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문제 정의
- 상처 유발 후 각 그룹별 광조사 조직들과 비조 사 조직들의 상처 수복에 대하여 관찰한 결과 육 안으로는 광조사 그룹과 비조사 그룹이 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 상처 치유에 대한 피부재생 의 육안 소견보다 정확한 결과를 확인하기 위해 조직학적 검사를 시행하였다. 상처의 조직학적 관 찰을 위해 최종 광조사 24 시간 후 상처를 중심으 로 2x2 cm 크기로 피부를 적출하여 조직 절편을 제작하여 광학현미경적 측정을 시행하였다.
- 본 논문에서는 광선 치료법에 사용되는 저출력 레이저를 대신하여 가격이 저렴하고 안전한 LED 광원을 채택, 적용한 사례를 보고하고자 하며 633 nm LED가 생체 피부에 미치는 효과를 조사하기 위해 세포 실험과 동물 실험을 동시에 시행하였다.
- 본 논문에서는 저출력 레이저 치료에 사용되는 레이저와 비슷한 파장의 광을 방출하는 633 nm LED를 적용하여 LED 조사기를 설계 . 개발 및 제 작한 후 세포 및 동물실험을 실시하여 성능 및 효 과를 검증하였다.
제안 방법
- Function input은 사용자의 선택에 따라 기기의 동작이 가능하도록 마이크로 컨트롤러에 동작 제어신호를 입력 시키 는 부분으로, 장치 외부의 Tactile switch# 통해 제어 신호가 입력된다. 4-채널로 구성된 광조사기 각각의 채널에 대해 광조사 시간(Timer), 광출력 (mW/cm2) 및 예약(Reservation) 등을 선택 제어할 수 있도록 설계하였다.
- 기기의 핵심 부분 중 하나인 LED 드라이버는 광 출력 조절을 위해 TLC5941 을 채용하였으며, 다수의 LED에 정격 전류를 공급하 기 위해 기기의 출력 채널마다 2 개의 TLC5941을 사용하였다. LED 광 모듈부는 8x12로 배열하여 최대 96 개의 LED를 구성할 수 있도록 설계하였 으며, 광 모듈부의 D-sub를 이용, 탈착 형태로 제 작하여 선택 파장의 제어가 가능하도록 하였다. ri 림 1은 시스템 구성도이다.
- 본 논문에서는 저출력 레이저 치료에 사용되는 레이저와 비슷한 파장의 광을 방출하는 633 nm LED를 적용하여 LED 조사기를 설계 . 개발 및 제 작한 후 세포 및 동물실험을 실시하여 성능 및 효 과를 검증하였다.
- 정확 한 측정값을 확인하기 위하여 633 nm LED 조사 군과 비 조사군의 결손 크기를 MagnaFire digital camera system (Optronics, Goleta, CA, USA)을 이용하여 촬영한 후, Visus Image Analysis System (Image & Microscope Technology, Daejon, Korea)을 통하여 결손부위 장경을 측정하였다. 결 손 크기를 정확하고 개관적으로 측정하기 위하여 cytokeratin 에 대한 immunohistochemical staining 을 시행하였다. 그 결과.
- MTT assay로 세포의 증식률 을 판정한 결과 광 조사 그룹의 피부 조직 세포가 비 조사 그룹의 피부 조직 세포보다 높은 증식을 보였다. 또한, 피부 상처에 633 nm LED 광원이 미치는 효과를 검증하기 위하여 실험동물의 둥에 지름 1 cm 크기의 원형으로 피부를 전층 제거하여 9 일 동안 광조사를 하며 변화를 관찰하였다. 정확 한 측정값을 확인하기 위하여 633 nm LED 조사 군과 비 조사군의 결손 크기를 MagnaFire digital camera system (Optronics, Goleta, CA, USA)을 이용하여 촬영한 후, Visus Image Analysis System (Image & Microscope Technology, Daejon, Korea)을 통하여 결손부위 장경을 측정하였다.
