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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 곤충의 면역반응에 의해 생성되는 항균 펩타이드를 새로운 천연 항생제 개발를 위한 소재로 활용할 목적으로 면역 유도된 천잠(Antheraea yamamai) 유충 혈림프에서 처음으로 세크로핀류 항균 펩타이드를 분리하여 다양한 병원성 세균에 대한 항균활성을 검정하였다.
- 세크로핀(cecropin)은 곤충의 체액성 면역에 있어서 효과적인 방어인자로 작용하는 항균 펩타이드로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 면역 유도된 천잠, Antheraea yamamai 유충 혈림프로부터 세크로핀 항균 펩타이드 분리 및 정제를 실시하였다. 먼저 항균 펩타이드를 분리하기 위해서, 면역 유도된 유충 및 정상 유충으로부터 추출된 혈림프 단백질 시료에 대한 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 통하여 비교분석하였다.
제안 방법
- 96-well microplate의 각 well에 90 µl의 세균 배양액 (2×106 CFU/ml)을 분주 한 후, 단계적으로 희석된 항균 펩타이드 용액들을 각 well당 10 µl씩 첨가한 다음 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 분광 광도계(600 nm)에서 흡광도를 측정하여 MIC를 결정하였다.
- LPS 면역 유도된 천잠 혈림프 단백질 추출 시료로부터 양이온 교환 크로마토그래피 및 Superdex peptide 컬럼을 이용한 액상 크로마토그래피(FPLC)을 사용하여 세크로핀 항균펩타이드를 순수 정제하였다(Fig. 3). 일반적으로 세크로핀을 포함한 곤충 항균펩타이드 대부분은 양전하를 뛰고 있어 음전하를 가지는 세포막 지질에 쉽게 결합하는 특성이 있다(Hoffman et al.
- 혼합액은 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 회수한 다음 ultra-filtration으로 저분자 단백질(20 kDa cut off)을 분리하여 SDS-peptide 전기영동 분석에 사용하였다. 단백질 전기영동 후, gel은 시각화를 위해 0.1% Coomassie Brilliant Blue G250으로 염색 및 탈색 한 다음 gel 이미지 비교 분석을 통하여 면역 유도된 혈림프 시료에 특이적으로 발현되는 펩타이드 밴드를 분리하였다. 이후 분리된 펩타이드 밴드는 4700 proteomics Analyzer(Applied Biosystems)를 이용한 MALDI-TOF MS 분석을 통하여 질량을 측정하였다.
- 2004). 따라서 본 연구에서 세크로핀 항균 펩타이드을 양이온 교환 크로마토그래피 방법을 이용하여 손쉽게 정제하였다 (Fig. 3A). 즉, 0.
- 3B). 또한 용출된 분획은 단백질 전기영동 분석 및 항균활성 검정을 통하여 확인하였다(Fig. 3C). SDS-PAGE 분석 결과, 분획 32, 33, 34, 35에서 약 4 kDa의 항균 펩타이드 밴드를 확인하였으며, 또한 이들 분획은 대장균에 대한 RDA 분석에서 항균활성을 나타냈었다.
- 96-well microplate의 각 well에 90 µl의 세균 배양액 (2×106 CFU/ml)을 분주 한 후, 단계적으로 희석된 항균 펩타이드 용액들을 각 well당 10 µl씩 첨가한 다음 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 분광 광도계(600 nm)에서 흡광도를 측정하여 MIC를 결정하였다. 또한 용출된 재조합 항균 펩타이드 분획들은 RDA 분석으로 병원성 대장균(E. coli ML35)에 대한 항균활성을 검정하였다. 멸균된 RDA용 underlay gel(9mM sodium phosphate, 1mM sodium citrate, pH7.
