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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 하늘타리의 종자, 열매, 뿌리의 각 부위별 추출물을 이용하여 자유라디컬 소거능 및 LPS로 염증을 유도한 Raw 264.7 대식세포에서 염증 매개 인자인 NO와 염증관련 단백질인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현에 미치는 영향을 비교하여 하늘타리의 부위별 항산화 활성과 항염증 효과를 규명하고자 하였다.
- 따라서 본 실험의 결과는 하늘타리 추출물이 100 μg/mL 농도에서 10% 이하의 세포독성을 보이는 것은 인체에 유해한 독성물질을 함유하지 않는다고 보고, 다음 실험을 진행하였다.
가설 설정
- 5) 또한 LPS는 monocytes, 대식세포 등의 세포에서 염증성 효소인 cyclooxygenase-2(COX-2)를 과발현 시킨다고 알려져 있다.6) 이와 같이 염증반응에서 iNOS와 COX2의 발현과 NO의 생성은 면역세포의 염증인자이다. 한편, 대식세포는 염증 생성 과정 중 인체 조직과 세포에 손상을 주는 reactive oxygen species(ROS) 등의 자유 라디컬을 생성한다.
- 1)ND means no detected.
- 2)RC50 means that the concentration of samples for 50% inhibition.
제안 방법
- 세포배양액 100 μl와 동량의 Griess 시약(2% sulfanilamide in distilled water and 0.2% naphthyletylene-diamine dihydrochloride in 4% phosphorid acid)을 혼합하여 37°C에서 15분간 반응시킨 뒤, ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, LPS 처리군을 대조군으로 하여 상대적인 NO 발현양을 나타내었다.
- Nitric Oxide (NO) 함량 측정 − 배양 배지의 NO 농도는 Marcocci의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
- 세포독성 측정 − 세포독성이 없는 농도에서 부위별 하늘타리 추출물의 항염증 효과를 알아보기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용해 세포 생존율을 측정하였다.
- ABTS[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical 소거능 측정 − 추출물의 ABTS radical 소거능은 Re 등의 방법을 변형하여 측정하였다.
- DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)radical 소거능 측정 − 추출물의 DPPH radical 소거능은 Dietz 등의 방법을 약간 변형하여 측정하였다.
- 4 M DPPH 용액을 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하는 방법을 사용하였다. DPPH radical 소거능은 DMSO에 시료를 녹여 실험군으로 사용하였고, DMSO를 대조군으로하여 대조군에 대한 라디컬 소거능을 백분율로 나타냈다.
- Total RNA의 추출 및 RT-PCR − Raw 264.7 세포(1×106 cells/well)를 37°C, 5% CO2 조건에서 12시간 배양시킨 후 부위별 추출물을 세포생존율에 영향을 미치지 않는 농도(0, 50 그리고 100 μg/ml)로 처리하고 1시간 뒤 LPS(1 μg/ml)로 염증인자의 발현을 유도하였다.
- 19) 하늘타리 종자의 헥산 및 메탄올 추출물과 열매, 뿌리의 메탄올 추출물을 50 및 100 μg/ml의 농도에서 DPPH 라디컬과 ABTS 라디컬 소거 능력을 조사하였다.
- 하늘타리 부위별 추출물의 항산화 활성 측정 − 하늘타리의 종자, 열매 및 뿌리(Fig. 1) 추출물의 항산화 능력을 조사하기 위하여 DPPH 라디컬 및 ABTS 라디컬 소거활성을 조사하였다.
- 1 μg의 RNA와 one-step RT-PCR kit(Quiagen, Germany)를 이용하여 cDNA 합성을 하였고, 염증 유전자 발현을 알아보기 위해 PCR를 실시하였다.