- Rat의 태아 피부에서 추출한 조직 세포를 633 nm LED의 지속파(CW)를 사용, 10 mW/cn?로 60분간 광조사 하였다. 실험 시 세포 배양에 사용한 시약 은 FBS (Fetal Bovine Serum, GibcoBRL, UK) 과 DMEMCDulbeco' s Modified Eagle's Medium, GibcoBRL, UK), L-Glutamin (GibcoBRL, UK) 혼합 배지를 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 광 조사 시스템은 생물학적 실험이나 상처 치유에 다양하게 적용할 수 있도록 개발한 LED 광조사기 [10]로 최대 4 개의 LED 광 모듈을 동시 혹은 개별적으로 제어할 수 있도록 구성하였다. 기기는 Common anode type으로, 220 V 교류 전원을 SMPS(Switching mode power supply)로부터 공급받아 안정된 48 V 직류 전원으 로 변환한 후 다수의 LED로 구성된 광 모듈에 공 급하며, 마이크로 컨트롤러 및 구동전압이 낮은 IC 는 DC/DC 컨버터를 사용하여 48 V에서 5 V로 강 압하여 회로 내부로 인가된다.
- 633 nm LED 광원이 상처 치유 에 미치는 영향을 확인하기 위해 자체 개발한 광 조사기를 사용하였으몌 10], 광을 조사하지 않은 조직 샘플 1개와 광을 조사한 조직 샘플 1개씩을 1개 그룹으로 하여 총 4개 그룹으로 나누어 실험 후 studenfs T test를 사용하여 통계처리 하였다. 상처 유발 24 시간 이후부터 광 조사를 시행할 Rat에 하루 1 시간씩 9 일 동안 광을 조사하였고 표 2에 광을 조사한 그룹의 실험 조건을 나타냈다.
- 실험에 사용된 실험동물은 250-2S) g의 Sprague- Dawley Rat(SD-Rat) 수컷으로 생후 8주 된 성체 를 사용하였으며 실험 기간 동안 전용 사료와 음 수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 상처를 만들기 위해 세보플루란(sevoflurane) 호흡마취제 를 사용하여 마취한 후, 등의 털을 제거하고 피부 를 노출시켜 지름 1 cm 크기의 원형으로 피부 전 층을 제거하였다. 633 nm LED 광원이 상처 치유 에 미치는 영향을 확인하기 위해 자체 개발한 광 조사기를 사용하였으몌 10], 광을 조사하지 않은 조직 샘플 1개와 광을 조사한 조직 샘플 1개씩을 1개 그룹으로 하여 총 4개 그룹으로 나누어 실험 후 studenfs T test를 사용하여 통계처리 하였다.
- 따라서 상처 치유에 대한 피부재생 의 육안 소견보다 정확한 결과를 확인하기 위해 조직학적 검사를 시행하였다. 상처의 조직학적 관 찰을 위해 최종 광조사 24 시간 후 상처를 중심으 로 2x2 cm 크기로 피부를 적출하여 조직 절편을 제작하여 광학현미경적 측정을 시행하였다. 측정방 법은 우선 즉정부위를 MagnaFire digital camera system (Optronics, Goleta, CA, USA)을 이용하여 촬영 후, 이 디지털 이미지를 바탕으로 Vistis Image Analysis System (Image & Microscope Technology, Daejon, Korea)을 통해 피부결손부위 장경을 측정 하여 그 결과를 표 3에 나타냈다.
- 실험동물의 상처 부위에 정확한 광조사가 이루 어질 수 있도록 홀더(Holder)를 사용하여 실험동물 의 움직임을 최소화 하였다. 실험동물은 상처 유발 후 개체의 안정을 위해 24 시간 안정화 과정을 거 친 후 광조사를 하였고 최종 광조사를 행한 후 조 직 샘플을 채취하였다.
- 실험동물의 상처 부위에 정확한 광조사가 이루 어질 수 있도록 홀더(Holder)를 사용하여 실험동물 의 움직임을 최소화 하였다. 실험동물은 상처 유발 후 개체의 안정을 위해 24 시간 안정화 과정을 거 친 후 광조사를 하였고 최종 광조사를 행한 후 조 직 샘플을 채취하였다.
- 실험 시 세포 배양에 사용한 시약 은 FBS (Fetal Bovine Serum, GibcoBRL, UK) 과 DMEMCDulbeco' s Modified Eagle's Medium, GibcoBRL, UK), L-Glutamin (GibcoBRL, UK) 혼합 배지를 사용하였다. 실험에는 Passage 6의 세포를 사용하였으며 기존의 배지를 제거한 후 PBS (GibcoBRL, UK) 용액으로 2회 세척하고 Trypsin- EDTA (GibcoBRL, UK)를 사용, 5분간 인큐베이 션하여 섬유성 단백질을 분해시켜 채취하여 원심 분리를 통해 세포 회수 후 1 X 1()5개씩 분주하였 다. 표 1에 본 연구의 피부 세포의 실험 조건을 나 타냈다.
