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문제 정의
- 18) 본 연구에서는 우선 in vitro assay 방법으로 최종당화 산물 생성 저해효능을 검증해 보았다. 최종당화산물 생성 억제 효능은 최종당화산물 생성 억제제로 알려진 아미노구아니딘(aminoguanidine; AG)의 최종당화산물 생성 50% 억제 농도(50% inhibition concentration, IC50) 값을 기준으로 효능 정도를 결정하였으며, Table I에서 보는 바와 같이 벌개미취 지상부의 에탄올추출물인 AKE의 최종당화산물 생성저해 효능을 알아본 결과, 아미노구아니딘의 IC50 값 (72.
제안 방법
- 19) 본 실험에서는 STZ로 유발한 당뇨쥐 신장에서 최종 당화산물 중 가장 많이 알려진 CML의 축적과 RAGE 발현 변화를 관찰하였다. 이미 선행 연구에서 AKE 투여전과 투여 9주 후 혈당을 측정한 결과 AKE 투여는 혈당 감소에 유의성 있는 효능이 없음을 보고하였다.
- 20) 또한 최종당화산물 수용체 중 신호전달이 가장 많이 연구되어 있는 RAGE(receptor for AGEs)는 신장의 사구체와 신세뇨관 상피세포에서도 많이 발현되며 CML과도 상호작용하여 다양한 세포신호 기전에 중요한 매개체로 알려져 있다. 21) AKE가 STZ 유발 당뇨병성 신증 모델 rat의 사구체에서 CML의 축적에 미치는 영향 과 RAGE의 발현변화를 평가하기 위해 각 군에 대한 면역 조직화학 염색 및 이미지 분석을 시행하였다. Fig.
- 이 혼합물에 시험 시료 또는 in vitro 표준 최종당화산물 생성 억제제인 아미노구아니딘을 200 μL 넣어 최종량이 1 mL이 되도록 한 후 37°C에서 반응 시켰다. 2주 동안 반응 후 spectrofluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex: 350 nm, Em: 450 nm).
- 군 분리 − 각각의 군은 정상군(Nor), 당뇨유발군(DM), 당뇨 유발군에 아미노구아니딘 투여군(DM+AG)과 당뇨유발군에 100 mg/kg AKE 투여군(DM+AKE) 총 4군으로 나누어 실험 하였다. AKE는 물에 용해시켜 매일 구강투여(5 mL/ kg) 하였으며, 총 9주간 동안 실험진행을 하였다. 9주 후 신장을 적출하여 10% 중성화 포르말린에 고정 후 파라핀에 포매되어 조직을 보관하였다.
- 0)에 담가 10분간 microwave로 처리한 다음 수세하여 비특이적 반응을 제거하기 위하여 blocking한 후, 1차 항체를 1:1,000으로 희석하여 overnight 반응 하였다. PBS 로 4회 세척한 후 labeled streptoavidin biotin(LSAB) kit (Dako, USA)를 반응한 후 DAB로 발색하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.
- 혈중 및 요중 CML 생성 억제 효능 − 부검시 실험동물의 혈액을 채혈하고 부검하루 전 대사케이지에서 16시간 동안 소변을 수집한 후 실험에 사용할 때까지 -80°C에서 보관 후 CML 농도 측정에 사용하였다. Rat carboxymethyl lysine ELISA kit(MyBioSource, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 혈중 및 요중 CML의 농도를 흡광도로 측정하여 값의 평균을 결과로 하였다.
- 군 분리 − 각각의 군은 정상군(Nor), 당뇨유발군(DM), 당뇨 유발군에 아미노구아니딘 투여군(DM+AG)과 당뇨유발군에 100 mg/kg AKE 투여군(DM+AKE) 총 4군으로 나누어 실험 하였다.
- 가 되었을 뿐 벌개미취에 대한 생리활성에 관련된 연구는 아직 미비한 실정이다. 그러므로 본 실험에서는 벌개미취 추출물을 이용하여 당뇨 1형 동물모델의 신장에 최종당화산물의 생성 및 교차결합 억제 효능을 검증하였다.
