[논문]신선편이 엽채류의 병원성 E. coli 검출을 위한 생화학적동정법 비교 분석

최유경; 이희영; 이수민; 김세정; 하지명; 이지연; 오혜민; 윤요한

doi:10.13103/jfhs.2016.31.6.393

신선편이 엽채류의 병원성 E. coli 검출을 위한 생화학적동정법 비교 분석
Comparison of Biochemical Identification to Detect Pathogenic Escherichia coli in Fresh Vegetables 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.31 no.6, 2016년, pp.393 - 398

최유경 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 이희영 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 이수민 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 김세정 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 하지명 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 이지연 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 오혜민 (숙명여자대학교 식품영양학과) , 윤요한 (숙명여자대학교 식품영양학과)

초록
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본 연구에서는 선택배지와 건조필름을 이용하여 신선편이 엽채류 3종(양상추, 양배추, 어린잎채소)에서 병원성 E. coli를 분리하였고, 의심집락 동정을 위해 생화학적 분석법을 사용하여 동정한 후 결과를 비교 분석하였다. 양상추 20 g, 양배추 20 g, 어린잎채소 10 g에 병원성 E. coli 혼합 균액(Enterohemorrhagic E. coli NCCP11142, Enterotoxigenic E. coli NCCP14037, Enteropathogenic E. coli NCCP14038, Enteroaggregative E. coli NCCP14039, Enteropathogenic E. coli NCCP15661)을 최종농도가 1, 2, 3 log CFU/g이 되도록 접종하였고, BPW (80~90 ml)을 넣은 후 60초 동안 균질화하여 분석하였다. 연구결과, 모든 시료에서 건조필름 시험 양성, 양상추 시료 일부(최종농도 3 log CFU/g 접종시료)를 제외한 모든 시료에서 증균배양법을 이용한 정성시험결과가 음성으로 나타났다. 증균배양과 건조필름 시험을 통해 분리한 병원성 E. coli를 이용하여 생화학적 분석을 실시한 결과, 양상추에서 분리한 병원성 E. coli의 경우, API 20E 100% (44/44), Microgen GNA 100% (44/44), Food System 66.7% (10/15)의 동정률이 나타났다. 양배추의 경우, API 20E 64.7% (22/34), Microgen GNA 50% (16/32), Food System 60% (9/15), 어린잎채소의 경우, API 20E 65.1% (28/43), Microgen GNA 62.3% (27/43), Food System 53.3% (8/15)가 병원성 E. coli로 동정되었다. 본 연구의 결과는 신선편이 엽채류에 대한 병원성 E. coli 검출법 선택에 유용하게 이용될 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The objective of this study was to isolate pathogenic Escherichia coli from fresh vegetables with selective media and Petrifilm, and identify a suspicious colony using biochemical identification. Twenty gram of lettuce, twenty gram of cabbage and ten gram of sprout were prepared, and a 5-strain mixture of pathogenic E. coli (Enterohemorrhagic E. coli NCCP11142, Enterotoxigenic E. coli NCCP14037, Enteropathogenic E. coli NCCP14038, Enteroaggregative E. coli NCCP14039, Enteropathogenic E. coli NCCP15661) was inoculated to obtain 1, 2 and 3 log CFU/g. Eighty to ninety milliliter of buffered peptone water (BPW) was placed and pummeled for 60 s. As a results, the Petrifilm method was all positive, but enrichment method of qualitative analysis was negative except for 3-log CFU/g inoculated lettuce. Regarding biochemical identification of pathogenic E. coli, the identification rates were dependent on type of methods and vegetables; lettuce: API 20E 100% (44/44), Microgen GNA 100% (44/44) and Food System 66.7% (10/15), cabbage: API 20E 64.7% (22/34), Microgen GNA 50% (16/32) and Food System 60% (9/15), sprout: API 20E 65.1% (28/43), Microgen GNA 62.3% (27/43) and Food System 53.3% (8/15). These results could be useful in determining an appropriate method to detect pathogenic E. coli in fresh vegetables.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 신선편이 엽채류 3종(양상추, 양배추, 어린잎채소)에 대해 선택배지와 건조필름을 통해 병원성 E. coli를 분리하고 의심집락을 생화학적분석법을 이용하여 동정함으로써, 신선편이 엽채류 내 병원성 E. coli의 동정 결과를 비교 분석하고자 하였다.