- 피부 세포의 증식에 633 nm LED 광원이 미치 는 효과를 조사하기 위하여 세포가 성장하는 환경 을 제공하는 인큐베이터 내부에 LED 모듈을 설치 하여 피부 세포에 광을 조사하였다. 인큐베이터 내 부의 습도 및 온도의 영향으로 장시간 기기를 장 착 할 수 없으므로 컨트롤러를 인큐베이터 외부에 설치하고 LED 모듈을 착탈식으로 구성하여 케이 블을 사용하여 인큐베이터 내부에 장착 가능하도 록 구성 하였으며 그림 2에 개략도를 나타냈다.
- 또한, 피부 상처에 633 nm LED 광원이 미치는 효과를 검증하기 위하여 실험동물의 둥에 지름 1 cm 크기의 원형으로 피부를 전층 제거하여 9 일 동안 광조사를 하며 변화를 관찰하였다. 정확 한 측정값을 확인하기 위하여 633 nm LED 조사 군과 비 조사군의 결손 크기를 MagnaFire digital camera system (Optronics, Goleta, CA, USA)을 이용하여 촬영한 후, Visus Image Analysis System (Image & Microscope Technology, Daejon, Korea)을 통하여 결손부위 장경을 측정하였다. 결 손 크기를 정확하고 개관적으로 측정하기 위하여 cytokeratin 에 대한 immunohistochemical staining 을 시행하였다.
- 상처의 조직학적 관 찰을 위해 최종 광조사 24 시간 후 상처를 중심으 로 2x2 cm 크기로 피부를 적출하여 조직 절편을 제작하여 광학현미경적 측정을 시행하였다. 측정방 법은 우선 즉정부위를 MagnaFire digital camera system (Optronics, Goleta, CA, USA)을 이용하여 촬영 후, 이 디지털 이미지를 바탕으로 Vistis Image Analysis System (Image & Microscope Technology, Daejon, Korea)을 통해 피부결손부위 장경을 측정 하여 그 결과를 표 3에 나타냈다.
- 피부 세포의 분주 후, Cell 안정화를 위해 인큐베이터 내부에서 24시간 인큐 베이션 하였고 광 조사 후에도 24시간 인큐베이션 하였으며 측정은 Moleculor Device사의 microplate reader인 VERSA MAX의 5W nm 파장을 사용하 였다. 특정 파장의 광조사로 인한 media의 특성 변화를 고려하여 LED 광 조사 후에는 즉시 media 를 교체하였다.
- MTT Assay는 MTT Tetrazolium염 이 탈수소 효 소 작용에 의해 비수용성의 MTT Formazan으로 환원되는 미토콘드리아의 능력을 이용한 측정법으 로 MTT Formazan의 흡광도를 측정하여 세포의 증식률 분석이 가능하며, 방사성 동위 원소를 사용 하지 않아 안전하고 간편하며 신속한 비교가 가능 한 장점을 가지고 있다. 피부 세포의 분주 후, Cell 안정화를 위해 인큐베이터 내부에서 24시간 인큐 베이션 하였고 광 조사 후에도 24시간 인큐베이션 하였으며 측정은 Moleculor Device사의 microplate reader인 VERSA MAX의 5W nm 파장을 사용하 였다. 특정 파장의 광조사로 인한 media의 특성 변화를 고려하여 LED 광 조사 후에는 즉시 media 를 교체하였다.
- 피부 세포의 증식에 633 nm LED 광원이 미치 는 효과를 조사하기 위하여 세포가 성장하는 환경 을 제공하는 인큐베이터 내부에 LED 모듈을 설치 하여 피부 세포에 광을 조사하였다. 인큐베이터 내 부의 습도 및 온도의 영향으로 장시간 기기를 장 착 할 수 없으므로 컨트롤러를 인큐베이터 외부에 설치하고 LED 모듈을 착탈식으로 구성하여 케이 블을 사용하여 인큐베이터 내부에 장착 가능하도 록 구성 하였으며 그림 2에 개략도를 나타냈다.
- 피부 조직 세포에 633 nm LED 광원이 미치는 영향을 확인하기 위하여 광 조사 그룹과 비 조사 그룹으로 나누어 실험을 시행하였고 결과를 MTT assay로 확인하였다. 살아있는 세포의 농도를 반영 한 흡광도를 측정하는 MTT assay 법은 대량의 샘플들을 Microplaste reader(VERSA MAX; 590 nm)를 이용하여 간단, 신속하고 객관성 있게 판독 할 수 있어 세포 독성 및 세포 증식 검색법으로 널리 사용되고 있다.