- 실험동물의 사육 및 당뇨유발 − 실험동물은 오리엔트㈜ (성남, 대한민국)에서 구입 하였으며 실험진행은 다음과 같다. 동물은 일주일의 충분한 적응기를 거친 후 몸무게 180- 200 g(6주령) Sprague-Dawley(SD) rat을 사용하였고, 적응기가 끝난 후 16시간 절식을 시키고 0.1 M citrate buffer(pH 4.5)에 용해한 streptozotocin(STZ)을 60 mg/kg을 복강 일회 주사 하였다. 복강투여 일주일이 지난 후 절식 상태에서 혈당을 측정하여 3.
- 8배 우수한 것으로 나타났다. 벌개미취 추출물 역시 또한 최종당 화산물은 콜라겐과 같은 세포외기질 단백질과 비가역적 교차결합하여 세포내에 축적하게 되는데, AKE가 최종당화산물과 콜라겐의 비가역적 교차결합을 억제하는지를 알아보기 위하여 최종당화산물 교차결합의 억제 효능을 in vitro assay에서 평가 하였다. Fig.
- 최종당화산물 교차결합 억제 효능평가 − Forbes의 실험방법을 변형하여 실시하였다.
- 추출 및 시료조제 − 벌개미취 지상부(줄기, 잎, 꽃; 2.5 kg)를 음건·분쇄한 후 80% 에탄올로 실온에서 3일간 3회 반복하여 추출하였다.
- 혈중 및 요중 CML 생성 억제 효능 − 부검시 실험동물의 혈액을 채혈하고 부검하루 전 대사케이지에서 16시간 동안 소변을 수집한 후 실험에 사용할 때까지 -80°C에서 보관 후 CML 농도 측정에 사용하였다.
대상 데이터
- 5)에 용해한 streptozotocin(STZ)을 60 mg/kg을 복강 일회 주사 하였다. 복강투여 일주일이 지난 후 절식 상태에서 혈당을 측정하여 3.5 mg/mL 이상인 것을 선택하여 무작위로 분배하여 실험에 사용 하였다.
- 실험동물의 사육 및 당뇨유발 − 실험동물은 오리엔트㈜ (성남, 대한민국)에서 구입 하였으며 실험진행은 다음과 같다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 벌개미취는 2007년 08월 충청남도 공주시 의당면 일대에서 채집하였고, 경원대학교 생명과학과 김주환교수의 감정을 거친 후 사용하였으며, 증거 표본은 한국한의학연구원의 표본실에 보관 중이다.
- ”하였다. 즉, 예로부터 벌개미취는 토혈, 천식, 폐결핵성 기침, 감기, 만성기관지염, 이담, 이뇨, 지갈에 전통적으로 사용하였다. 9,10)
데이터처리
- 통계처리 − 각 분석 값은 평균±표준편차로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 GraphPad Prism 4.0 software (Graph pad, CA, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) followed by Tukey’s multiple comparison test를 이용하여 p<0.01 수준에서 실시하였다.
성능/효과
- 1) 당뇨병성 신증 환자의 신장내 CML 침착이 증가하며, CML은 단백질의 물리화학적 성질을 변화시켜 세포내 단백질, 지질이나 세포외 기질을 변성시켜 교차결합 또는 세포 최종당화산물 수용체와의 반응을 통해 세포신호전달에 중요한 전사인자(NF-κB)를 활성화 시킨다.
- 이미 선행 연구에서 AKE 투여전과 투여 9주 후 혈당을 측정한 결과 AKE 투여는 혈당 감소에 유의성 있는 효능이 없음을 보고하였다. 11) 최종당화산물의 화학적 구조는 다양하지만 체내에서 발견되는 최종당화산물의 주된 형태는 CML이며, 대부분의 최종당화산물들의 생성경로가 불명확한 것에 비하여 CML은 생성경로가 비교적 구체적으로 밝혀져 있다. 20) 또한 최종당화산물 수용체 중 신호전달이 가장 많이 연구되어 있는 RAGE(receptor for AGEs)는 신장의 사구체와 신세뇨관 상피세포에서도 많이 발현되며 CML과도 상호작용하여 다양한 세포신호 기전에 중요한 매개체로 알려져 있다.
