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문제 정의
- 이상과 같이, 본 연구에서는 운향과 과실 유래 한약재들이 in vivo GER 및 ITR에 미치는 영향을 비교 검정하였다. 이는 hesperidin, limonin, naringin, poncirin, synephrine 등 공통 성분을 다수 함유하는 이 한약재들 간의 위장관 운동 기능 개선 효과를 in vivo 동물 실험을 통해 직접 비교한 최초의 연구 자료로서 의미를 가진다.
제안 방법
- 이렇게 얻은 추출액들을 여과, 감압 농축, 그리고 동결 건조의 과정을 거쳐 최종적으로 분말 상태의 추출물을 얻었다. 5종의 한약재들 중 지각, 귤핵, 등피는 열수 및 에탄올 추출을 모두 실시하였으며, ITR 측정 실험에서 양성 대조군 투여 약재로 쓰인 지실 및 진피는 열수 추출만 실시하였다. 그 결과, 최종 건중량 28.
- 5% methyl cellulose)의 위 배출 속도(GER)를 측정하는 방법을 사용하였다[6]. DW에 녹인 지각, 귤핵, 등피 추출물을 각각 0.01, 0.1, 1 g/10 ml/kg씩 용량 별로 경구(peroral; p.o.) 투여하였으며, 대조군에는 DW 10 ml/kg을, 양성 대조군에는 DW 에 녹인 metoclopramide 20 mg/10 ml/kg을 각각 경구 투여하였다. 시험 약물 경구 투여 후 30분 경과 시점에서 phenol red meal 1.
- 5 N NaOH 4 ml를 혼합한 후, 분광 광도계(U-3000; Hitachi 社, Tokyo, Japan)를 사용하여 560 nm에서 흡광도(A560)를 측정 하였다. GER 산출을 위해, phenol red 투여 직후 마우스를 안락사시키고 상기 방법에 의해 흡광도(즉, 위 배출 0% 시의 A560)를 측정하였으며, 다음의 식을 활용하여 GER 값을 계산 하였다.
- 동물실은 온도 25±1℃, 습도 55±5%, 조명 시간 7 am-7 pm의 환경 조건을 항상 유지하였으며, 멸균 처리된 사료(동아원㈜, 서울, 대한민국) 및 DW를 실험 동물이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 본 연구에서는 phenol red meal (0.05%, w/w in DW with 1.5% methyl cellulose)의 위 배출 속도(GER)를 측정하는 방법을 사용하였다[6]. DW에 녹인 지각, 귤핵, 등피 추출물을 각각 0.
- 반면, 귤핵 및 등피가 GER 또는 ITR에 미치는 영향에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다. 본 연구에서는, 상기 운향과 과실 유래 한약재들 중 본 연구진에 의해 중점적으로 연구된 바 있는 지실, 진피, 청피 이외의 약재 3종, 즉 지각, 귤핵, 등피에 대하여 열수 및 에탄올 추출물을 제조한 후, in vivo 동물실험을 통해 이들 한약재가 마우스의 GER 및 ITR에 미치는 영향을 비교 검정하였다.
- 이후 즉시 개복하고 소장 전체를 적출하였으며, 장간막을 포함한 소장 주변 조직들을 제거한 후 소장이 늘어나지 않도록 주의하면서 신속하게 소장 전체를 일직선으로 배열하였다. 소장 전체의 길이(유문부-맹장 입구) 및 Evans blue가 이동한 거리를 자로 측정하여 ITR의 지표로 삼았다.
- ) 투여하였으며, 대조군에는 DW 10 ml/kg을, 양성 대조군에는 DW 에 녹인 metoclopramide 20 mg/10 ml/kg을 각각 경구 투여하였다. 시험 약물 경구 투여 후 30분 경과 시점에서 phenol red meal 1.5 ml 경구 투여하였으며, phenol red 투여 15분 후 마우스를 경추탈골하여 안락사시키고 즉시 개복한 다음, 위-식도 접합부 및 유문부를 클램프로 막은 상태로 위를 적출 하여 생리 식염수로 세척하였다. 세척한 위에 0.
- 운향과 과실 유래 한약재들이 장운동에 미치는 효과를 비교하기 위해 in vivo Evans blue 장 이송률 측정 실험을 수행하였다(Table 2). 본 연구진의 이전 연구를 통해 활성이 입증된 바 있는 지실(PFI-W) 및 진피(ANP-W) 열수 추출물 1 g/kg [5, 6, 8]을 양성 대조군에 투여하였으며, 두 양성 대조군 모두 대조군에 비해 ITR이 유의적으로 높았다.
