[논문]참담치(Mytilus coruscus) 유래 항균 펩타이드 분리 및 정제

오륜경; 이민정; 김영옥; 남보혜; 공희정; 김주원; 안철민; 김동균

doi:10.5352/jls.2016.26.11.1259

참담치(Mytilus coruscus) 유래 항균 펩타이드 분리 및 정제
Isolation and Purification of Antimicrobial Peptide from Hard-shelled Mussel, Mytilus coruscus 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.26 no.11 = no.199, 2016년, pp.1259 - 1268

초록
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항생제 남용의 문제점 및 사용제한에 따른 천연물 유래 항생제 대체제 개발을 위하여 우리나라와 중국, 일본에서만 서식하는 고유종인 참담치의 족부 근육 추출물로부터 항균 펩타이드를 분리 및 정제하였다. $C_{18}$ 역상 컬럼을 사용하여 항균 펩타이드를 정제하였으며, MALDI-TOF/MS로 분석 결과 분자량은 6,701 Da에 해당하였다. edman degradation 방법으로 N-말단 아미노산 서열 분석을 통하여 20개의 아미노산 서열을 밝혔으며 이는 캘리포니아 홍합(Mytilus californianus)의 sperm-specific protein 또는 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 상동성을 지님을 밝혀냈다. 이러한 정보를 바탕으로 ORF를 분석한 결과 60개의 아미노산을 코딩하는 183 bp로 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 아미노산 서열이 100% 일치하였고 유전자 염기서열은 97.2%의 상동성을 나타냈다. 합성된 항균 펩타이드는 그람 양성 균주 Bacillus cereus (MEC, $20.8{\mu}g/ml$), Bacillus subtilis (MEC, $0.2{\mu}g/ml$), Streptococcus mutans (MEC, $0.2{\mu}g/ml$), 그람 음성 균주 Pseudomonas aeruginosa (MEC, $5.7{\mu}g/ml$), Escherichia coli (MEC, $2.6{\mu}g/ml$) 그리고 진균류 Candida albicans (MEC, $56.3{\mu}g/ml$)의 항균활성을 나타냈다. 또한 높은 열안정성을 지녔으며, C. albicans를 제외하고 염안정성을 지닌 항균 펩타이드로 확인되었다. 이를 통해 참담치 유래의 항균 펩타이드는 항생제 대체제의 후보소재로 높은 가능성을 지녔다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서 분리한 참담치 족부 근육 유래 항균 펩타이드는 향후 추가적인 연구를 통하여 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발이 가능할 것으로 사료된다. 그리고 해양무척추동물의 선천성 면역 기작에 대한 정보를 제공할 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we investigated antimicrobial peptide from the acidified muscle extract of Mytilus coruscus, which mostly inhabits China, Japan, and Korea, to develop a natural product-derived antibiotics substitution in terms of its abuse and restriction. Antimicrobial peptide was purified by $C_{18}$ reversed-phase high-performance liquid chromatography and was detected as having a molecular mass of 6,701 Da by MALDI-TOF/MS. The N-terminal amino acid sequence of the purified peak was obtained from edman degradation, and 20 identified residues shown 100% identity with the N-terminus region of sperm-specific protein and protamine-like PL-II/PL-IV precursor of Mytilus californianus. We also identified 60 open-reading frame (ORF) encoding amino acids with 183 bp of purified peptide based on the obtained amino acid residues. The amino acid sequence of ORF showed 100% and the nucleotide sequence revealed 97.2% identity with the protamine-like PL-II/PL-IV precursor of Mytilus californianus. Synthesized antimicrobial peptide showed antimicrobial activity against gram-positive bacteria, including Bacillus cereus (minimal effective concentration [MEC], $20.8{\mu}g/ml$), Bacillus subtilis (MEC, $0.2{\mu}g/ml$), Streptococcus mutans (MEC, $0.2{\mu}g/ml$), gram-negative bacteria including Pseudomonas aeruginosa (MEC, $5.7{\mu}g/ml$), Escherichia coli (MEC, $2.6{\mu}g/ml$) and fungi, Candida albicans (MEC, $56.3{\mu}g/ml$). In addition, synthesized peptide showed stable activities under heat and salt conditions against gram-positive and gram-negative bacteria, but was inhibited by salt against only C. albicans. With these results, isolated peptide from M. coruscus could be an alternative agent to antibiotics for defending against pathogenic microorganisms, and helpful information to understand the innate immune system of marine invertebrates.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 참담치(M. coruscus)의 조직 추출물을 이용해서 항균활성 물질의 탐색 및 정제과정을 수행하고 항균물질의 특성을 분석함으로써 항균 펩타이드의 항생제 대체제와 같은 활용 가능성을 검토하고 해양무척추동물의 선천적 면역 체계에 대해 이해하고자 하였다.

제안 방법

10 μl의 정제된 물질에 trypsin 2 μl (1,000 μg/ml) 를 첨가하고 37℃에서 1시간 반응 시킨 뒤, URDA 법으로 S. mutans에 대한 항균활성의 유무 또는 활력의 변화를 측정하였다.
