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문제 정의
- 또한, mitochondria energy metabolism 에 관여하는 RNA array 분석 결과 mitochondria potential 강화와 관련된 효소 (NADH dehydrogenase oxidase, ATP synthase)의 활성화를 유도하는 것이 관찰되었다. 따라서 본 연구팀에서는 광조사는 파장별로 세포 내 기능을 다르게 유도할 수 있고 세포종류 혹은 상태에 따라 다르게 조절 할 수 있는 것으로 보고 파장별, 세포별로 나누어 다양한 생리활성 효과를 연구하고 있다. 본 연구팀에서 수행했던 그리고 진행 중인 몇 가지 연구 결과를 아래에 나열하였다.
- 본 연구팀은 850nm LED와 골수유래 성체줄기세포를 이용하여 피부조직 괴사 억제 및 상처치유효과를 연구한 바 있다. 쥐의 등 부분에 가로 3cm 세로 1.
- 비분화성이기 때문에 항암치료에 내성을 보이며 증식이 폭발적으로 일어나 전이되기 쉬운 특성을 가지고 있다. 본 연구팀은 비분화성 갑상선 암의 광역학 치료 동물모델 구축 중에 이 현상을 발견하게 되었다. 그림 6과 같이 쥐의 갑상선에 비분화성 갑상선 암세포를 주입하고 광역학치료 대조군 중의 하나로 630nm 광조사군만 설정하였다.
- 유비퀴논도 대표적인 HSP 이지만 변성단백질에 공유 결합하여 proteasome분해 지표로 작용하고 있다. 이러한 HSP 이 광조사에 의해 조절되는지 확인해보기 위해 사람의 정상섬유아세포에 LED 조사 후 HSP의 발현을 확인해 보았다. HSP 발현을 형광분석한 결과 660 nm 는 HSP 60 (증식), 27 (세포사멸) 발현에, 850 nm 는 HSP 60, 90 (세포사멸) 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었다 (그림 5).
제안 방법
- 그림 6과 같이 쥐의 갑상선에 비분화성 갑상선 암세포를 주입하고 광역학치료 대조군 중의 하나로 630nm 광조사군만 설정하였다. 4 주후, 광조사만 실시한 군의 갑상선암세포가 현저하게 증가하는 것을 발견하고 갑상선암조직을 채취하여 병리분석을 실시하였다. 이 암조직은 광조사 후 macrophage 의 폭발적으로 증가하고 허혈이 나타나 급성염증소견을 보였고 면역화학염색에서는 암전이 요소인 저산소증 유발인자 (Hypoxia inducible factor 1, HIF-1)와 혈관내피 세포 성장인자 (Vessel endothelial growth factor, VEGF) 의 발현이 급격히 증가하는 것으로 관찰되었다.
- 사람의 각막상피세포를 손상시킨 후 다양한 파장의 LED 조사를 실시하고 이동성 평가실험을 실시하였다. 여러 파장대 중 740nm 가 가장 유의한 결과를 나타냈고 광조사는 세포막 GPCR/Rho family 의 활성을 통해 이동성 및 사멸방지에 기여하는 것으로 관찰되었다 (그림 4).
- 사람의 섬유아세포에 광조사를 실시한 후 HSP 발현을 형광염색하여 분석하였다. 660nm 는 HSP 60 (증식), 27 (세포사멸) 발현에, 850nm 는 HSP 60, 90 (세포사멸) 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었다.
- 성체 줄기세포에 660 nm LED 를 조사하고 30분 뒤 RNA를 추출하였다. Qiagen 사의 heman RNA profiler kit 를 이용하여 광조사에 의해 조절되는 단백질을 탐색한 결과 세포손상을 유도하는 apoptosis, inflammation 등의 발현인자는 감소되고 proliferation, differentiation, mitochondria energy metabolism, migration 등은 증가하는 것으로 나타났다.
- 세포손상으로 정확한 신호전달이 불가능할 때 HSP 발현을 통해 단백질 이상형성을 바로 잡고 second messenger 의 신호를 증폭시키는 것으로 가정하고 여러가지 이온채널 불균형, 독성물질의 노출 등의 세포손상 환경을 만들어 질환 실험을 실험해보았다.
- 신경세포에 독성물질인 ouabain을 처리하고 LED조사로 신경세포 보호효과를 관찰해보았다. Ouabain 은 Srctyrosine phosphatase 를 증가시켜 Na-K ATPase 활성을 억제하여 이온 펌프의 수송 affinity를 떨어트리는 것으로 알려져 있다.