- 본 연구에서는 면역 유도된 천잠, Antheraea yamamai 유충 혈림프로부터 세크로핀 항균 펩타이드 분리 및 정제를 실시하였다. 먼저 항균 펩타이드를 분리하기 위해서, 면역 유도된 유충 및 정상 유충으로부터 추출된 혈림프 단백질 시료에 대한 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 통하여 비교분석하였다. 정상누에 혈림프 시료에 비해 면역 유도된 혈림프 추출물에서만 특이적으로 발현되는 분자량 4,223.
- 면역 유도된 천잠 유충 및 무처리 정상 유충으로부터 혈림프를 채취하여 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 그 상등액을 -20℃에 보관 한 다음 단백질 추출에 사용하였다. 보관된 혈림프 시료를 동일한 양의 1% 아세트산 용액과 진탕, 혼합한 다음 실온에서 2시간 교반을 통하여 단백질을 추출하였다. 혼합액은 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 회수한 다음 ultra-filtration으로 저분자 단백질(20 kDa cut off)을 분리하여 SDS-peptide 전기영동 분석에 사용하였다.
- 본 연구에서는 천잠 유래 항균 펩타이드를 분리하기 위해서 5령 유충 체강에 박테리아 세포막 성분인 LPS를 주사하여 선천성 면역 반응을 유도한 다음 정상 유충의 혈림프 시료와 SDS-PAGE 겔 이미지 비교분석 및 항균활성 비교분석 실시하였다(Fig. 1). 단백질 전기영동 분석 결과, 면역 유도된 혈림프 단백질 추출 시료에서만 특이적으로 발현되는 후보 항균 펩타이드(AMCP) 1종을 확인하였으며 그 분자량은 약 4kDa으로 측정되었다(Fig.
- 01 Da의 펩타이드 밴드를 검출하였다. 선발된 면역 유도 특이적 발현 펩타이드의 특성 분석을 위해서 이온 교환 크로마토그래피 및 gel permeation 크래마토그래피을 수행하여 특이적으로 발현되는 펩타이드를 성공적으로 순수 정제하였다. 정제된 펩타이드는 Edman degradation 법으로 N말단 아미노산 서열을 결정하였고 다른 나비목 곤충의 세크로핀과 매우 높은 상동성을 나타내어 세크로핀으로 동정하였다.
- 5% SDS-Peptide 전기영동을 통하여 그 정제도 및 분자량을 분석하였다. 순수 분리 정제된 세크로핀 항균 펩타이드는 Applied Biosystem Procise Sequencer를 사용한 Edman degradation법으로 N말단 아미노산 서열을 결정한 다음 BLAST 상동성 분석을 통하여 동정하였다.
- 이후 Hitrap SP HP 컬럼을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 세크로핀 항균 펩타이드를 정제하였다. 용출된 단백질 분획은 16.5% SDS-peptide 전기영동 및 방사선 확산 분석(Radial Diffusion Assay : RDA)을 이용한 항균활성 검정을 통하여 확인하였다. 항균 펩타이드가 포함된 분획은 다시 Superdex Peptide 컬럼을 이용한 액상 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 순수 정제하였고, 16.
- 3% 아세트산 용액에서 세크로핀을 음전하를 뛰는 담체에 결합시킨 후 1M 염화나트륨을 사용하여 결합된 단백질을 점차적으로 용출하여 분획하였다. 용출된 단백질 분획은 단백질 전기영동 및 항균활성검정을 통하여 세크로핀이 포함된 분획을 선별하였다. 회수한 분획을 냉동건조로 농축한 다음 염 및 기타 단백질을 제거하기 위해 Superdex peptide 컬럼으로 gel filtration 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하였다(Fig.
- 3% 아세트산에 용해시킨 후, 14,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 수거하였다. 이후 Hitrap SP HP 컬럼을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 세크로핀 항균 펩타이드를 정제하였다. 용출된 단백질 분획은 16.