대상 데이터
- 본 기기에 사용된 마이크로 컨트롤러는 ATmegal28로 제어신호를 입력받아 53 개의 I/O 라인을 통해 해당 모듈의 On/Off, LED 광 모듈의 출력 조절 및 현재의 동작 상태를 표시해주는 LCD Display 등에 대한 전반적인 제어가 가능하 도록 구성하였다. 기기의 핵심 부분 중 하나인 LED 드라이버는 광 출력 조절을 위해 TLC5941 을 채용하였으며, 다수의 LED에 정격 전류를 공급하 기 위해 기기의 출력 채널마다 2 개의 TLC5941을 사용하였다. LED 광 모듈부는 8x12로 배열하여 최대 96 개의 LED를 구성할 수 있도록 설계하였 으며, 광 모듈부의 D-sub를 이용, 탈착 형태로 제 작하여 선택 파장의 제어가 가능하도록 하였다.
- 본 기기에 사용된 마이크로 컨트롤러는 ATmegal28로 제어신호를 입력받아 53 개의 I/O 라인을 통해 해당 모듈의 On/Off, LED 광 모듈의 출력 조절 및 현재의 동작 상태를 표시해주는 LCD Display 등에 대한 전반적인 제어가 가능하 도록 구성하였다. 기기의 핵심 부분 중 하나인 LED 드라이버는 광 출력 조절을 위해 TLC5941 을 채용하였으며, 다수의 LED에 정격 전류를 공급하 기 위해 기기의 출력 채널마다 2 개의 TLC5941을 사용하였다.
- Rat의 태아 피부에서 추출한 조직 세포를 633 nm LED의 지속파(CW)를 사용, 10 mW/cn?로 60분간 광조사 하였다. 실험 시 세포 배양에 사용한 시약 은 FBS (Fetal Bovine Serum, GibcoBRL, UK) 과 DMEMCDulbeco' s Modified Eagle's Medium, GibcoBRL, UK), L-Glutamin (GibcoBRL, UK) 혼합 배지를 사용하였다. 실험에는 Passage 6의 세포를 사용하였으며 기존의 배지를 제거한 후 PBS (GibcoBRL, UK) 용액으로 2회 세척하고 Trypsin- EDTA (GibcoBRL, UK)를 사용, 5분간 인큐베이 션하여 섬유성 단백질을 분해시켜 채취하여 원심 분리를 통해 세포 회수 후 1 X 1()5개씩 분주하였 다.
- 실험에 사용된 실험동물은 250-2S) g의 Sprague- Dawley Rat(SD-Rat) 수컷으로 생후 8주 된 성체 를 사용하였으며 실험 기간 동안 전용 사료와 음 수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 상처를 만들기 위해 세보플루란(sevoflurane) 호흡마취제 를 사용하여 마취한 후, 등의 털을 제거하고 피부 를 노출시켜 지름 1 cm 크기의 원형으로 피부 전 층을 제거하였다.
데이터처리
- 상처를 만들기 위해 세보플루란(sevoflurane) 호흡마취제 를 사용하여 마취한 후, 등의 털을 제거하고 피부 를 노출시켜 지름 1 cm 크기의 원형으로 피부 전 층을 제거하였다. 633 nm LED 광원이 상처 치유 에 미치는 영향을 확인하기 위해 자체 개발한 광 조사기를 사용하였으몌 10], 광을 조사하지 않은 조직 샘플 1개와 광을 조사한 조직 샘플 1개씩을 1개 그룹으로 하여 총 4개 그룹으로 나누어 실험 후 studenfs T test를 사용하여 통계처리 하였다. 상처 유발 24 시간 이후부터 광 조사를 시행할 Rat에 하루 1 시간씩 9 일 동안 광을 조사하였고 표 2에 광을 조사한 그룹의 실험 조건을 나타냈다.
이론/모형
- 633 nm LED 광조사가 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 피부 세포를 조사군과 비조 사군으로 나누어 실험을 하였으며 증식률의 차이 를 확인하기 위해 MTT Assay를 사용하였다. MTT Assay는 MTT Tetrazolium염 이 탈수소 효 소 작용에 의해 비수용성의 MTT Formazan으로 환원되는 미토콘드리아의 능력을 이용한 측정법으 로 MTT Formazan의 흡광도를 측정하여 세포의 증식률 분석이 가능하며, 방사성 동위 원소를 사용 하지 않아 안전하고 간편하며 신속한 비교가 가능 한 장점을 가지고 있다.