1% TFA를 첨가하여 사용하였다. 120분 동안 유속 0.2 ml/min으로 5%에서 65%까지 ACN농도를 순차적으로 증가시키면서 분리과정을 수행하였다. 검출기는 다양한 파장을 읽을 수 있는 diode array detector (Dionex, CA, USA)를 이용하였고, peak 중에서 220 nm 파장이 가장 높고, 나머지파장의 변화가 낮은 peak들을 선별하여 URDA로 각각의 항균활성을 확인하였다.
, Ltd, Tokyo, Japan)을 이용한 ACN 농도에 따른 분획들로 분리하여 항균 펩타이드가 존재하는 분획만을 구분하고자 하였다. A 용매는 H₂O (pH 2.2)에 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 포함하고 B 용매는 100% CH₃CN (pH 2.2)에 0.1% TFA를 첨가하여 사용하였다. 분리조건은 60분 동안 1.
Degenerated primer set와 gene specific primer set를 이용하여 확보한 염기서열들을 토대로 protamine-like II/IV precursor의 ORF를 밝혔다. 그리고 이러한 서열을 바탕으로 60개 아미노산으로 이루어진 protamine-like II/IV precursor를 고상합성하였고 다양한 균주에 대한 항균활성을 관찰했다(Fig.
NCBI의 BLAST search에서 확보한 아미노산 서열과 genespecific primer로 증폭시킨 참담치의 nucleotide의 서열을 비교 분석하여 항균 펩타이드의 일차구조를 밝혔으며 이를 바탕으로 고상 화학합성을 하였다. 합성한 항균 펩타이드 분말은 0.
Transcriptor First-Strand cDNA Synthesis kit (Roche,Mannheim, Germany)를 사용하여 first strand cDNA 를 합성하였다. RNA 1 μg, oligo dT primer를 넣고 최종부피가 13 μl이 되게 첨가하여 65℃ 10분 반응시킨 후 얼음에서 2분 반응시켰다.
각 조직 내 protamine-like (PL) 유전자의 발현을 비교·분석하기 위하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative real-time polymerase chain reaction. qPCR) 분석을 실시하였다.
qPCR) 분석을 실시하였다. 각 조직별 cDNA를 100 ng을 주형으로 ABI 7500 Realtime PCR (Applied Biosystems, CA, USA) 으로 중합효소연쇄반응을 수행하여 유전자를 증폭하였고 Ct (cycle threshold)값의 측정․분석을 통해 18s rRNA 발현과 정량 및 비교하여 표준화 하였다.
2 ml/min으로 5%에서 65%까지 ACN농도를 순차적으로 증가시키면서 분리과정을 수행하였다. 검출기는 다양한 파장을 읽을 수 있는 diode array detector (Dionex, CA, USA)를 이용하였고, peak 중에서 220 nm 파장이 가장 높고, 나머지파장의 변화가 낮은 peak들을 선별하여 URDA로 각각의 항균활성을 확인하였다.
조직에 1 ml의 Trizol (Life Technologies, CA, USA)을 처리하여 완전히 용해시킨 뒤 100 μl의 chloroform를 처리하여 상층액을 분리하고 250 μl의 isopropanol을 처리했다. 그리고 상온에서 10분 동안 반응 후 원심분리로 상층액을 제거하고 DEPC가 포함된 에탄올을 처리하여 RNA 만을 순수 정제하였다. 추출한 RNA는 분광광도계를 이용하여 최종적으로 RNA 농도 및 순도를 측정했다.
Degenerated primer set와 gene specific primer set를 이용하여 확보한 염기서열들을 토대로 protamine-like II/IV precursor의 ORF를 밝혔다. 그리고 이러한 서열을 바탕으로 60개 아미노산으로 이루어진 protamine-like II/IV precursor를 고상합성하였고 다양한 균주에 대한 항균활성을 관찰했다(Fig. 4). 합성한 펩타이드는 그람양성 균주인 B.
두 번째 정제과정으로 항균활성을 지닌 분획들을 모아서 TSKgel ODS-80TM C18 reversed-phase column (4.6×150 mm; TOSOH, Tokyo, Japan)을 적용시켜 다음과 같은 조건으로 분리과정을 수행하였다 A 용매는 H2O (pH 2.2)에 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 포함하고 B 용매는 100% CH3CN(pH 2.2)에 0.1% TFA를 첨가하여 사용하였다.
1B). 또한 순수 정제한 시료가 단백질성 항균물질임을 확인하기 위하여 trypsin 처리 전과 후의 항균활성을 비교하였다. URDA 평판을 배양한 결과, trypsin 처리 후에는 분리한 샘플 분획에서 항균활성이 완전히 사라졌음을 관찰하였다(Fig.
반응액에 reaction buffer (5x) 4 μl, dNTP mix 2 μl, Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5 μl, RNase inhibition 0.5 μl을 첨가하여 50℃에서 1시간, 85℃에서 5분, 얼음에서 5분 반응시켜 종료시켰다.
