율 억제가 apoptosis에 의한 효과인지를 확인하기 위해 DAPI staining을 실시한 결과 piperine을 처치한 군에서 apoptotic body와 염색질 응축이 증가하는 것을 확인하였다. MTT assay와 DAPI staining의 결과를 바탕으로 piperine 이 위암세포 AGS에서 apoptosis와 관련한 단백질 발현 양상에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. 그 결과 piperine에 의해 AGS 세포에서 apoptosis를 유도하는 p53, Bax의 발현은 농도 의존적으로 증가하였고, apoptosis를 억제하는 Bcl-2, XIAP의 발현은 농도의존적으로 감소하였다.
- Piperine이 Akt의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. Piperine을 0, 100, 150 μM의 농도로 24시간 처치하였을 때 p-Akt의 발현이 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- Lysate는 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 취해 cell lysate로 사용하였다. 추출한 단백질의 농도는 Bradford protein assay를 이용해 측정하였다. 단백질(40 μg)을 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 크기별로 분리한 후 nitrocellulose membrane(BioRad)에 이동시켰다.
성능/효과
- Apoptosis의 궁극적 단계인 caspase-9와 손상된 DNA를 복구하는 PARP의 분절은 증가하였으며, apoptosis를 방해하는 인자인 Akt의 인산화는 농도의존적으로 감소하였다. Akt 억제제인 LY294002와 piperine을 병행 또는 단독으로 처치하여 western blotting을 진행한 결과 Bcl-2의 발현은 piperine을 단독으로 처치했을 때와 유사한 감소 경향을 보였지만, p-Akt의 발현은 대조군과 비교해 LY294002와 piperine을 단독으로 처치했을 때보다 병행했을 때 더욱 감소하였다. 이와 반대로 Bax와 cleaved-PARP의 발현은 강하게 증가하였다.
- 또한, 대조군과 비교하였을 때 piperine을 처치한 위암세포에서더 많은 apoptosis의 특징인 염색질 응축과 apoptotic body 를 확인할 수 있었다. Apoptosis가 유도된 세포를 정량화하여 분석하기 위해 DAPI 형광에 반응한 apoptotic 세포를 counting 한 결과 대조군과 비교하였을 때 piperine을 처치한 군에서 apoptotic 세포가 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). Kim 등(20)의 연구에서 piperine을 대장암세포 HT-29에 40 μM 농도로 72시간 처치하였을때 세포사멸의 특징인 apoptotic body가 관찰되었다.
- 그 결과 piperine에 의해 AGS 세포에서 apoptosis를 유도하는 p53, Bax의 발현은 농도 의존적으로 증가하였고, apoptosis를 억제하는 Bcl-2, XIAP의 발현은 농도의존적으로 감소하였다. Apoptosis의 궁극적 단계인 caspase-9와 손상된 DNA를 복구하는 PARP의 분절은 증가하였으며, apoptosis를 방해하는 인자인 Akt의 인산화는 농도의존적으로 감소하였다. Akt 억제제인 LY294002와 piperine을 병행 또는 단독으로 처치하여 western blotting을 진행한 결과 Bcl-2의 발현은 piperine을 단독으로 처치했을 때와 유사한 감소 경향을 보였지만, p-Akt의 발현은 대조군과 비교해 LY294002와 piperine을 단독으로 처치했을 때보다 병행했을 때 더욱 감소하였다.
- 그 결과 대조군과 비교하여 LY294002 또는 piperine을 단독으로 처치했을 때 p-Akt와 Bcl-2의 발현은 감소하였고, Bax와 cleaved-PARP의 발현은 증가하였다. LY294002와 piperine을 병행하여 처치했을 때 Bcl-2의 발현은 piperine을 단독으로 처치했을 때와 유사한 감소 경향을 보였지만, p-Akt의 발현은 더욱 감소하는 경향을 보였고 Bax와 cleaved-PARP의 발현은 강하게 증가하는 경향을 확인하였다(Fig. 6). Matsuzaki 등(28)에 의하면 해마신경 세포 rat primary hippocampal neurons에 LY294002를 처치했을 때 대조군과 비교해 Bax의 발현은 증가하였고, Bcl-2의 발현은 감소하였다.
- Piperine(0, 50, 100, 150, 200 μM)을 24시간 처치하였을 때 위암세포 AGS의 생존율은 85.9, 77.3, 59.1, 34.3%로 대조군과 비교해 농도 의존적으로 유의적인 감소를 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 본 연구는 후추과 식물의 주성분인 piperine이 위암세포 AGS의 항암 효과에 미치는 영향을 확인하기 위해 수행되었다. Piperine에 의한 위암세포 AGS의 생존율을 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 농도 의존적으로 암세포의 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 암세포의 생존율 억제가 apoptosis에 의한 효과인지를 확인하기 위해 DAPI staining을 실시한 결과 piperine을 처치한 군에서 apoptotic body와 염색질 응축이 증가하는 것을 확인하였다.
- Piperine을 0, 100, 150 μM의 농도로 24시간 처치하여 apoptosis 경로에 관여하는 단백질의 발현을 대조 군과 비교한 결과 p53, Bax, cleaved-PARP, cleavedcaspase-9의 발현은 증가하였고, Bcl-2, XIAP의 발현은 감소하였다(Fig. 4).
