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문제 정의
- 風池(GB20) 釣藤散 약침이 중대뇌동맥 폐쇄로 유발된 국소 뇌손상 흰쥐 모델에 미치는 영향을 실험적으로 알아보고자Morris watermazetest를 이용한 행동학적 변화와 신경세포 손상에 대한 신경화학적 변화를 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이에 저자는 風池(GB20) 釣藤散 약침이 허혈성 국소 뇌손상으로 유발된 흰쥐의 인지장애에 미치는 영향을 알아보고자 Morris water maze test와 면역조직화학법을 이용하여 공간 기억과 신경 보호 작용에 미치는 효과를 관찰한 후 다음과 같은 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 釣藤散에서 釣鉤藤이 차지하는 효과를 검증하려는 실험이 시도되면서 Watan abe 등15)은 釣藤散이 가지고 있는 항치매효과는 부분적으로 釣鉤藤이 가진 인돌계 성분과 페놀성 성분들의 작용에 의한 것이라는 결과를 발표했다. 이와 같이 선행된 연구들의 실험항목이 본 연구와 상이하여 각 항목의 비교 평가에 어려움이 있으나 상기 연구들의 결과를 바탕으로 釣藤散 약침이 기억장애 및 인지장애 개선에 유효할 것으로 사료되어 본 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 의 방법에 따라 좌측중대뇌동맥을 폐색시켜 유발하였다. 80 % O2에 5 % isoflurane(Hana Pharm, Korea)을 이용하여 흰쥐에게 흡입마취를 유도한 후 2 % isoflurane으로 마취를 계속 유지하였다. 좌측 중대뇌동맥을 폐색하기 위하여 경부 정중선을 따라 피부를 절개하고 흉골설골근과 저작근 사이에 좌측 총경동맥을 노출시켜 좌측 내경동맥의 원위부를 최대한 확보한 후 미세혈관 클립(WPI, USA)을 이용하여 결찰하고, 좌측 내경동맥과 intraluminal filament(직경 0.
- Morris water maze test는 총 6차례 이루어졌으며, 각 차수마다 훈련을 4회 실시하였다. 수조를 4등분하여 1차부터 6차까지 platform을 같은 4분면에 두었으며, 수조 테두리에 방위를 표시하여 매 회마다 30초 간격을 두고 수영 시작 지점을 다르게 하였다.
- Morris water maze test를 위하여 원형수조(117×50 cm)에 물을 채우고, 물의 온도는 24 ± 1℃의 적정 온도를 유지하고, 실험 공간의 밝기는 전체가 어두운 환경에서 4분면을 정하여 간접 조명하고, 수조 안에 platform(20 × 32 cm)을 설치하였다.
- 다음 날 뇌를 급속 냉동한 후 뇌 조직의 hippocampus부위를 30㎛의 두께로 잘랐다. PBS로 조직을 몇 차례 씻고 xylene(5 min), 100 % alcohol(2 min), 95% alcohol(1min), 70% alcohol(1min), D.W.(2min) 순으로 옮겨 담아 탈지, 탈수를 시킨 다음 cresyl violet buffer(5min)로 염색을 하였다. 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp.
- PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95 ℃에서 300초 동안 pre-denaturation, 94℃에서 40초 동안 melting, 55℃에서 40초 동안 annealing, 72 ℃에서 90초 동안 extension하는 과정을 34회 반복 수행한 후 마지막 cycle에서 72 ℃에서 600초 동안 extension 단계를 거치고 primer(senseprimer : 5'-TCCAATCTGCTCCTCC TACC-3', antisense primer :5'-CAACGATGAAGAACTCTGCG-3')를 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 mGluR5 유전자증폭을 시행하였다.
- Water maze test는 자침 및 약침 처치 다음 날 실시하였으며 총 6차에 걸쳐 시행하였고(Fig. 1), test는 흰쥐를 원형수조에 넣고 platform을 찾아가기까지 걸린 거리를 측정하였다.