본 연구에서 사용한 URDA 방법은 Table 1의 병원성 균주들에 대한 생장 저해 정도를 관찰하였고 활성 측정법은 다음과 같다. 균주는 최적 생육 배지인 BHI, YM, NB 등 에서 18시간 이상 배양한 뒤 OD₆₀₀=0.
1% TFA를 첨가하여 사용하였다. 분리조건은 60분 동안 1.0 ml/min 유속으로 5%에서 65%까지 ACN농도를 증가시키며 각 분획의 항균활성을 확인하였다. 두 번째 정제과정으로 항균활성을 지닌 분획들을 모아서 TSKgel ODS-80^TM C₁₈ reversed-phase column (4.
샘플을 주입한 뒤 10 ml의 1% type Ⅰ agarose 와 10 mM phosphate buffer (pH 6.5)를 포함하는 over-lay gel을 붓고 굳힌 후 25°C(Candida albicans, Vibrio harveyi), 30°C (Bacillus cereus), 37°C(Bacillus subtilis, Escherichia coli, S. mutans) 에서 18시간 이상 배양한 후 샘플 주위에 생겨난 투명환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다.
01% acetic acid을 섞어 최종 부피 10 μl로 만들어 URDA법으로 평가하였다. 열안정성 평가를 위하여 100℃에서 10분 동안 가열한 뒤 활성의 변화를 측정하였다.
적출한 조직들은 액체질소와 막자사발을 이용하여 파쇄하고, 산 추출법을 통하여 조직 내 펩타이드를 추출하였다. 4배 부피의 1% acetic acid (v/v)을 조직 파쇄물에 첨가하여 100℃에서 5분 끓인 후 충분히 냉각시켰다.
정제된 펩타이드는 0.1% TFA/50% CH3CN (1:1,v/v)에 녹인 후 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix solution (10mg/ml CHCA in 0.1% TFA/50% CH3CN, 1:1,v/v)과 혼합하여 MALDI plate에 도입한 후에 분자량을 측정하였다.
정제된 펩타이드의 분자량은 MALDI-TOF/MS (Ultraflex III matrix-assisted laser desorption Ionization time-of-flight mass spectrophotometer, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)를 사용하여 linear mode로 측정하였다. 정제된 펩타이드는 0.
정제된 항균 물질이 단백질성임을 확인하기 위하여 trypsin 처리 전 후의 항균활성 유무와 변화정도를 측정하였다. 10 μl의 정제된 물질에 trypsin 2 μl (1,000 μg/ml) 를 첨가하고 37℃에서 1시간 반응 시킨 뒤, URDA 법으로 S.
좀 더 다양한 지표균주를 평가해 볼 필요가 있지만 사람과 어병균주에 고르게 항균활성을 보여 다양한의약품과 동물용의약품으로도 활용이 가능할 것으로 사료되었다. 족부 근육 추출물은 항균활성 테스트를 하였을 때 S. mutans에 가장 강한 활성을 보였기 때문에 족부 근육 추출물의 HPLC 분리 분획들에 대한 활성을 S. mutans를 지표균으로 이용하여 URDA를 통하여 측정하였다.
참담치 족부 근육 추출물을 역상 column을 통한 HPLC로 항균물질을 순수 분리 정제하였다. CapCell-Pak C₁₈ column을 이용하여 다양한 분획물을 확인하였고, 각각의 용출된 분획은 URDA법으로 항균활성의 유무와 정도를 측정하였다.
참담치(M. coruscus)로부터 분리한 조직을 파쇄한 뒤 산 추출과정으로 펩타이드 물질을 추출하고 항균활성을 분석하였다. 각각의 추출물들은 그람 음성, 그람 양성 균주와 진균류인 C.
첫 번째 정제과정으로 참담치 족부 근육 유래 acetic acid 추출물은 CapCell-Pak C18 reversed-phase column (5 μm, 120Å, 4.6×250 mm; Shiseido Co., Ltd, Tokyo, Japan)을 이용한 ACN 농도에 따른 분획들로 분리하여 항균 펩타이드가 존재하는 분획만을 구분하고자 하였다.
Trypsin은 대표적인 단백질 분해효소로 정제한 시료의 활성이 완전히 소실된 결과는 추출물이 단백질성 항균물질임을 보여주는 확실한 결과였다. 최종 정제된 물질은 일차구조 분석을 위해 MALDI-TOF/MS 분자량 측정과 edman degradation 과정을 통한 N-말단 서열 분석을 수행하였다.
최종적으로 참담치의 족부 근육 조직으로부터 정제한 펩타이드의 분자량과 아미노산 서열을 조사하기 위하여 MALDITOF mass spectrometer와 edman 분해법을 통한 N 말단 아미노산 서열 분석을 실시했다. 그 결과 MALDI-TOF mass spectrometer을 통해 분자량이 약 6,701 Da이고 정제과정에서 순수하게 분리하였다.