- 언더레이 겔에 지름 3 mm의 구멍을 내어 시료를 10 µl씩 구멍에 넣었고, 펩타이드가 확산되도록 37℃에서 3시간 배양한 후, 그 위에 RDA용 overlay gel(6% TSB, 1% low electroendosmosis agarose)을 부어 굳힌 다음 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 clear zone의 크기를 측정하여 항균 활성을 비교하였다.
- 1% Coomassie Brilliant Blue G250으로 염색 및 탈색 한 다음 gel 이미지 비교 분석을 통하여 면역 유도된 혈림프 시료에 특이적으로 발현되는 펩타이드 밴드를 분리하였다. 이후 분리된 펩타이드 밴드는 4700 proteomics Analyzer(Applied Biosystems)를 이용한 MALDI-TOF MS 분석을 통하여 질량을 측정하였다.
- SDS-PAGE 분석 결과, 분획 32, 33, 34, 35에서 약 4 kDa의 항균 펩타이드 밴드를 확인하였으며, 또한 이들 분획은 대장균에 대한 RDA 분석에서 항균활성을 나타냈었다. 정제된 세크로핀은 Applied Biosystem Procise Sequencer를 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 분석한 N-말단 아미노산 서열은 KWKFFKKIERVG이였고 누에를 포함한 나비목 곤충의 Cecropin A 항균 펩타이드의 N-말단 아미노산 서열과 약 80% 이상의 높은 상동성을 나타냈었다(Fig.
-
4. 천잠 세크로핀 항균 활성 검정
정제된 천잠 세크로핀 및 대조구로 사용한 호랑나비 유래 파필리오신 과 멜리틴의 항균 활성은 병원균에 대한 최저성장저해농도(MIC: minimum inhibitory concentration)를 측정하여 검정하였다. 항균 활성 분석에 사용한 그람음성세균 Escherichia coli ML35, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 그람양성세균 Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus들은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth, Difco, USA) 액체 배지에서 37℃, 200 rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4 × 106 CFU/ml 농도가 되도록 2시간 30분간 2차 배양하였다.
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3. 천잠 세크로핀 항균 펩타이드 항균 활성 검정
정제된 천잠 세크로핀의 항균 활성은 최소생장억제농도(MIC) 측정을 통하여 검정하였다(Table. 1). 천잠 세크로 핀은 그람음성세균 E.
- 3A). 즉, 0.3% 아세트산 용액에서 세크로핀을 음전하를 뛰는 담체에 결합시킨 후 1M 염화나트륨을 사용하여 결합된 단백질을 점차적으로 용출하여 분획하였다. 용출된 단백질 분획은 단백질 전기영동 및 항균활성검정을 통하여 세크로핀이 포함된 분획을 선별하였다.
- 천잠(A. yamami) 유충으로부터 세크로핀 항균 펩타이드를 분리하기 위하여 종령 유충에 박테리아 막 성분인 lipopolysaccharide(LPS, sigma)를 주사하여 면역화 하였다. 즉, 50 - 100 ul의 LPS(50 mg/ml) 용액을 1회용 미세주사기를 이용하여 종령 유충 체강에 주사한 다음 26℃에서18시간 면역을 유도하였다.
- 5% SDS-peptide 전기영동 및 방사선 확산 분석(Radial Diffusion Assay : RDA)을 이용한 항균활성 검정을 통하여 확인하였다. 항균 펩타이드가 포함된 분획은 다시 Superdex Peptide 컬럼을 이용한 액상 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 순수 정제하였고, 16.5% SDS-Peptide 전기영동을 통하여 그 정제도 및 분자량을 분석하였다. 순수 분리 정제된 세크로핀 항균 펩타이드는 Applied Biosystem Procise Sequencer를 사용한 Edman degradation법으로 N말단 아미노산 서열을 결정한 다음 BLAST 상동성 분석을 통하여 동정하였다.
- 항균 활성 분석에 사용한 그람음성세균 Escherichia coli ML35, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 및 그람양성세균 Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus들은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth, Difco, USA) 액체 배지에서 37℃, 200 rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 4 × 106 CFU/ml 농도가 되도록 2시간 30분간 2차 배양하였다.