- PCR 조건은 95°C에서 5분, 95°C에서 30초(denaturing), 55°C에서 30초(annealing), 72°C에서 40초(primer extension)으로 40 cycle이다. PCR 산물은 GelStarTM(Nucleic acid gel stain, Lonza, USA)를 첨가한 1.2% agarose gel에 100 V에서 25분간 전기영동 후 자외선으로 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 Quantity One(Bio-Rad Laboratories, CA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
- 세포독성을 나타내지 않는 농도인 50, 100 μg/mL에서 하늘타리 부위별 추출물을 이용하여 항염증 활성을 측정하였다.
- 세포 생존율에 미치는 하늘타리 부위별 추출물의 효과 − 하늘타리 부위별 추출물에서 세포독성이 나타나지 않는다면 천연 항산화제 및 항염증제로의 이용 가능성이 높을 것으로 판단되어 MTT assay를 통한 세포독성에 관한 연구를 진행하였다(Fig. 2).
- 세포독성을 나타내지 않는 농도인 50, 100 μg/mL에서 하늘타리 부위별 추출물을 이용하여 항염증 활성을 측정하였다. 하늘타리 부위별 추출물의 항염증 효과를 비교하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)로 염증반응을 유도한 Raw 264.7 대식 세포 내 염증의 지표인 nitric oxide(NO) 생성 억제효과를 조사하였다(Fig. 3). 어떤 약물도 처리하지 않은 대조군에 비해 LPS로 유도된 NO 생성에 의해 유의적으로 활성화된 Raw 264.
- 하늘타리의 부위별 추출물의 항염증 활성에 대한 작용기 전을 알아보기 위하여 체내 염증발현효소인 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX-2)의 mRNA 발현을 조사하였다(Fig. 4). 대식세포에 의해 유도되는 iNOS로부터 과량 발현되는 NO는 자가 면역 질환, 염증성 질환 및 패혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다.
- 대식세포에 의해 유도되는 iNOS로부터 과량 발현되는 NO는 자가 면역 질환, 염증성 질환 및 패혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 체내에 과도한 NO를 생성하는 iNOS의 발현에 대한 하늘타리의 부위별 추출물의 영향을 조사하기 위해 RT-PCR을 시행하였다. LPS로 자극한 Raw 264.
대상 데이터
- 재료 및 시약 − 본 실험에 사용된 하늘타리의 종자, 열매 및 뿌리는 2014년 제주도 서귀포 남원읍에서 재배된 것으로 2015년 대구 약령시에서 구입하였고, 세명대학교 강신호 교수에 의해 동정되었다.
- Raw 264.7 대식세포는 10% FBS, 100 unit/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 37°C, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
- 세포배양 − 실험에 사용된 세포주 Raw 264.7 대식세포는 한국세포주은행(KCLB, Korean Cell Line Bank)에서 분양받아 사용하였다.
- DMEM 배지 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)는 Gibco-Life Technologies(Rockville, MD, USA), FBS(fetal bovine serum)는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 primer sequence는 iNOS(494 bp); 5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCA-3′(sense) and 5′-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGC-3′(anti-sense), COX-2(696bp); 5′-CACTACATCCTGACCCACTT-3′(sense) and 5′-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3′(anti-sense) 및 β-actin(490bp); 5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3'(sense) and 5'-GGAGGAAGAGGATGCGGCAG-3'(anti-sense)를 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리 − 각 군간의 통계적 유의성은 SPSS(Version 12.0, SPSS INC, USA)을 이용하여 Student t-test 및 ANOVA 법으로 검증하여 p 값이 0.05 미만을 유의한 것으로 보았다.
이론/모형
- 24시간 배양한 후 배양배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 뒤 TRIzol reagent를 처리하였다. RNA의 추출은 Invitrogen(USA)사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 수행하였다. 1 μg의 RNA와 one-step RT-PCR kit(Quiagen, Germany)를 이용하여 cDNA 합성을 하였고, 염증 유전자 발현을 알아보기 위해 PCR를 실시하였다.