NCBI의 BLAST search에서 확보한 아미노산 서열과 genespecific primer로 증폭시킨 참담치의 nucleotide의 서열을 비교 분석하여 항균 펩타이드의 일차구조를 밝혔으며 이를 바탕으로 고상 화학합성을 하였다. 합성한 항균 펩타이드 분말은 0.01% acetic acid 용액에 충분히 녹인 뒤 항균활성을 검증하였다.
항균 펩타이드의 염농도에 대한 안정성 확인을 위해 0.01% acetic acid으로 녹인 샘플에 최종적으로 NaCl 농도가 0.5%, 1% 그리고 2%가 되도록 첨가한 뒤 0.01% acetic acid을 섞어 최종 부피 10 μl로 만들어 URDA법으로 평가하였다.
현재 확보한 염기서열과 5', 3'-RACE PCR을 통하여 UTR 부분 분석과 재조합 단백질의 제작 및 대량 생산을 통해서 특성 분석을 진행하고 있다.
확보한 항균 펩타이드의 nucleotide 서열을 바탕으로 degenerated primer와 gene-specific primer pair를 제작하여 항균 펩타이드의 open reading frame (ORF)을 증폭한 뒤 염기서열을 분석하여 유전자 정보를 확보하였고, NCBI의 GenBank database 내의 알려진 펩타이드와의 서열을 비교 · 분석하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용한 참담치의 경우 부산 자갈치 공동어시장에서 구입하여, 패각근, 혈액, 아가미, 간췌장, 족부 근육 등을 적출하였으며, 적출 후 모든 장기는 항균 펩타이드를 추출하기 전까지 -80℃에서 급속 냉각하여 보관하였다.
항균 펩타이드 추출과 정제에 사용된 acetic acid, trifluoroacetic acid(TFA), water 그리고 acetonitrile (ACN)은 모두 Berdic&Jackson사(B&D, USA)로부터 구입하였고 그 외의 모든 실험에 사용된 시약 및 재료는 특급을 사용하였다.
항균활성 측정에 사용되는 미생물배지는 모두 Difco사(Difco, USA)의 배지를 사용하였고, low melting agarose는 Bio-Rad사(Bio-Rad, USA)의 제품을 사용하였다. 항균 펩타이드 추출과 정제에 사용된 acetic acid, trifluoroacetic acid(TFA), water 그리고 acetonitrile (ACN)은 모두 Berdic&Jackson사(B&D, USA)로부터 구입하였고 그 외의 모든 실험에 사용된 시약 및 재료는 특급을 사용하였다.
항균활성 측정에 사용된 그람양성, 그람음성, 그리고 진균류의 지표 균주들은 생물자원센터(KCTC), 한국종균협회(KCCM)에서 분양받았으며 각각의 균주들은 최적 온도와 배지에서 배양하였다(Table 1).
확보한 N말단 잔기를 통하여 NCBI의 BLAST search(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)를 실시하였고, 그 중 유사도가 가장 높은 펩타이드를 선별하였다. 확보한 항균 펩타이드의 nucleotide 서열을 바탕으로 degenerated primer와 gene-specific primer pair를 제작하여 항균 펩타이드의 open reading frame (ORF)을 증폭한 뒤 염기서열을 분석하여 유전자 정보를 확보하였고, NCBI의 GenBank database 내의 알려진 펩타이드와의 서열을 비교 · 분석하였다.

이론/모형

B. subtilis, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa, S. mutans 그리고 C. albicans를 각각의 최적 배양온도에서 배양 후 합성한 펩타이드의 항균활성을 확인하기 위해 URDA 방법의 지표균으로 사용하였다. 항균 펩타이드의 염농도에 대한 안정성 확인을 위해 0.
참담치 족부 근육 추출물을 역상 column을 통한 HPLC로 항균물질을 순수 분리 정제하였다. CapCell-Pak C₁₈ column을 이용하여 다양한 분획물을 확인하였고, 각각의 용출된 분획은 URDA법으로 항균활성의 유무와 정도를 측정하였다. 그 결과, 약 26분에 용출된 분획에서 매우 높은 항균활성을 관찰할 수 있었으며, 약 6.
N-말단의 부분적인 일차구조는 edman 분해법을 통해(A-K-A-K-R-S-P-R-K-K-K-A-A-V-K-K-S-S-K-S) 20개의 아미노산을 우선 밝혔다. 밝혀낸 20개의 N-말단 서열을 NCBI의 GenBank database blast 검색한 결과 캘리포니아 홍합(M.
참담치 족부 근육 추출물의 항균물질 분리 및 순수 정제과정은 HPLC (DIONEX UltiMate 3000 HPLC system, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) 를 이용하여 2종류 역상 column을 사용하여 수행되었고, 각 분획들에 대한 항균활성은 Streptococcus mutans에 대한 ultrasensitive radial diffusion assay (URDA)법을 이용하였다[15].