- 용출된 단백질 분획은 단백질 전기영동 및 항균활성검정을 통하여 세크로핀이 포함된 분획을 선별하였다. 회수한 분획을 냉동건조로 농축한 다음 염 및 기타 단백질을 제거하기 위해 Superdex peptide 컬럼으로 gel filtration 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하였다(Fig. 3B). 또한 용출된 분획은 단백질 전기영동 분석 및 항균활성 검정을 통하여 확인하였다(Fig.
대상 데이터
- 면역 유도된 천잠 유충 및 무처리 정상 유충으로부터 혈림프를 채취하여 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 그 상등액을 -20℃에 보관 한 다음 단백질 추출에 사용하였다. 보관된 혈림프 시료를 동일한 양의 1% 아세트산 용액과 진탕, 혼합한 다음 실온에서 2시간 교반을 통하여 단백질을 추출하였다.
성능/효과
- 3C). SDS-PAGE 분석 결과, 분획 32, 33, 34, 35에서 약 4 kDa의 항균 펩타이드 밴드를 확인하였으며, 또한 이들 분획은 대장균에 대한 RDA 분석에서 항균활성을 나타냈었다. 정제된 세크로핀은 Applied Biosystem Procise Sequencer를 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다.
- 1). 단백질 전기영동 분석 결과, 면역 유도된 혈림프 단백질 추출 시료에서만 특이적으로 발현되는 후보 항균 펩타이드(AMCP) 1종을 확인하였으며 그 분자량은 약 4kDa으로 측정되었다(Fig. 1A). 또한 면역 유도 혈림프 단백질 추출물은 병원성 대장균(E.
- 즉, 천잠 세크로핀은 3종의 그람양성세균 및 1종의 진균에 대해서는 강력한 항균 및 항진균 활성을 가지는 melittin에 비해 항균활성이 낮았지만 3종의 그람음성세균에서는 멜리틴에 비해 4~8배 이상의 우수한 항균력을 나타냈었다. 따라서 천잠 세크로핀은 기존에 보고된 다양한 곤충의 세크로핀과 유사한 광범위한 항균 스펙을 가지고 있음을 확인하였다. 일반적으로 곤충 항균 펩 타이드의 미생물에 대한 작용기작으로는 carpet 모델, toroidal-hole 모델 및 barrel stave 모델로 설명되는 세포막을 직접 파괴하여 박테리아를 치사시키는 기작과 세포막을 통과하여 세포질에서 DNA합성 억제 및 생장과 관련된 대사 작용 억제를 통하여 작용하는 기작이 알려져 있다(Powers and Hancock 2003).
- 특이적으로 발현된 펩타이드 밴드를 겔로부터 분리한 다음 trypsin을 처리하여 단편으로 분해시킨 후 MALDI-TOF MS 분석에 의한 peptide mass fingerprinting을 통하여 세크로핀류 항균 펩타이드로 확인되었다. 또한 MALDI-TOF MS을 통한 펩타이드 질량 분석 결과, 그 분자량이 4223.01 Da으로 측정되었다(Fig. 2).
- 정제된 펩타이드는 Edman degradation 법으로 N말단 아미노산 서열을 결정하였고 다른 나비목 곤충의 세크로핀과 매우 높은 상동성을 나타내어 세크로핀으로 동정하였다. 또한 정제된 천잠 세크로핀 항균 펩타이드는 그람음성세균, 그람양성세균 및 곰팡이에 대해 폭 넓은 항균 스펙트럼을 나타냈었다.
- luteus에 대한 항균활성을 나타냈었다. 또한 캔디다증을 유발하는 C. albicans에 대해서도 항진균활성을 보였다. 이들 병원균에 대한 최소생장억제농도는 E.