성능/효과
- p>염증반응이란 물리적 작용, 화학적 물질, 세균 감염 등의 외부 자극에 의해 신체 조직이 손상되었을 때 면역세포가 다양한 염증매개 물질을 분비하여 정상으로 회복 유지 시키려는 생체조직의 국소적인 방어기전이다.1) 염증반응과 관련하여 혈관이 확장되어 감염부위로 혈류량이 증가함에 따라 혈관의 투과성이 향상되고, 면역 세포들이 손상된 조직으로 이동하면서 발열, 통증, 홍반 및 부종 등의 증상이 나타난다.2) 염증반응에 관여하는 주요 세포는 대식세포로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화된다.
- 1) 염증반응과 관련하여 혈관이 확장되어 감염부위로 혈류량이 증가함에 따라 혈관의 투과성이 향상되고, 면역 세포들이 손상된 조직으로 이동하면서 발열, 통증, 홍반 및 부종 등의 증상이 나타난다.2) 염증반응에 관여하는 주요 세포는 대식세포로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화된다.3)
- 국내의 경우 특히 울릉도, 제주도 등의 산기슭이나 숲속에서 자생하는 것으로 알려져 있다.8) 쥐참외 하늘타리, 과루등, 하늘수박, 천선지루라고도 하며 땅속에 고구마 같은 괴근(천화분)이 있다. 열매는 10월에 익으며 장과로 둥글고 지름 5~7 cm 정도로 오렌지색으로 익고, 종자는 연한 다갈색이다.
- ABTS 라디컬 소거실험에서는 50 μg/ml 농도에서 종자의 메탄올 추출물의 ABTS 라디컬 소거능이 가장 우수하였고(72.4±6.29%), 열매의 메탄올 추출물(6.8±0.21%), 뿌리의 메탄올 추출물(1.0±0.78%) 순으로 항산화 활성이 감소하였다.
- 종자, 열매, 뿌리의 메탄올 추출물 그리고 종자의 핵산 추출물 순으로 50 μg/ml의 농도에서 각각 45.6±0.5%, 37.5±0.4%, 24.5±0.5% 그리고 21.3±0.6%의 NO 생성 억제효과를 나타냈다.
- 실험 결과, Raw 264.7 대식세포의 생존율은 부위와 관계없이 100 μg/ml의 농도에서 대조구인 DMSO 처리구에 비해 약 90% 이상의 생존율을 나타내어 세포독성이 매우 약함을 알 수 있었다.
- 78%) 순으로 항산화 활성이 감소하였다. 종자, 열매 및 뿌리의 메탄올 추출물은 농도에 비례하여 ABTS 라디컬 소거 활성이 증가하였다. 이는 뿌리가 열매의 항산화 활성 보다 우수하다는 Zhoh 22) 등의 결과와 상반된 결과를 보이고 있다.
- DPPH 라디컬 소거능과 ABTS 라디컬 소거능을 이용하여 하늘타리 부위별 추출물의 항산화 활성을 조사한 결과, 종자의 메탄올 추출물이 가장 우수한 항산화 활성을 보여주었다.
- 하늘타리 추출물의 처리에 의하여 iNOS의 발현량이 유의적으로 감소하였으며 특히 종자와 과실의 메탄올 추출물 50 μg/mL에서의 iNOS의 발현은 LPS를 처리하지 않은 무 처리구와 비슷한 수준으로 회복되었다.
- 증가한 COX-2는 하늘타리 추출물 처리에 의해 현저히 감소하는 경향을 나타냈으며 종자와 열매의 메탄올 추출물 50 μg/ml의 농도에서 LPS를 처리하지 않은 그룹과 비슷한 수준으로 회복하였다.
- 하늘타리 추출물의 처리에 의하여 iNOS의 발현량이 유의적으로 감소하였으며 특히 종자와 과실의 메탄올 추출물 50 μg/mL에서의 iNOS의 발현은 LPS를 처리하지 않은 무 처리구와 비슷한 수준으로 회복되었다. 본 연구 결과 iNOS mRNA 저해효과와 NO 생성 억제효과가 유사한 경향을 나타내었다. LPS에 의해 과발현된 iNOS에 의해 NO 생성이 촉진된다는 연구결과에 따라22) 이는 하늘타리 추출물에 의한 iNOS의 발현억제가 NO의 생성억제에 영향을 끼치는 것을 알 수 있다.