- 22) 체내에는 혈액을 구성하고 있는 물질인 헤모글로빈, LDL과 혈중 알부민 등은 모두 단백질로 이루어져 있으며, 대동맥 혈관의 탄력을 유지시켜주는 물질인 콜라겐 역시 단백질로 이루어져 있어 혈액 중 포도당이나 포도당 분해산물과 당화가 진행되어 최종당화산물을 생성하여 그 자체만으로도 활성산소의 발생량을 증가시켜 원활한 노폐물의 배출을 방해하기 때문에 혈액이 정체되어 빛깔이 탁해지고 끈끈한 점성물질로 변하고, 결국은 다른 단백질과 교차결합을 이루어 혈관벽이 뻣뻣해지고 탄력 상실을 초래하여 고유 기능이 저하되어 미세혈관 합병증인 망막병증이나 신증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 23,24) 이 와 같이 혈액과 소변 안에 최종당화산물의 농도는 당뇨병성 신증의 중등도를 예측할 수 있는 가장 중요한 인자로 임상적으로도 중요함이 보고되었다.
- Fig. 1에 나타낸 바와 같이 AKE의 최종당화산물 교차결합 50% 억제 농도 IC50 값은 0.27± 0.45 mg/mL으로 아미노구아니딘의 교차결합 억제 효능 1.99±0.12 mg/mL 보다 7.4배 우수한 것 나타났다.
- 11,19,25) 본 연구에서도 혈액과 소변 내 최종당화산물인 CML의 농도를 측정하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이, 소변과 혈액의 CML을 측정한 결과, 뇨와 혈중 CML은 정상군에 비해 당뇨유발군에서 현저히 증가하였으며, 아미노구아니딘 또는 AKE 투여군에서 이를 유의성 있게 억제하였다.
- 2A). 또한 이미지 분석상 사구체내 CML 축적 면적은 정상군에 비해 당뇨유발군은 2.3배 증가하였고, 아미노구아니딘 투여군과 AKE 투여군에서는 당뇨유발군에 비해 각각 1.70, 1.85배 억제 하였다(Fig. 2B). RAGE 발현 변화 역시 정상군에 비해 당뇨유발군에서 사구체내 RAGE 발현이 증가를 관찰하였으며, AKE와 아미노구아니딘 투여군에서는 RAGE 발현을 억제하였다(Fig.
- 여과 후 40°C에서 감압 농축하여 벌개미취 에탄올 추출물(A. koraiensis extract; AKE)을 303 g을 얻었다.
- 4배 우수한 것 나타났다. 이러한 결과는 AKE가 최종당화산물 생성을 저해 하는 효능뿐만 아니라 이미 조직내에 생성되어 축적된 최종당화산물이 세포내 단백질과의 비가역적 교차결합을 막는 억제제로써의 효능도 갖추고 있으며, 이는 양성 대조군인 아미노구아니딘과 비교하여 월등히 우수한 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 이미지 분석 결과 사구체내 RAGE 발현 양성 면적은 정상군과 당뇨유발군이 각각 11.16±1.39과 20.30±4.37으로 2배 증가 하였으며, 아미노구아니딘 투여군은 10.74±2.90, AKE 투여군은 12.97±4.31로 RAGE 발현을 억제하였다(Fig. 3B).
- 최종당화산물 생성 억제 효능은 최종당화산물 생성 억제제로 알려진 아미노구아니딘(aminoguanidine; AG)의 최종당화산물 생성 50% 억제 농도(50% inhibition concentration, IC50) 값을 기준으로 효능 정도를 결정하였으며, Table I에서 보는 바와 같이 벌개미취 지상부의 에탄올추출물인 AKE의 최종당화산물 생성저해 효능을 알아본 결과, 아미노구아니딘의 IC50 값 (72.12 μg/mL)보다 AKE의 IC50값(18.74 μg/mL)이 3.8배 우수한 것으로 나타났다.
후속연구
- 본 실험에서는 벌개미취가 최종당화산물 생성 억제 효능뿐만 아니라 최종당화산물 교차결합 억제제로서의 효능이 있음을 밝혔다. 이상의 결과를 토대로 벌개미취가 당뇨합병증 예방 및 치료제 후보 물질로서 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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