성능/효과

2). N말단의 20개 아미노산 서열과 동일했던 캘리포니아 홍합의 sperm-specific Phi-3 protein는 45개의 아미노산을 코딩하고 있는 펩타이드로 본 연구의 항균 펩타이드의 60개 보다는 사이즈가 작았고 총 45개의 아미노산 서열 중 39번째, 41번째, 42번째의 3개의 아미노산 서열이 일치하지 않았다. 그리고 분리한 183 bp의 참담치 protaminelike 유전자 염기서열을 분석한 결과 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 97.
mutans에 가장 민감한 항균활성을 보였다(Table 3). S. mutans에 높은 항균 활성을 나타내는 결과는 조직에서 추출한 natural form의 항균 펩타이드와 동일한 항균활성 결과를 알 수 있었다. 또한 다양한 참담치류에서 발견되는 항균 펩타이드로 다양한 균에 항균활성을 보이나 특히 그람양성 균주에 더욱 민감도가 높다는 공통된 특성을 확인 할 수 있었으며 그람양성 균주 중에서 B.
1B). Trypsin은 대표적인 단백질 분해효소로 정제한 시료의 활성이 완전히 소실된 결과는 추출물이 단백질성 항균물질임을 보여주는 확실한 결과였다. 최종 정제된 물질은 일차구조 분석을 위해 MALDI-TOF/MS 분자량 측정과 edman degradation 과정을 통한 N-말단 서열 분석을 수행하였다.
또한 순수 정제한 시료가 단백질성 항균물질임을 확인하기 위하여 trypsin 처리 전과 후의 항균활성을 비교하였다. URDA 평판을 배양한 결과, trypsin 처리 후에는 분리한 샘플 분획에서 항균활성이 완전히 사라졌음을 관찰하였다(Fig. 1B). Trypsin은 대표적인 단백질 분해효소로 정제한 시료의 활성이 완전히 소실된 결과는 추출물이 단백질성 항균물질임을 보여주는 확실한 결과였다.
coruscus)로부터 분리한 조직을 파쇄한 뒤 산 추출과정으로 펩타이드 물질을 추출하고 항균활성을 분석하였다. 각각의 추출물들은 그람 음성, 그람 양성 균주와 진균류인 C. albicans에 다양한 항균활성을 보였으며, 특히 족부 근육 추출물이 병원성 균주들에 대한 가장 큰 항균활성을 나타내었다(Table 2). 족부 근육 추출물은 그람양성 균주인 B.
최종적으로 참담치의 족부 근육 조직으로부터 정제한 펩타이드의 분자량과 아미노산 서열을 조사하기 위하여 MALDITOF mass spectrometer와 edman 분해법을 통한 N 말단 아미노산 서열 분석을 실시했다. 그 결과 MALDI-TOF mass spectrometer을 통해 분자량이 약 6,701 Da이고 정제과정에서 순수하게 분리하였다.
CapCell-Pak C₁₈ column을 이용하여 다양한 분획물을 확인하였고, 각각의 용출된 분획은 URDA법으로 항균활성의 유무와 정도를 측정하였다. 그 결과, 약 26분에 용출된 분획에서 매우 높은 항균활성을 관찰할 수 있었으며, 약 6.5 mm 직경의 투명환을 기록하였다(Fig. 1A). 이를 TSK-gel ODS-80^TM C₁₈ column으로 한번 더 정제한 결과 약 34.
다양한 농도별로 각 균에 대한 항균활성을 확인하였고 활성의 정도를 최소유효농도(minimal effective concentration, MEC)로 나타내었다(Table 3). 그람양성 균주인 B. subtilis와 S. mutans에 가장 민감한 항균활성을 보였다(Table 3). S.
Protamine-like 단백질류의 보고된 주요기능을 고찰해 봤을 때 생식소가 포함된 간 췌장보다 근육과 아가미에서 발현이 높은 것은 상당히 흥미로운 결과였으며, 이매패류의 항균 펩타이드 관련 연구 중 굴에서 분리된 선천성 면역 요소인 defensin, molluscidin의 경우에도 아가미 조직에서 가장 발현이 높게 나타나는 것으로 밝혀졌다[29, 31]. 그리고 본 연구의 항균물질 또한 족부 근육 다음으로 아가미에서 발현이 높게 나타나는 경향을 보였으며 이는 참담치 각 조직 마다 항균 물질을 축적하고 있음을 짐작할 수 있었다.
N말단의 20개 아미노산 서열과 동일했던 캘리포니아 홍합의 sperm-specific Phi-3 protein는 45개의 아미노산을 코딩하고 있는 펩타이드로 본 연구의 항균 펩타이드의 60개 보다는 사이즈가 작았고 총 45개의 아미노산 서열 중 39번째, 41번째, 42번째의 3개의 아미노산 서열이 일치하지 않았다. 그리고 분리한 183 bp의 참담치 protaminelike 유전자 염기서열을 분석한 결과 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 97.2%, 태평양푸른담치의 histone h1-like protein과 86.3% 일치하였으며 아미노산의 높은 상동성과 다르게 염기서열의 유사도는 감소하는 결과를 알 수 있었다(Fig. 3). 또한 이러한 유전자의 특성을 규명하기 위해서 5’, 3’ UTR, domain, isoform 분석 등이 진행 중에 있으며 이는 종간의 protamine-like protein의 특성에 대한 이해를 증대시킬 수 있는 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
4). 다양한 농도별로 각 균에 대한 항균활성을 확인하였고 활성의 정도를 최소유효농도(minimal effective concentration, MEC)로 나타내었다(Table 3). 그람양성 균주인 B.