제안 방법

생화학동정키트 분석을 위해 MacConkey agar에서 단일 집락을 TSB에 37℃에서 24시간 배양시킨 후 nutrient agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 획선 도말 하고 37℃에서 24시간 배양하여 단일 집락을 생화학적 분석에 사용하였다. API 20E는 20개의 기질에 세균 부유액을 배양시킨 후 반응 산물의 색 변화를 분석한 다음 apiweb (http://apiweb.biomerieux.com)에 생화학적 패턴 결과(양성 혹은 음성)를 입력하여 데이터베이스 내에서 균을 판정하였다. Microgen GNA는 12개의 기질에 세균 부유액을 배양시킨 후 대사반응물과 생화학 시약의 반응에 따른 색변화를 분석한 다음, 생성된 4자리 코드를 Microgen ID System Software (MID-60)에 입력하여 균을 판정하였다.
Microgen GNA는 12개의 기질에 세균 부유액을 배양시킨 후 대사반응물과 생화학 시약의 반응에 따른 색변화를 분석한 다음, 생성된 4자리 코드를 Microgen ID System Software (MID-60)에 입력하여 균을 판정하였다. Food System은 12개의 생화학 시약에 균 배양배지를 넣어 배양시킨 후 나타나는 색변화로 판정하였으며, 두 가지 시약(7, 8번 시약)과의 반응이 양성일 경우 병원성 E. coli로 판정하였다.
com)에 생화학적 패턴 결과(양성 혹은 음성)를 입력하여 데이터베이스 내에서 균을 판정하였다. Microgen GNA는 12개의 기질에 세균 부유액을 배양시킨 후 대사반응물과 생화학 시약의 반응에 따른 색변화를 분석한 다음, 생성된 4자리 코드를 Microgen ID System Software (MID-60)에 입력하여 균을 판정하였다. Food System은 12개의 생화학 시약에 균 배양배지를 넣어 배양시킨 후 나타나는 색변화로 판정하였으며, 두 가지 시약(7, 8번 시약)과의 반응이 양성일 경우 병원성 E.
생화학동정키트 3종 API 20E (Biomerieux, France), Microgen GNA (Microgen, UK), Food System (Liofilchems.r.l, Italy)을 이용하여 사용 매뉴얼에 따라 분석하였다. Food System의 경우, 균질화된 용액을 이용하여 매뉴얼에 따라 키트에 분주하여 결과를 확인하였다.
증균시험 음성인 경우 건조필름 시험에서 확보된 단일 의심 집락을 TSB에 37℃에서 24시간 배양시킨 다음 MacConkey agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양시켰다. 생화학동정키트 분석을 위해 MacConkey agar에서 단일 집락을 TSB에 37℃에서 24시간 배양시킨 후 nutrient agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 획선 도말 하고 37℃에서 24시간 배양하여 단일 집락을 생화학적 분석에 사용하였다. API 20E는 20개의 기질에 세균 부유액을 배양시킨 후 반응 산물의 색 변화를 분석한 다음 apiweb (http://apiweb.
선택배지·건조필름을 이용한 대장균 분리병원성 E. coli의 분리를 위해 각 시료 당 0.1% bufferedpeptone water (BPW; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 양상추에 80 ml, 양배추에 80 ml, 어린잎채소에 90 ml를 넣고 1분간 균질화(BagMixer; Interscience, St. Nom, France)한 다음, 선택배지와 건조필름을 이용하여 병원성 E. coli를 분리하였다.
양배추에서 분리된 병원성 E. coli에 대한 생화학적 분석법의 결과를 비교하기 위해, 건조필름 시험에서 분리된 병원성 E. coli 의심집락을 이용하여 생화학적 분석을 실시하였다. 생화학적 분석을 위해 사용된 API 20E 분석결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 100% (7/7), 2 log CFU/ g인 경우 58.
양상추에서 분리된 병원성 E. coli에 대한 생화학적 분석법의 결과를 비교하기 위해, 증균배양 및 건조필름 시험에서 분리한 병원성 E. coli 의심집락을 이용하여 생화학적 분석을 실시하였다. 생화학적 분석을 위해 사용된 API 20E, Microgen GNA 동정키트 분석결과 의심집락 100% (44/44)가 E.
어린잎채소에서 분리된 병원성 E. coli에 대한 생화학적 분석법의 결과를 비교하기 위해, 건조필름 시험에서 분리된 병원성 E. coli 의심집락을 이용하여 생화학적 분석을 실시하였다. 생화학적 분석을 위해 사용된 API 20E 분석 결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 46.
준비된 균액은 1,912 × g, 4℃에서 15분 동안 원심분리한 후 phosphate-buffered saline (PBS) 용액으로 2번 세척한 다음 십진 희석하여 최종 접종 농도가 각 1, 2, 3 log CFU/ g가 되도록 농도별 5개의 시료에 100 µl씩 접종하였다.