- 흰쥐의 대퇴부에서 추출한 골수유래 성체 줄기세포를 primary culture 하고 stemness (분화가능성) 를 확인하였다. 실험군은 골수유래 성체줄기세포만 주입한 그룹, 광조사만 실시한 그룹, 성체줄기 세포 주입과 광조사를 같이 실시한 그룹으로 나누어 관찰하였다. 성체줄기세포와 LED광조사를 같이 실시한 그룹의 상처치유율이 가장 높았고 병리분석 결과 염증으로 인한 조직괴사가 가장 적고 (H&E), 콜라젠 등의 조직간 결합능이 증가하였으며 (Masson-Trichome staining), 내피 혈관 생성이 월등하게 높아지는 것 (PECAM-1 staining) 을 관찰 할 수 있었다 (그림 1).
- 어린 흰쥐에 sodium selenite를 주입하여 백내장을 유도하고 동시에 광조사를 실시하였다. 백내장 억제 및 예방효과를 예비 실험한 결과 740nm 에서 가능성이 있음을 발견하였고 현재 광조사의 백내장 보호기전을 연구 중에 있다 (그림 8).
- 이러한 세포분화 및 증식은 세포이식 후 초기 부착능이 상당히 중요한데 이에 관여하는 focal adhesion kinase의 광조사 후 발현을 조사하였다. 그림 2 와 같이 600nm 이상의 파장대 광조사는 세포의 초기부착을 돕는 효과를 보였고 특히 850nm 에서 가장 유의적으로 관찰되었다.
- 증식, 분화, 에너지 메타볼리즘이 광조사에 의해 조절될 수 있는지, 조절이 가능하다면 어떠한 단백질이 형성되는지 알아보기 위하여 RNA microarray analysis 를 시행하였다. 줄기세포에 660nm의 LED 조사 후 RNA를 분리하고 quantitative PCR 분석을 실시하였다 (그림 3). 세포주기 조절과 분화에 관련된 transforming growth factor-beta (TGF-b)와 cytochrome C, GTPase, Rho family 등이 크게 증가하였고 세포신호전달의 중요 인자인 heat shock protein (HSP) family 등도 유의하게 증가하였다.
- 본 연구팀은 850nm LED와 골수유래 성체줄기세포를 이용하여 피부조직 괴사 억제 및 상처치유효과를 연구한 바 있다. 쥐의 등 부분에 가로 3cm 세로 1.5cm 의 절개를 내고 skin flap 을 실시하였다. 흰쥐의 대퇴부에서 추출한 골수유래 성체 줄기세포를 primary culture 하고 stemness (분화가능성) 를 확인하였다.
- 증식, 분화, 에너지 메타볼리즘이 광조사에 의해 조절될 수 있는지, 조절이 가능하다면 어떠한 단백질이 형성되는지 알아보기 위하여 RNA microarray analysis 를 시행하였다. 줄기세포에 660nm의 LED 조사 후 RNA를 분리하고 quantitative PCR 분석을 실시하였다 (그림 3).
- 5cm 의 절개를 내고 skin flap 을 실시하였다. 흰쥐의 대퇴부에서 추출한 골수유래 성체 줄기세포를 primary culture 하고 stemness (분화가능성) 를 확인하였다. 실험군은 골수유래 성체줄기세포만 주입한 그룹, 광조사만 실시한 그룹, 성체줄기 세포 주입과 광조사를 같이 실시한 그룹으로 나누어 관찰하였다.
대상 데이터
- 본 연구팀은 비분화성 갑상선 암의 광역학 치료 동물모델 구축 중에 이 현상을 발견하게 되었다. 그림 6과 같이 쥐의 갑상선에 비분화성 갑상선 암세포를 주입하고 광역학치료 대조군 중의 하나로 630nm 광조사군만 설정하였다. 4 주후, 광조사만 실시한 군의 갑상선암세포가 현저하게 증가하는 것을 발견하고 갑상선암조직을 채취하여 병리분석을 실시하였다.
성능/효과
- 사람의 섬유아세포에 광조사를 실시한 후 HSP 발현을 형광염색하여 분석하였다. 660nm 는 HSP 60 (증식), 27 (세포사멸) 발현에, 850nm 는 HSP 60, 90 (세포사멸) 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었다.
- 이러한 HSP 이 광조사에 의해 조절되는지 확인해보기 위해 사람의 정상섬유아세포에 LED 조사 후 HSP의 발현을 확인해 보았다. HSP 발현을 형광분석한 결과 660 nm 는 HSP 60 (증식), 27 (세포사멸) 발현에, 850 nm 는 HSP 60, 90 (세포사멸) 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었다 (그림 5).
- 성체 줄기세포에 660 nm LED 를 조사하고 30분 뒤 RNA를 추출하였다. Qiagen 사의 heman RNA profiler kit 를 이용하여 광조사에 의해 조절되는 단백질을 탐색한 결과 세포손상을 유도하는 apoptosis, inflammation 등의 발현인자는 감소되고 proliferation, differentiation, mitochondria energy metabolism, migration 등은 증가하는 것으로 나타났다.