본 연구 결과 참담치 각 조직들에는 다른 해양무척추 동물과 같이 다양한 항균 물질들이 존재하는 것으로 확인되었으며, 족부 근육 추출물에서 분리한 단백질성 항균물질의 항균 활성 및 특징을 평가하였다. 다양한 연구결과 및 특성들도 다른 해양동물의 항균 펩타이드와 유사한 일반적인 경향을 지니면서도 신규한 특성을 지니는 것을 알 수 있었다. 현재 확보한 염기서열과 5', 3'-RACE PCR을 통하여 UTR 부분 분석과 재조합 단백질의 제작 및 대량 생산을 통해서 특성 분석을 진행하고 있다.
따라서 이러한 넓은 항균활성 범위와 높은 열안정성과 염안정성을 고려한다면 본 연구에서 확보한 참담치 유래의 항균펩타이드는 충분히 안정적인 역할을 할 것으로 사료되며 수산용 항생제 대체제의 후보소재로 높은 가능성을 기대할 수 있었다.
mutans에 높은 항균 활성을 나타내는 결과는 조직에서 추출한 natural form의 항균 펩타이드와 동일한 항균활성 결과를 알 수 있었다. 또한 다양한 참담치류에서 발견되는 항균 펩타이드로 다양한 균에 항균활성을 보이나 특히 그람양성 균주에 더욱 민감도가 높다는 공통된 특성을 확인 할 수 있었으며 그람양성 균주 중에서 B. cereus에만 활성이 낮은 독특한 특징을 발견할 수 있었다.
californicanus)의 sperm-specific protein과 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 동일한 일차구조 상동성을 보였다. 또한 이러한 정보를 기반으로 제작된 primer들을 이용하여 ORF를 분석한 결과 183 bp로 60개의 아미노산을 코딩하고 있었다(Fig. 2). 밝혀진 60개의 아미노산 서열을 NCBI Gen Bank Database에서 검색한 결과 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 일치하였다.
또한 확보한 아미노산 서열을 다양한 항균 펩타이드들의 정보만을 모아놓은 Antimicrobial peptide database (http://aps.unmc.edu)에서 N-말단의 부분적인 일차구조를 검색해 본 결과 약 40% 이하의 유사도들을 가진 항균 펩타이드들이 존재하였으며 그 중 가문비나무속에 속하는 시트가 가문비(Picea sitchenis)의 Piceain 1과 39.13%로 매우 낮은 유사도를 보였다[17]. 이러한 결과를 통하여 본 연구에서 분리한 펩타이드는 신규 항균 펩타이드일 가능성이 높을 것으로 평가하였다.
N-말단의 부분적인 일차구조는 edman 분해법을 통해(A-K-A-K-R-S-P-R-K-K-K-A-A-V-K-K-S-S-K-S) 20개의 아미노산을 우선 밝혔다. 밝혀낸 20개의 N-말단 서열을 NCBI의 GenBank database blast 검색한 결과 캘리포니아 홍합(M. californicanus)의 sperm-specific protein과 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 동일한 일차구조 상동성을 보였다. 또한 이러한 정보를 기반으로 제작된 primer들을 이용하여 ORF를 분석한 결과 183 bp로 60개의 아미노산을 코딩하고 있었다(Fig.
2). 밝혀진 60개의 아미노산 서열을 NCBI Gen Bank Database에서 검색한 결과 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 일치하였다. 홍합의 다른 종들과 아미노산 서열을 비교한 결과 태평양푸른담치(M.
본 연구 결과 참담치 각 조직들에는 다른 해양무척추 동물과 같이 다양한 항균 물질들이 존재하는 것으로 확인되었으며, 족부 근육 추출물에서 분리한 단백질성 항균물질의 항균 활성 및 특징을 평가하였다. 다양한 연구결과 및 특성들도 다른 해양동물의 항균 펩타이드와 유사한 일반적인 경향을 지니면서도 신규한 특성을 지니는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서 밝혀진 일차구조를 바탕으로 합성한 60개의 합성 펩타이드는 100℃에서 10분 가열 후 항균활성의 변화가 없는 높은 열안정성을 보였으며, 일반적으로 알려진 육상 생물 유래의 항균 펩타이드가 NaCl에 의하여 활성이 저해받는 것과는 달리 해양생물 유래 항균 펩타이드의 특징인 NaCl에 의하여 활성이 2%까지 저해 받지 않음을 알 수 있었다(Fig. 4). 그러나 독특하게도 C.