- Piperine을 0, 100, 150 μM의 농도로 24시간 처치하였을 때 p-Akt의 발현이 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 3A). 그 결과 MTT assay에서 확인한 결과와 동일하게 농도 의존 적으로 세포의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 비교하였을 때 piperine을 처치한 위암세포에서더 많은 apoptosis의 특징인 염색질 응축과 apoptotic body 를 확인할 수 있었다.
- MTT assay와 DAPI staining의 결과를 바탕으로 piperine 이 위암세포 AGS에서 apoptosis와 관련한 단백질 발현 양상에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. 그 결과 piperine에 의해 AGS 세포에서 apoptosis를 유도하는 p53, Bax의 발현은 농도 의존적으로 증가하였고, apoptosis를 억제하는 Bcl-2, XIAP의 발현은 농도의존적으로 감소하였다. Apoptosis의 궁극적 단계인 caspase-9와 손상된 DNA를 복구하는 PARP의 분절은 증가하였으며, apoptosis를 방해하는 인자인 Akt의 인산화는 농도의존적으로 감소하였다.
- Akt 억제제인 LY294002와 piperine을 병행 또는 단독으로 처치했을 때 Akt의 억제에 따른 p-Akt와 apoptosis 관련 단백질의 발현 양상을 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 LY294002 또는 piperine을 단독으로 처치했을 때 p-Akt와 Bcl-2의 발현은 감소하였고, Bax와 cleaved-PARP의 발현은 증가하였다. LY294002와 piperine을 병행하여 처치했을 때 Bcl-2의 발현은 piperine을 단독으로 처치했을 때와 유사한 감소 경향을 보였지만, p-Akt의 발현은 더욱 감소하는 경향을 보였고 Bax와 cleaved-PARP의 발현은 강하게 증가하는 경향을 확인하였다(Fig.
- 또한, Song 등(27)에 의하면 p53은 ubiquitin ligase인 Mdm2의 활성을 통해 조절되며, Mdm2는 Akt에 의해서 인산화가 이루어지게 되는데, 이러한 Akt는 p53과 매개된 pro-apoptosis 전사 반응을 방해하거나 p53의 분해나 비활성을 촉진한다고 보고하고 있다. 따라서 본 실험 결과 piperine이 위암세포 AGS에서 Akt의 인산화를 억제하고 p53의 발현을 증가시키므로 piperine에 의한 apoptosis 유도는 Akt와 p53의 발현과 연관이 있는 것으로 생각한다.
- 그 결과 MTT assay에서 확인한 결과와 동일하게 농도 의존 적으로 세포의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대조군과 비교하였을 때 piperine을 처치한 위암세포에서더 많은 apoptosis의 특징인 염색질 응축과 apoptotic body 를 확인할 수 있었다. Apoptosis가 유도된 세포를 정량화하여 분석하기 위해 DAPI 형광에 반응한 apoptotic 세포를 counting 한 결과 대조군과 비교하였을 때 piperine을 처치한 군에서 apoptotic 세포가 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 또한, Fofaria 등 (22)의 연구에서는 piperine을 흑색종세포 SK-MEL-28에 0, 100, 150, 200 μM로 처치했을 때 p53의 발현은 농도의존적으로 증가하였지만, XIAP 발현은 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 piperine이 위암세포 AGS에서 p53, Bax, Bcl-2, XIAP의 발현을 조절하고, PARP와 caspase-9의 분절을 유도하여 apoptosis를 유도 하는 것으로 여겨진다.
- 또한, Kunnimalaiyaan 등(29) 에 의하면 인간 갑상선수질 암세포 TT cell에 LY294002를 처치했을 때 농도 의존적으로 cleaved-PARP의 발현이 증가하였다. 이러한 결과를 종합해볼 때 piperine에 의한 apoptosis 유도는 Akt 경로와 연관이 있을 것으로 생각한다.
- Kim 등(20)의 연구에서 piperine을 대장암세포 HT-29에 40 μM 농도로 72시간 처치하였을때 세포사멸의 특징인 apoptotic body가 관찰되었다. 이러한 결과를 종합해볼 때 piperine의 위암세포 AGS에 대한 생존율 억제는 apoptosis 유도에 의해 이루어진 것으로 생각한다.
- Piperine에 의한 위암세포 AGS의 생존율을 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과 농도 의존적으로 암세포의 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 암세포의 생존율 억제가 apoptosis에 의한 효과인지를 확인하기 위해 DAPI staining을 실시한 결과 piperine을 처치한 군에서 apoptotic body와 염색질 응축이 증가하는 것을 확인하였다. MTT assay와 DAPI staining의 결과를 바탕으로 piperine 이 위암세포 AGS에서 apoptosis와 관련한 단백질 발현 양상에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다.
후속연구
- 이와 반대로 Bax와 cleaved-PARP의 발현은 강하게 증가하였다. 본 연구의 결과를 종합해볼 때 piperine이 위암세포 AGS에서 Akt 경로를 통해 apoptosis를 유도하는 것으로 여겨지며, 향후 위암 예방제나 치료제로의 개발 가능성이 있을 것으로 생각한다.
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