- 기초연구로는 파장별, 세기별 세포 기능 향상 혹은 생리활성 조절효과를 분석하고 있고, 임상적으로는 각 질환에 따른 파장별 효과를 꾸준히 연구하고 있다. 광 조사에 의한 세포초기 반응은 ATP와 칼슘이온의 증가가 대표적으로 알려져 있는데 본 연구팀이 시간대 별로 분석한 결과 10-15분 이내에 ATP와 칼슘이온이 증가하고 이때 발생한 에너지는 mitochondria potential 증가, second messenger (cAMP, cGMP, Heatshock protein 등)의 활성화 및 ROS 발생량을 조절할 수 있음을 발견하였다. 특히 ROS 에 대한 조절이 흥미로운데 성체줄기세포 분화 초기나 정상상태의 섬유아세포 (진피층) 에서의 광조사는 ROS를 증가시켜 분화, 이동, 증식을 유도하지만 손상상태에서는 ROS의 양을 감소시켜 항산화효과와 염증완화 효과를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 이러한 세포분화 및 증식은 세포이식 후 초기 부착능이 상당히 중요한데 이에 관여하는 focal adhesion kinase의 광조사 후 발현을 조사하였다. 그림 2 와 같이 600nm 이상의 파장대 광조사는 세포의 초기부착을 돕는 효과를 보였고 특히 850nm 에서 가장 유의적으로 관찰되었다.
- 또한 파장별로 HSP 발현의 최대치가 약간씩 틀렸는데 HSP 60 의 경우 660nm 조사후 15분, 850nm 조사 후 30분에 최대였으며 HSP 90은 15분 이후부터 60분까지 발현이 유지되는 것을 관찰 할 수 있었다.
- 특히 ROS 에 대한 조절이 흥미로운데 성체줄기세포 분화 초기나 정상상태의 섬유아세포 (진피층) 에서의 광조사는 ROS를 증가시켜 분화, 이동, 증식을 유도하지만 손상상태에서는 ROS의 양을 감소시켜 항산화효과와 염증완화 효과를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, mitochondria energy metabolism 에 관여하는 RNA array 분석 결과 mitochondria potential 강화와 관련된 효소 (NADH dehydrogenase oxidase, ATP synthase)의 활성화를 유도하는 것이 관찰되었다. 따라서 본 연구팀에서는 광조사는 파장별로 세포 내 기능을 다르게 유도할 수 있고 세포종류 혹은 상태에 따라 다르게 조절 할 수 있는 것으로 보고 파장별, 세포별로 나누어 다양한 생리활성 효과를 연구하고 있다.
- 사람의 각막세포에 wound 를 주고 광조사후 세포가 이동하여 메꿔지는 정도를 정량분석한 결과 740nm 에서 가장 이동능이 증가하는 것을 발견하였으며 이에 관여하는 단백질은 Rho family 로 밝혀내었다.
- 사람의 비분화성 암세포에 레이저를 조사한 후 4 주 동안 관찰 한 결과 폭발적으로 갑상선 암의 크기가 커지는 것을 관찰 할 수 있었고 암 공격성의 마커인 염증인자분석 (상단우측), 저산소인자(HIF-1a, 하단좌측), 혈관형성인자 (VEGF, 하단우측) 가 광조사후 상당히 증가되어있음을 발견하였다.
- 성체 줄기세포의 초기 부착에 관여하는 focal adhesion kinase (붉은색) 면역염색 결과 600nm 이상의 파장대 광조사는 세포의 초기 부착능을 향상시키고 특히 850nm 의 파장이 유효하였다.
- 성체줄기세포와 LED광조사를 같이 실시한 그룹의 상처치유율이 가장 높았고 병리분석 결과 염증으로 인한 조직괴사가 가장 적고 (H&E), 콜라젠 등의 조직간 결합능이 증가하였으며 (Masson-Trichome staining), 내피 혈관 생성이 월등하게 높아지는 것 (PECAM-1 staining) 을 관찰 할 수 있었다 (그림 1).
- 줄기세포에 660nm의 LED 조사 후 RNA를 분리하고 quantitative PCR 분석을 실시하였다 (그림 3). 세포주기 조절과 분화에 관련된 transforming growth factor-beta (TGF-b)와 cytochrome C, GTPase, Rho family 등이 크게 증가하였고 세포신호전달의 중요 인자인 heat shock protein (HSP) family 등도 유의하게 증가하였다. 특히 세포고사 (apoptosis) 방해인자로 알려진 HSP 70과 HSP 60의 발현이 의미 있었으며 세포손상으로 신호전달의 기형이 발생할 때도 광조사가 이를 적절히 조절할 수 있음을 발견하였다.