13%로 매우 낮은 유사도를 보였다[17]. 이러한 결과를 통하여 본 연구에서 분리한 펩타이드는 신규 항균 펩타이드일 가능성이 높을 것으로 평가하였다.
1A). 이를 TSK-gel ODS-80^TM C₁₈ column으로 한번 더 정제한 결과 약 34.5분에서 순수한 하나의 분획을 회수할 수 있었으며, URDA를 통하여 약 8.8 mm 직경의 투명환을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 또한 순수 정제한 시료가 단백질성 항균물질임을 확인하기 위하여 trypsin 처리 전과 후의 항균활성을 비교하였다.
albicans에 다양한 항균활성을 보였으며, 특히 족부 근육 추출물이 병원성 균주들에 대한 가장 큰 항균활성을 나타내었다(Table 2). 족부 근육 추출물은 그람양성 균주인 B. subtilis, S. aureus, S. mutans에 대하여 강한 활성을 나타내었고, 그람음성균주인 E. cloacae, E. coli, K. pneumoniaei, P. aeruginosa에서 항균활성을 나타내었으나 V. alginolyticus, V. harveyi에서는 활성을 나타내지 않았다. 또한 진균류인 C.
참담치로부터 분리한 각 장기 조직들로부터 mRNA 수준에서의 발현을 정량적 실시간 연쇄중합반응으로 분석한 결과, 항균 펩타이드의 발현은 족부 근육에서 가장 높았으며 아가미, 패각근, 생식소 및 내장을 포함하는 간췌장, 그리고 혈액 순으로 발현이 높았다(Fig. 5). Protamine-like 단백질류의 보고된 주요기능을 고찰해 봤을 때 생식소가 포함된 간 췌장보다 근육과 아가미에서 발현이 높은 것은 상당히 흥미로운 결과였으며, 이매패류의 항균 펩타이드 관련 연구 중 굴에서 분리된 선천성 면역 요소인 defensin, molluscidin의 경우에도 아가미 조직에서 가장 발현이 높게 나타나는 것으로 밝혀졌다[29, 31].
4). 합성한 펩타이드는 그람양성 균주인 B. cereus, B. subtilis, S. mutans, 그람음성 균주인 P. aeruginosa, E. coli에 그리고 진규류인 C. albicans에도 항균활성을 나타내었다(Fig. 4). 다양한 농도별로 각 균에 대한 항균활성을 확인하였고 활성의 정도를 최소유효농도(minimal effective concentration, MEC)로 나타내었다(Table 3).
밝혀진 60개의 아미노산 서열을 NCBI Gen Bank Database에서 검색한 결과 캘리포니아 홍합의 protamine-like PL-II/PL-IV precursor와 100% 일치하였다. 홍합의 다른 종들과 아미노산 서열을 비교한 결과 태평양푸른담치(M. trossulus)의 sperm-specific PHI-2B/PHI-3 protein과 91.6%, 캘리포니아 홍합의 sperm-specific Phi-3 protein과 70% 일치하였다(Fig. 2). N말단의 20개 아미노산 서열과 동일했던 캘리포니아 홍합의 sperm-specific Phi-3 protein는 45개의 아미노산을 코딩하고 있는 펩타이드로 본 연구의 항균 펩타이드의 60개 보다는 사이즈가 작았고 총 45개의 아미노산 서열 중 39번째, 41번째, 42번째의 3개의 아미노산 서열이 일치하지 않았다.

후속연구

현재 확보한 염기서열과 5', 3'-RACE PCR을 통하여 UTR 부분 분석과 재조합 단백질의 제작 및 대량 생산을 통해서 특성 분석을 진행하고 있다. 그리고 아미노산의 일차구조 분석을 통한 항균활성이 더욱 높고 다양한 병원균에 대해 항균활성을 지니는 일부잔기가 변형 또는 치환된 다양한 유도체 후보들을 제작 중에 있으며 항암, 항산화, 항충 등 다양한 기능을 지닌 항균 펩타이드로서 평가 및 연구를 진행할 예정이다. 이에 따라 항균 펩타이드의 작용기작 연구를 통해 활용성을 평가하고 나아가 해양무척추동물의 면역 시스템 연구를 수행할 계획이다.