대상 데이터

API 20E와 Microgen GNA의 경우 선택배지 · 건조필름 시험에서 확인된 의심집락을 이용하여 분석하였는데, 증균시험 양성인 경우 EMB 배지로부터 확보한 단일집락을 사용하였다.
서울 시내 대형마트에서 신선편이 엽채류 3종(양상추, 양배추, 어린잎채소)을 구입한 후, 양상추 20 g, 양배추 20 g, 어린잎채소 10 g을 각각 15개씩 멸균백에 채취하였다. 병원성 E. coli는 Enterotoxigenic E. coli NCCP14037, Enteropathogenic E. coli NCCP14038, Enteroaggregative E. coli NCCP14039, Enteropathogenic E. coli NCCP15661, Enterohemorrhagic E. coli NCCP11142 다섯 가지 균주를 혼합하여 사용하였다. 각 균주의 단일 집락을 tryptic soy broth (TSB; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 용액 10 ml에 넣고 37℃에서 24 시간 동안 배양한 다음, 새로운 TSB 용액 10 ml에 100 µl 분주하고 37℃에서 24 시간 동안 배양하여 균의 활성을 최대화하였다.
서울 시내 대형마트에서 신선편이 엽채류 3종(양상추, 양배추, 어린잎채소)을 구입한 후, 양상추 20 g, 양배추 20 g, 어린잎채소 10 g을 각각 15개씩 멸균백에 채취하였다. 병원성 E.

성능/효과

coli로 동정되었다. Microgen GNA 분석결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 46.2% (6/13), 2 log CFU/g인 경우 40% (6/15), 3 log CFU/g인 경우 100% (15/ 15)가 병원성 E. coli로 동정되었으며, Food System 분석 결과, 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 60% (3/5), 2 log CFU/ g인 경우 40% (2/5), 3 log CFU/g인 경우 60% (3/5)가 병원성 E. coli로 동정되었다. 즉, 병원성 E.
coli로 동정되었다. Microgen GNA 분석결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 57.1% (4/7), 2 log CFU/g인 경우 33.3% (4/12), 3 log CFU/g인 경우 61.5% (8/13)가 병원성 E. coli로 동정되었으며, Food System 분석결과, 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 60% (3/5), 2 log CFU/g인 경우 60% (3/5), 3 log CFU/g인 경우 60% (3/5)가 병원성 E.coli로 동정되었다. 즉, 병원성 E.
coli 의심집락을 이용하여 생화학적 분석을 실시하였다. 생화학적 분석을 위해 사용된 API 20E 분석 결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 46.2% (6/13), 2 logCFU/g인 경우 46.7% (7/15), 3 log CFU/g인 경우 100% (15/15)가 병원성 E. coli로 동정되었다. Microgen GNA 분석결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 46.
coli 의심집락을 이용하여 생화학적 분석을 실시하였다. 생화학적 분석을 위해 사용된 API 20E 분석결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 100% (7/7), 2 log CFU/ g인 경우 58.3% (7/12), 3 log CFU/g인 경우 53.3% (8/15)가병원성 E. coli로 동정되었다. Microgen GNA 분석결과 접종 농도 1 log CFU/g인 경우 57.
coli 의심집락을 이용하여 생화학적 분석을 실시하였다. 생화학적 분석을 위해 사용된 API 20E, Microgen GNA 동정키트 분석결과 의심집락 100% (44/44)가 E. coli로 동정되었다. Food System의 경우, 66.
신선편이 엽채류 3종(양상추, 양배추, 어린잎채소)에 최종접종농도 1, 2, 3 log CFU/g의 병원성 E. coli를 접종한 후 식품공전 시험법에 따른 선택배지 및 건조필름 시험 분석을 실시한 결과, 양상추의 경우 1, 2 log CFU/g을 접종한 모든 시료에서 증균배양 시험 음성, 3 log CFU/g을 접종한 모든 시료에서 증균배양 시험 양성으로 확인되었고, 건조필름 시험 결과 1, 2, 3 log CFU/g 접종 시료에서 각각 평균 1.4, 2.3, 3.2 log CFU/g이 검출되었다(Table 1).양배추와 어린잎채소의 경우 1, 2, 3 log CFU/g을 접종한 모든 시료에서 증균배양 시험 음성으로 확인되었고, 건조 필름 시험결과 양배추 1, 2, 3 log CFU/g 접종 시료에서 각각 평균 0.
2 log CFU/g이 검출되었다(Table 1).양배추와 어린잎채소의 경우 1, 2, 3 log CFU/g을 접종한 모든 시료에서 증균배양 시험 음성으로 확인되었고, 건조 필름 시험결과 양배추 1, 2, 3 log CFU/g 접종 시료에서 각각 평균 0.8, 1.2, 2.5 log CFU/g이 검출되었으며(Table 2), 어린잎채소 1, 2, 3 log CFU/g 접종 시료에서 각각 평균 1.6, 2.6, 3.4 log CFU/g이 검출되었다(Table 3). 대부분의 시료에서 정량시험은 양성인데 반해 정성시험이 음성인 점을 살펴보았을 때, 신선편이 엽채류 분석에 적합한 병원성 E.
coli로 분석되었다. 이상의 결과를 살펴보았을 때, 생화학동정키트 3종에 대해 병원성 E. coli 의심집락을 동정한 결과 API 20E의 병원성 E. coli 동정률이 가장 높은 것으로 나타났다.
coli로 동정되었다. 즉, 병원성 E. coli 의심집락에 대해 API 20E는 64.7% (22/34), Microgen GNA는 50% (16/32), Food System은 60% (9/15)가 병원성 E. coli로 분석되었다.
coli로 동정되었다. 즉, 병원성 E. coli 의심집락에 대해 API 20E는 65.1% (28/43), Microgen GNA는 62.3% (27/43), Food System은 53.3% (8/15)가 병원성 E. coli로 분석되었다. 이상의 결과를 살펴보았을 때, 생화학동정키트 3종에 대해 병원성 E.