- 에탄올 추출의 경우, 분쇄한 한약재 100 g에 에탄올 500 ml를 가하고 40℃에서 2시간 sonication 후 상온에서 하루 방치하는 방법을 3회 반복하여 추출액을 얻었다. 이렇게 얻은 추출액들을 여과, 감압 농축, 그리고 동결 건조의 과정을 거쳐 최종적으로 분말 상태의 추출물을 얻었다. 5종의 한약재들 중 지각, 귤핵, 등피는 열수 및 에탄올 추출을 모두 실시하였으며, ITR 측정 실험에서 양성 대조군 투여 약재로 쓰인 지실 및 진피는 열수 추출만 실시하였다.
- 1 ml 경구 투여하였으며, Evans blue 투여 후 30분 경과 시점에서 마우스를 경추탈골하여 안락사시켰다. 이후 즉시 개복하고 소장 전체를 적출하였으며, 장간막을 포함한 소장 주변 조직들을 제거한 후 소장이 늘어나지 않도록 주의하면서 신속하게 소장 전체를 일직선으로 배열하였다. 소장 전체의 길이(유문부-맹장 입구) 및 Evans blue가 이동한 거리를 자로 측정하여 ITR의 지표로 삼았다.
- 지각, 귤핵, 등피 추출물이 위 운동성에 미치는 영향을 파악하기 위해 in vivo phenol red 위 배출 속도 측정 실험을 수행하였다(Table 1). 먼저, 양성 대조군(metoclopramide 20 mg/kg, p.
- 본 연구에서는 Evans blue 용액(5%, w/v in DW)의 장 이송 률(ITR)을 측정하는 방법을 사용하였다[8]. 한약재 추출물(또 는 DW) 경구 투여 후 30분 경과 시점에서 Evans blue 0.1 ml 경구 투여하였으며, Evans blue 투여 후 30분 경과 시점에서 마우스를 경추탈골하여 안락사시켰다. 이후 즉시 개복하고 소장 전체를 적출하였으며, 장간막을 포함한 소장 주변 조직들을 제거한 후 소장이 늘어나지 않도록 주의하면서 신속하게 소장 전체를 일직선으로 배열하였다.
대상 데이터
- ㈜샘타코(오산, 대한민국)에서 구입한 수컷 4주령 ICR 마우스를 동의대학교 자연과학대학 내 동물실에서 2주 이상 사육하여 새로운 환경에 충분히 적응시킨 후, 체중 25-30 g의 개체 들을 선별하여 실험에 사용하였다. 동물실은 온도 25±1℃, 습도 55±5%, 조명 시간 7 am-7 pm의 환경 조건을 항상 유지하였으며, 멸균 처리된 사료(동아원㈜, 서울, 대한민국) 및 DW를 실험 동물이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
- 본 연구에 사용된 Evans blue (catalog no. E2129), methylcellulose (M0512), metoclopramide (M0763), phenol red (P3532), 그리고 trichloroacetic acid (T6399)는 모두 SigmaAldrich 社(St. Louise, MO)로부터 구입하였다.
- 본 연구에 사용된 지각(AFI), 귤핵(CUS), 등피(AP), 지실 (PFI), 진피(ANP)는 모두 대한생약제품㈜(부산, 대한민국)에서 구입하였으며, 입자 크기 5 mm미만이 되도록 각 한약재들을 분쇄한 후 열수 및 에탄올 추출을 각각 실시하였다. 열수 추출의 경우, 분쇄한 한약재 100 g에 증류수(distilled water; DW) 1 l를 가한 후 100℃에서 3시간 중탕하는 방법을 3회 반복 하여 추출액을 얻었다.
데이터처리
- 군 간의 유의성 검정은 일원 배치 분산 분석 (one-way ANOVA) 및 Student’s t-test를 통해 이루어졌으며, p<0.05일 때 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 본 연구에서는 Evans blue 용액(5%, w/v in DW)의 장 이송 률(ITR)을 측정하는 방법을 사용하였다[8]. 한약재 추출물(또 는 DW) 경구 투여 후 30분 경과 시점에서 Evans blue 0.
성능/효과
- 5종의 한약재들 중 지각, 귤핵, 등피는 열수 및 에탄올 추출을 모두 실시하였으며, ITR 측정 실험에서 양성 대조군 투여 약재로 쓰인 지실 및 진피는 열수 추출만 실시하였다. 그 결과, 최종 건중량 28.2 g (지각; AFI-W), 23.0 g (귤핵; CUS-W), 35.5 g (등피; AP-W), 31.5 g (지실; PFI-W), 38.3 g (진피; ANP-W)의 열수 추출물 및 20.5 g (지각; AFI-E), 22.1 g (귤핵; CUS-E), 16.9 g (등피; AP-E)의 에탄올 추출물을 각각의 한약재 100 g으로부터 얻을 수 있었다.