이에 따라 항균 펩타이드의 작용기작 연구를 통해 활용성을 평가하고 나아가 해양무척추동물의 면역 시스템 연구를 수행할 계획이다. 그리고 항생제 대체제를 위한 항균 펩타이드 개발을 위해 생산 기술과 분리정제 기술의 연구 및 개발이 진행될 것이며 이는 경제적으로 수산용 항생제 대체제 생산과 산업화를 진행할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 추후 연구를 통해서 해양 무척추동물의 선천성 면역 기작과 항생제 대체 물질 개발에 많은 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
또한 이러한 유전자의 특성을 규명하기 위해서 5’, 3’ UTR, domain, isoform 분석 등이 진행 중에 있으며 이는 종간의 protamine-like protein의 특성에 대한 이해를 증대시킬 수 있는 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
또한 캘리포니아 홍합의 sperm 생성과 관련있는 protamine-like protein의 연구는 활발히 이뤄졌지만 참담치의 protamine-like protein의 연구는 아직 보고되어진 바가 없다[3]. 또한 참담치의 생식소를 포함하는 내장 조직이 아닌 족부 근육에서 발견되었다는 점에서 특이하다고 할 수 있으며, 따라서 신규 또는 다기능성 항균 펩타이드 가능성이 높을 것으로 판단되며 추가적인 연구를 통해서 무척추생물의 면역 시스템과 관련한 다양한 자료를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
그리고 항생제 대체제를 위한 항균 펩타이드 개발을 위해 생산 기술과 분리정제 기술의 연구 및 개발이 진행될 것이며 이는 경제적으로 수산용 항생제 대체제 생산과 산업화를 진행할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 추후 연구를 통해서 해양 무척추동물의 선천성 면역 기작과 항생제 대체 물질 개발에 많은 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
4). 이는 일반 미생물과 달리 진균류에 대해서 다른 기작을 통해 항균활성을 보이거나 진균류의 구조적 차이로 인한 것으로 예상되며 추후 이러한 기작의 연구는 항균 펩타이드의 다양한 기능 연구와 진균류에 대한 항생제 대체제 개발에 중요한 정보를 제공할 것으로 사료된다.
그리고 아미노산의 일차구조 분석을 통한 항균활성이 더욱 높고 다양한 병원균에 대해 항균활성을 지니는 일부잔기가 변형 또는 치환된 다양한 유도체 후보들을 제작 중에 있으며 항암, 항산화, 항충 등 다양한 기능을 지닌 항균 펩타이드로서 평가 및 연구를 진행할 예정이다. 이에 따라 항균 펩타이드의 작용기작 연구를 통해 활용성을 평가하고 나아가 해양무척추동물의 면역 시스템 연구를 수행할 계획이다. 그리고 항생제 대체제를 위한 항균 펩타이드 개발을 위해 생산 기술과 분리정제 기술의 연구 및 개발이 진행될 것이며 이는 경제적으로 수산용 항생제 대체제 생산과 산업화를 진행할 수 있을 것으로 사료된다.
이와 같이 다양한 항균활성 범위는 현재까지 보고 되어진 참담치에서 분리한 항균 펩타이드 mytichitin, myticusin와 같이 그람양성 균주에 강한 활성이 보이는 유사한 양상을 보였으며, 조직 추출물 내 존재하는 항균 물질을 단일 성분으로 순수 분리 정제하여 정확한 활성을 비교해볼 필요가 있었다[25]. 좀 더 다양한 지표균주를 평가해 볼 필요가 있지만 사람과 어병균주에 고르게 항균활성을 보여 다양한의약품과 동물용의약품으로도 활용이 가능할 것으로 사료되었다. 족부 근육 추출물은 항균활성 테스트를 하였을 때 S.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	참담치의 외형적 형태는?	coruscus)는 홍합, 섭조개, 담채 또는 열합 등의 이름을 가지고 있으며, 다른 홍합류와는 다르게 한국, 중국, 일본에서만 서식하고 양식이 어려워 해녀 또는 잠수부가 채취하는 물량에 의존하고 있는 중요 패류종이다[37]. 패각은 오각형에 가깝고 각질은 홍합류 중 가장 단단하며, 표면은 흑색으로 광택이 있고, 조간대 또는 수심 20 m 내외의 암초에 부착하여 살아간다[37]. 또한 한국, 중국, 일본에서 다 같이 식용으로 소비되고 있는 중요 패류이나 특히 한국과 중국에서 매우 귀한 식품으로 여겨지고 있다[37].
	항균 펩타이드란?	항균 펩타이드는 약 12~100개 정도의 아미노산으로 이뤄지며, 아미노산 서열 내에서 양전하를 띄는 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine) 등의 아미노산 잔기를 많이 포함하는 저분자의 단백질성 물질이다[38]. 미생물 뿐만 아니라 무척추동물과 척추동물에도 존재하며 생물체로부터 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 진균류, 바이러스 등에 이르는 넓은 범위의 미생물에 대해서 항균활성이 보고되어 있다[6, 11].
	항균 펩타이드의 구조적 특성은?	미생물 뿐만 아니라 무척추동물과 척추동물에도 존재하며 생물체로부터 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 진균류, 바이러스 등에 이르는 넓은 범위의 미생물에 대해서 항균활성이 보고되어 있다[6, 11]. 다양한 생물에서 발견되는 항균 펩타이드는 α-helix, βsheet 또는 random coil 구조를 가지고 이러한 구조는 대부분 친수성과 소수성을 동시에 지닌 양친매성의 특성을 지닌다[32, 39]. 보고된 항균 펩타이드들은 구조와 활성의 일반적 경향성이 알려졌지만 아미노산의 서열과 구조, 그리고 활성에 대한 유사성 또는 일관성을 명확하게 규정하기엔 많은 연구가 필요하다[5].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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