- 정제된 세크로핀은 Applied Biosystem Procise Sequencer를 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다. 분석한 N-말단 아미노산 서열은 KWKFFKKIERVG이였고 누에를 포함한 나비목 곤충의 Cecropin A 항균 펩타이드의 N-말단 아미노산 서열과 약 80% 이상의 높은 상동성을 나타냈었다(Fig. 3D).
- albicans에 대해서도 항진균활성을 보였다. 이들 병원균에 대한 최소생장억제농도는 E. coli ML35에1 ug/ml, K. pneumoniae 및 P. aeruginosa에서는 2 ug/ml, S. aureus는 64 ug/ml, E. faecalis 및 M. luteus에 대해서는 128 ug/ml로 측정되었으며 진균 C. albicans에서는 64 ug/ ml로 확인되었다. 즉, 천잠 세크로핀은 3종의 그람양성세균 및 1종의 진균에 대해서는 강력한 항균 및 항진균 활성을 가지는 melittin에 비해 항균활성이 낮았지만 3종의 그람음성세균에서는 멜리틴에 비해 4~8배 이상의 우수한 항균력을 나타냈었다.
- 먼저 항균 펩타이드를 분리하기 위해서, 면역 유도된 유충 및 정상 유충으로부터 추출된 혈림프 단백질 시료에 대한 단백질 전기영동(SDS-PAGE)를 통하여 비교분석하였다. 정상누에 혈림프 시료에 비해 면역 유도된 혈림프 추출물에서만 특이적으로 발현되는 분자량 4,223.01 Da의 펩타이드 밴드를 검출하였다. 선발된 면역 유도 특이적 발현 펩타이드의 특성 분석을 위해서 이온 교환 크로마토그래피 및 gel permeation 크래마토그래피을 수행하여 특이적으로 발현되는 펩타이드를 성공적으로 순수 정제하였다.
- 선발된 면역 유도 특이적 발현 펩타이드의 특성 분석을 위해서 이온 교환 크로마토그래피 및 gel permeation 크래마토그래피을 수행하여 특이적으로 발현되는 펩타이드를 성공적으로 순수 정제하였다. 정제된 펩타이드는 Edman degradation 법으로 N말단 아미노산 서열을 결정하였고 다른 나비목 곤충의 세크로핀과 매우 높은 상동성을 나타내어 세크로핀으로 동정하였다. 또한 정제된 천잠 세크로핀 항균 펩타이드는 그람음성세균, 그람양성세균 및 곰팡이에 대해 폭 넓은 항균 스펙트럼을 나타냈었다.
- albicans에서는 64 ug/ ml로 확인되었다. 즉, 천잠 세크로핀은 3종의 그람양성세균 및 1종의 진균에 대해서는 강력한 항균 및 항진균 활성을 가지는 melittin에 비해 항균활성이 낮았지만 3종의 그람음성세균에서는 멜리틴에 비해 4~8배 이상의 우수한 항균력을 나타냈었다. 따라서 천잠 세크로핀은 기존에 보고된 다양한 곤충의 세크로핀과 유사한 광범위한 항균 스펙을 가지고 있음을 확인하였다.
- 반면에 정상 유충 혈림프에서는 항균활성이 전혀 나타나지 않았다. 특이적으로 발현된 펩타이드 밴드를 겔로부터 분리한 다음 trypsin을 처리하여 단편으로 분해시킨 후 MALDI-TOF MS 분석에 의한 peptide mass fingerprinting을 통하여 세크로핀류 항균 펩타이드로 확인되었다. 또한 MALDI-TOF MS을 통한 펩타이드 질량 분석 결과, 그 분자량이 4223.
후속연구
- 세크로핀의 경우 전자의 작용기작을 갖는 항균 펩타이드로 미생물에 대해 보다 효과적으로 작용하며 광범위한 항균스펙을 나타낸다. 따라서 본 연구에서 분리된 천잠 세크로핀은 새로운 천연 항생제 개발을 위한 의약 소재로 그 가치가 클 것으로 기대된다.
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