후속연구

4 log CFU/g이 검출되었다(Table 3). 대부분의 시료에서 정량시험은 양성인데 반해 정성시험이 음성인 점을 살펴보았을 때, 신선편이 엽채류 분석에 적합한 병원성 E. coli 정성시험법 개선이 필요할 것으로 사료된다. 신선편이 엽채류 내에서 병원성 E.
coli를 동정하는 분석방법 간의 결과 비교에 대한 연구는 다소 미흡한 것으로 보이며, Barry 등(1979)은 API 20E, Microgen 키트를 이용하여 장내세균과에 대한 생화학적 분석을 실시한 결과 동정결과가 적합하다고 판단한 바 있다¹⁸⁾. 또한, 유전자 분석법에 비해 생화학적 분석법의 동정률이 낮은 것은 생화학적 분석법이 결과 판정에 있어 다소 주관적일 수 있다는 한계 점이 한 요인으로 작용했을 것으로 생각되며 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구의 결과는 신선편이 엽채류의 병원성 E.
또한, 유전자 분석법에 비해 생화학적 분석법의 동정률이 낮은 것은 생화학적 분석법이 결과 판정에 있어 다소 주관적일 수 있다는 한계 점이 한 요인으로 작용했을 것으로 생각되며 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구의 결과는 신선편이 엽채류의 병원성 E. coli 검출에 적합한 시험법 선택을 위한 기초자료로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	신선 농산물의 수요가 증가한 이유는 무엇인가?	최근 간편성과 합리성을 추구하는 소비자가 많아지면서 구입 후 바로 먹거나 조리에 사용할 수 있도록 세척, 박피, 다듬기 과정 등을 거친 신선편이 농산물에 대한 수요가 증가하고 있다1). 신선편이 농산물은 특성상 식중독 세균 제어가 쉽지 않아 국내외적으로 신선 농산물 섭취로 인한 식중독 사고가 지속적으로 발생하고 있다2).
	생식채소류 내 식중독 세균은 무엇이 있는가?	신선편이 농산물은 특성상 식중독 세균 제어가 쉽지 않아 국내외적으로 신선 농산물 섭취로 인한 식중독 사고가 지속적으로 발생하고 있다2). 2015년, 국립농산물품질관리원에서 생식채소류 내 식중독 세균 7 종(E. coli, Enterohemorrhagic E. coli, S. aureus, Salmonella, B. cereus, C. perfringens, L. monocytogenes)에 대한 오염도를 조사한 결과, 12.8% (77/601)의 생식채소류에서 병원성 세균이 검출되었는데 원인 식중독 세균으로는 E.
	식중독 세균 검출을 위한 분석법은 무엇이 있는가?	coli에 대한 관리가 중요하며 이와 함께 정확한 검출방법이 필요하다고 할 수 있다. 현재 식중독 세균 검출을 위한 분석법으로는 선택배지 분리법, 생화학적, 면역학적, 분자생물학적 원리를 이용한 방법이 사용되고 있는데9), 식품공전 시험법의 경우 모든 시료에 대해 동일한 방법으로 일괄 적용하고 있어 농산물 시료의 특성을 고려한 분석이 어려운 실정이다. 농산물에는 많은 양의 background 미생물 균총이 존재하여 소량의 위해 미생물이 함께 존재할 경우 검출이 어렵고10), 또한 농산물은 다른 식품과는 달리 중량당 표면적이 상이하여 이를 고려한 분석이 중요하다고 할 수 있다9).

참고문헌 (18)

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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