- 귤핵 추출물들은 어느 투여 용량에서도 대조군의 ITR과 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 등피의 경우, 열수 추출물(APW)은 어느 용량에서도 대조군과 비교하여 ITR의 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 에탄올 추출물(AP-E)은 100 mg/kg 및 1 g/kg 투여 시 ITR이 대조군에 비해 유의적으로 높았으며 ITR의 용량 의존적 증가 양상이 뚜렷하게 나타났다. 이는 등피 에탄올 추출물의 ITR 증가 효능에 대한 최초의 보고이다.
- 또한, ITR 증가 효과가 이미 보고된 바 있는 지실, 진피, 지각 열수 추출물들과 1 g/kg 투여 시의 ITR을 직접 비교하였을 때에도, 등피 에탄올 추출물이 수치상으로 가장 높은 75.27± 4.17%를 기록하였다(지실 73.19±4.53%, 진피 72.90±4.25%, 지각 71.47±3.81%).
- 지각, 귤핵, 등피 추출물이 위 운동성에 미치는 영향을 파악하기 위해 in vivo phenol red 위 배출 속도 측정 실험을 수행하였다(Table 1). 먼저, 양성 대조군(metoclopramide 20 mg/kg, p.o.)의 GER이 대조군에 비해 유의적으로 높았다. 지각의 경우, 열수 추출물(AFI-W) 1 g/kg 투여 시 대조군보다 GER이 유의적으로 높았으나, 에탄올 추출물(AFI-E)은 어느 용량에서 도 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 모든 군의 실험 결과 수치는 평균±표준 오차(mean±SEM)로 나타내었다.
- 모든 동물 실험은 동의대학교 동물실험윤리위원회의 승인 하에 동 위원 회의 규정을 준수하여 수행되었다(승인 번호: R2014-007). 모든 실험 동물은 in vivo 실험 전 약 20시간 절식시켰으며, DW 는 자유롭게 마실 수 있도록 하였다.
- 운향과 과실 유래 한약재들이 장운동에 미치는 효과를 비교하기 위해 in vivo Evans blue 장 이송률 측정 실험을 수행하였다(Table 2). 본 연구진의 이전 연구를 통해 활성이 입증된 바 있는 지실(PFI-W) 및 진피(ANP-W) 열수 추출물 1 g/kg [5, 6, 8]을 양성 대조군에 투여하였으며, 두 양성 대조군 모두 대조군에 비해 ITR이 유의적으로 높았다. 지각의 경우, GER 실험 결과와 마찬가지로 열수 추출물(AFI-W) 1 g/kg 투여 시 대조군보다 ITR이 유의적으로 높았으나, 에탄올 추출물(AFIE)은 어느 용량에서도 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 본 연구진의 이전 연구를 통해 활성이 입증된 바 있는 지실(PFI-W) 및 진피(ANP-W) 열수 추출물 1 g/kg [5, 6, 8]을 양성 대조군에 투여하였으며, 두 양성 대조군 모두 대조군에 비해 ITR이 유의적으로 높았다. 지각의 경우, GER 실험 결과와 마찬가지로 열수 추출물(AFI-W) 1 g/kg 투여 시 대조군보다 ITR이 유의적으로 높았으나, 에탄올 추출물(AFIE)은 어느 용량에서도 유의적인 차이를 보이지 않았다. 귤핵 추출물들은 어느 투여 용량에서도 대조군의 ITR과 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 지각의 경우, 열수 추출물(AFI-W) 1 g/kg 투여 시 대조군보다 GER이 유의적으로 높았으나, 에탄올 추출물(AFI-E)은 어느 용량에서 도 유의적인 차이를 보이지 않았다. 지각의 열수[2] 및 70% 에탄올[9] 추출물에서 GER을 증가시킨다는 기존의 연구 결과를 고려할 때, 위 배출을 촉진시키는 지각 함유 성분들의 극성 이 에탄올보다는 물과 가까울 것으로 추측된다. 한편, 귤핵 및 등피 추출물들은 어느 투여 용량에서도 대조군과 비교하여 GER의 유의적인 차이를 보이지 않았다.
후속연구
- 이는 hesperidin, limonin, naringin, poncirin, synephrine 등 공통 성분을 다수 함유하는 이 한약재들 간의 위장관 운동 기능 개선 효과를 in vivo 동물 실험을 통해 직접 비교한 최초의 연구 자료로서 의미를 가진다. 특히, 등피의 경우 본 연구를 통해 에탄올 추출물에서의 탁월한 장 이송률 증가 효능을 최초로 보고하였으며, 향후 이 추출물의 위장관 운동 기능 개선 활성에 대한 심화 연구가 수행될 계획이다.
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