성능/효과
- 광조사 조직들과 비조사 조직들의 조직절편의 현미경 관찰을 통해 육아조직의 수복을 확인한 결 과를 그림 4에 나타냈다. 4개 그룹의 조직들을 측 정한 결과 633 nm LED를 조사한 그룹의 상처 크 기는 평균 2, 107 例로 LED를 조사하지 않은 그룹 의 평균값인 2, 428 例보다 더 작아 상처 수복이 더 빠르게 이루어졌음을 알 수 있었다. 또한 T-test를 사용하여 통계학적으로 유의성을 확인한 결과 유 의확률(P.
- 수복 결과에 가장 많은 차이를 보이는 그룹 2의 조직절편 이미지를 그림 5에 나타냈다. 633 nm LED 광을 조사하지 않은 조직의 경우 피부가 재 생되지 않은 피부결손의 직선거리가 평균 3, 461 um 로 초기 상처에 비해 약 65 % 정도 상처 부위가 축소된 것이 확인되었으나 633 nm LED 광을 조 사한 Rat의 경우에는 현미경 관찰 시 피부결손 거 리가 평균 2, 054 um로 80 % 정도의 상처 수복을 보여 광을 조사하지 않은 그룹보다 조사한 그룹이 상처 수복이 더 빠른 것을 확인할 수 있었다.
- 살아있는 세포의 농도를 반영 한 흡광도를 측정하는 MTT assay 법은 대량의 샘플들을 Microplaste reader(VERSA MAX; 590 nm)를 이용하여 간단, 신속하고 객관성 있게 판독 할 수 있어 세포 독성 및 세포 증식 검색법으로 널리 사용되고 있다. MTT assay로 세포의 증식률 을 판정한 결과 광 조사 그룹의 피부 조직 세포가 비 조사 그룹의 피부 조직 세포보다 높은 증식을 보였다. 또한, 피부 상처에 633 nm LED 광원이 미치는 효과를 검증하기 위하여 실험동물의 둥에 지름 1 cm 크기의 원형으로 피부를 전층 제거하여 9 일 동안 광조사를 하며 변화를 관찰하였다.
- 그림 3에 LED 조사군과 비조사군의 홉광도를 비교한 결과를 나타냈다. Tetrazolium염인 MTT 는 생 세포에서만 청자색의 Formazan으로 환원이 되므로 그래프에서와 같이 광을 조사한 그룹이 광 을 조사하지 않은 그룹보다 세포의 증식이 더 활 발히 일어난 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과. 광 조사를 시행한 조직들 이 광을 조사하지 않은 조직들에 비해 실험기간 동안 상처 부위의 상피 세포화가 유의성 있게 빠 르고 양호하게 이루어 졌음을 평균 상처 수복율과 T-test를 통하여 확인할 수 있었다.
- 4개 그룹의 조직들을 측 정한 결과 633 nm LED를 조사한 그룹의 상처 크 기는 평균 2, 107 例로 LED를 조사하지 않은 그룹 의 평균값인 2, 428 例보다 더 작아 상처 수복이 더 빠르게 이루어졌음을 알 수 있었다. 또한 T-test를 사용하여 통계학적으로 유의성을 확인한 결과 유 의확률(P. value)의 값이 p<0.053- 유의성 있게 피 부 상처의 치유가 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 수복 결과에 가장 많은 차이를 보이는 그룹 2의 조직절편 이미지를 그림 5에 나타냈다.
- 상처 유발 후 각 그룹별 광조사 조직들과 비조 사 조직들의 상처 수복에 대하여 관찰한 결과 육 안으로는 광조사 그룹과 비조사 그룹이 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 상처 치유에 대한 피부재생 의 육안 소견보다 정확한 결과를 확인하기 위해 조직학적 검사를 시행하였다.
후속연구
- 633 nm LED 광원을 상처에 조사하였을 때 수축, 상피화 형성 촉진 등 상처 치유에 유익한 것으로 추정되지만 상처의 치유는 상처의 부위, 정도, 종류 에 따라 다르며, 같은 크기와 깊이의 상처라도 감 염 여부 둥 외부 영향에 의해 결과가 상이해질 수 있어 보다 많은 연구가 필요할 것으로 예상된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.