- 증가한 COX-2는 하늘타리 추출물 처리에 의해 현저히 감소하는 경향을 나타냈으며 종자와 열매의 메탄올 추출물 50 μg/ml의 농도에서 LPS를 처리하지 않은 그룹과 비슷한 수준으로 회복하였다. 하늘타리 뿌리 추출물의 경우에는 COX-2 mRNA 발현이 대조군 대비 50% 수준으로 감소함을 확인하였다. 종자의 헥산 추출물의 경우, NO 생성 억제효과와 iNOS 발현 억제효과는 미비하였으나, COX-2의 발현을 현저하게 저해하는 활성을 보여주었다.
- 하늘타리 뿌리 추출물의 경우에는 COX-2 mRNA 발현이 대조군 대비 50% 수준으로 감소함을 확인하였다. 종자의 헥산 추출물의 경우, NO 생성 억제효과와 iNOS 발현 억제효과는 미비하였으나, COX-2의 발현을 현저하게 저해하는 활성을 보여주었다. 하늘타리 종자유에는 punicic acid와 같은 유기 지방산이 함유되어 있다고 보고되고 있으며.
- 하늘타리의 부위별 항산화 및 항염증 효과를 조사한 결과, 하늘타리 종자에서 가장 우수한 항산화 활성이 나타났다. NO 생성 억제효과는 종자, 열매, 꽃의 메탄올 추출물 그리고 종자 헥산 추출물 순으로 나타났으며, NO 생성 억제능에 상관적으로 iNOS의 mRNA 발현을 억제시키는 경향을 보여주었다.
- 하늘타리의 부위별 항산화 및 항염증 효과를 조사한 결과, 하늘타리 종자에서 가장 우수한 항산화 활성이 나타났다. NO 생성 억제효과는 종자, 열매, 꽃의 메탄올 추출물 그리고 종자 헥산 추출물 순으로 나타났으며, NO 생성 억제능에 상관적으로 iNOS의 mRNA 발현을 억제시키는 경향을 보여주었다. 이러한 상관성은 부위별 추출물들이 iNOS의 발현을 억제함으로써 NO의 생성을 억제하였음을 보여준다.
- 이러한 상관성은 부위별 추출물들이 iNOS의 발현을 억제함으로써 NO의 생성을 억제하였음을 보여준다. 하늘타리 종자 및 열매 추출물들은 또한 우수한 COX2 저해효과를 보여주었다. NO와 iNOS 저해효과가 낮았던 종자의 헥산 추출물에서도 높은 COX-2 저해효과가 나타났다.
- 실험 결과, Table I에서와 같이 하늘타리 추출물 시료들 중에서 종자의 메탄올 추출물이 50 μg/ml 농도에서 DPPH 라디컬을 10.4±0.07% 저해하였고, 100 μg/mL 농도에서 25.5±1.13% 저해함을 보여 농도가 증가할수록 항산화 효과가 증가한다고 보고한 Noh 등20)의 연구 결과와 마찬가지로 농도의존적으로 약한 DPPH 라디컬 소거활성이 있음을 확인하였다.
후속연구
- NO와 iNOS 저해효과가 낮았던 종자의 헥산 추출물에서도 높은 COX-2 저해효과가 나타났다. 하늘타리 종자와 열매의 메탄올 추출물과 종자의 헥산 추출물의 항염증 활성에 대한 본 연구결과는 향후 하늘타리 항염증 연구의 기초자료로 활용될 수 있을 것이다. 또한 추후 산업적 응용도 가능하므로 활성 분획물들에 대한 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 하늘타리 종자와 열매의 메탄올 추출물과 종자의 헥산 추출물의 항염증 활성에 대한 본 연구결과는 향후 하늘타리 항염증 연구의 기초자료로 활용될 수 있을 것이다. 또한 추후 산업적 응용도 가능하므로 활성 분획물들에 대한 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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