- Ouabain 은 Srctyrosine phosphatase 를 증가시켜 Na-K ATPase 활성을 억제하여 이온 펌프의 수송 affinity를 떨어트리는 것으로 알려져 있다. 신경세포를 ouabain 에 2 시간 동안 노출시킨 뒤 광조사를 실시하고 src 와 Na-K ATpase 의 활성을 관찰한 결과 광조사는 세포막 이온채널의 교란을 억제하고 src의 발현을 조절하여 세포 내 스트레스를 완화시킬 수 있음을 증명하였다 (그림 7).
- 신경세포를 ouabain 에 두 시간동안 노출시킨 후 광조사를 실시한 결과 광조사는 ouabain 의 주요경로인 src를 비활성화시켜 이온채널의 교란을 억제하여 Na-pump 의 항상성을 유지할 수 있음을 밝혀내었다.
- 사람의 각막상피세포를 손상시킨 후 다양한 파장의 LED 조사를 실시하고 이동성 평가실험을 실시하였다. 여러 파장대 중 740nm 가 가장 유의한 결과를 나타냈고 광조사는 세포막 GPCR/Rho family 의 활성을 통해 이동성 및 사멸방지에 기여하는 것으로 관찰되었다 (그림 4).
- 이 암조직은 광조사 후 macrophage 의 폭발적으로 증가하고 허혈이 나타나 급성염증소견을 보였고 면역화학염색에서는 암전이 요소인 저산소증 유발인자 (Hypoxia inducible factor 1, HIF-1)와 혈관내피 세포 성장인자 (Vessel endothelial growth factor, VEGF) 의 발현이 급격히 증가하는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 갑상선 암발현 가능성을 가지고 있는 환자의 구강궤양 개선을 위한 저출력치료가 위험할 수 있음을 증명하였다.
- 4 주후, 광조사만 실시한 군의 갑상선암세포가 현저하게 증가하는 것을 발견하고 갑상선암조직을 채취하여 병리분석을 실시하였다. 이 암조직은 광조사 후 macrophage 의 폭발적으로 증가하고 허혈이 나타나 급성염증소견을 보였고 면역화학염색에서는 암전이 요소인 저산소증 유발인자 (Hypoxia inducible factor 1, HIF-1)와 혈관내피 세포 성장인자 (Vessel endothelial growth factor, VEGF) 의 발현이 급격히 증가하는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 갑상선 암발현 가능성을 가지고 있는 환자의 구강궤양 개선을 위한 저출력치료가 위험할 수 있음을 증명하였다.
- 광 조사에 의한 세포초기 반응은 ATP와 칼슘이온의 증가가 대표적으로 알려져 있는데 본 연구팀이 시간대 별로 분석한 결과 10-15분 이내에 ATP와 칼슘이온이 증가하고 이때 발생한 에너지는 mitochondria potential 증가, second messenger (cAMP, cGMP, Heatshock protein 등)의 활성화 및 ROS 발생량을 조절할 수 있음을 발견하였다. 특히 ROS 에 대한 조절이 흥미로운데 성체줄기세포 분화 초기나 정상상태의 섬유아세포 (진피층) 에서의 광조사는 ROS를 증가시켜 분화, 이동, 증식을 유도하지만 손상상태에서는 ROS의 양을 감소시켜 항산화효과와 염증완화 효과를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, mitochondria energy metabolism 에 관여하는 RNA array 분석 결과 mitochondria potential 강화와 관련된 효소 (NADH dehydrogenase oxidase, ATP synthase)의 활성화를 유도하는 것이 관찰되었다.
- 세포주기 조절과 분화에 관련된 transforming growth factor-beta (TGF-b)와 cytochrome C, GTPase, Rho family 등이 크게 증가하였고 세포신호전달의 중요 인자인 heat shock protein (HSP) family 등도 유의하게 증가하였다. 특히 세포고사 (apoptosis) 방해인자로 알려진 HSP 70과 HSP 60의 발현이 의미 있었으며 세포손상으로 신호전달의 기형이 발생할 때도 광조사가 이를 적절히 조절할 수 있음을 발견하였다.
후속연구
- 현재 시판되는 광 치료기기의 광원들이 기술의 발전으로 인해 다양해지면서 구조, 출력, 크기, 파장대 등이 변화되고 있어 추후에는 이 부분의 융합적 연구가 많이 요구되어 질 것으로 보인다. 레이저는 단일파장 (monochromaric), 동일한 위상과 파동의 균일성 (coherent), 직진성 (collimated)의 특성을 가지고 있는데 비해 LED 는 레이저 광원에 비하여 다소 넓은 출력 스펙트럼을 가지는 비간섭성 (non-coherent) 이고 비평행광(non-coillimated) 이어서 넓은 범위의 조사가 가능한 장점을 가지고 있으며 다색 및 다단계 밝기 제어, 소형화, 높은 광전환 효율이 가능하므로 기능 확장이 얼마든지 가능한 광원이다.
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