- 風池(GB20)는 occipital bone의 아랫면에서 흉쇄유돌근과 승모근 사이의 오목한 곳으로 인체 상응하는 부위로 정하였으며8), 자침 및 약침 시술은 2일에 1회씩 총 6회에 걸쳐 이루어졌고(Fig. 1), 약침 시술의 경우 insulin syringe(31 G × 8 ㎜, BD, USA)를 이용하여 風池(GB20) 양측에 각각 20 ㎕의 약침을 주입하였다.
- 각 실험군은 대조군에 비하여 α= 0.05 수준(p ＜ 0.05)과 α= 0.001 수준(p ＜ 0.001)에서 유의성을 검정하였다.
- 군 분리는 Ischemia 유발 후 무처치한 대조군(Con, n = 5)과 Ischemia 유발 후 風池(GB20) 釣藤散 약침은 시행하지 않고 혈위 단자만 시행한 침자군(Acu, n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 釣藤散 약침 11.43 ㎎ / 250 g / 40 ㎕을 시술한 PA-J1군(n = 5), Ischemia 유발 후 風池(GB20) 釣藤散 약침 2.29 ㎎ / 250 g / 40 ㎕을 시술한 PA-J2군(n = 5)의 총 4군으로 분리하였다.
- 모든 실험이 끝난 직후 흰쥐를 Urethane(25 %, Sigma, USA)으로 마취시킨 후, 0.9 % saline 200 ㎖에 이어 phosphate buffer로 준비한 5 % formalin 용액(fixative) 800 ㎖로 심장을 통해 관류하였다. 처음 고정액 200 ㎖는 2분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 800 ㎖는 천천히 관류하였다.
- 1), test는 흰쥐를 원형수조에 넣고 platform을 찾아가기까지 걸린 거리를 측정하였다. 본 실험에서는 1차에서 1회 훈련을 제외하고 2회 훈련부터 4회 훈련을 단기 기억으로 보았고 2차에서 6차까지의 각각의 훈련을 장기 기억으로 보았다.
- 본 실험에서는 자침 및 風池(GB20)釣藤散 약침을 시술한 다음 날 훈련을 시행하여 총 6차례에 걸친 훈련에서 각 차수별로 총 4회의 훈련이 이루어졌으며, 정 등42)의 연구를 참고하여 1차 훈련 시 1회를 제외한 2회에서 4회까지의 훈련을 단기 기억으로 보았고, 2차에서 6차까지의 각각의 훈련을 장기기억으로 구별하여 평가하였다.
- 분리된 total RNA 5 ㎍과 2.5 ㎕ Oligo (dT), DEPC-treated water를 RT premix(Bioneer, Korea)에 넣어 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)를 이용하여 50 ㎕ cDNA를 합성하고 PCR 증폭을 위한 template로 사용하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) (sense primer : 5'-ACTCCATCACCATCTTCCAG-3', antisense primer :5'-CCTGCTTTCACCACCTCCTTG-3')를 internal control로 사용하였다.
- Morris water maze test는 총 6차례 이루어졌으며, 각 차수마다 훈련을 4회 실시하였다. 수조를 4등분하여 1차부터 6차까지 platform을 같은 4분면에 두었으며, 수조 테두리에 방위를 표시하여 매 회마다 30초 간격을 두고 수영 시작 지점을 다르게 하였다. 한 차수에서 4회 반복 수영하는 과정 중 1분 안에 찾지 못하면 위치를 기억할 수 있도록 platform 위에 올려 15초 동안 주위를 관찰하도록 하여 인지를 시키고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다.
- 1M PB로 발색을 정지시켰다. 슬라이드를 dehydtration한 후에 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측정하였다.
- (2min) 순으로 옮겨 담아 탈지, 탈수를 시킨 다음 cresyl violet buffer(5min)로 염색을 하였다. 염색이 끝난 조직은 광학현미경(Nikon, Japan)을 사용하여 40배로 확대하여 관찰하였고, 신경세포의 밀도를 Scion image program(Scion Corp. MD, USA)을 이용하여 측정하였다.
- 원심분리로 얻어진 상층액과 500 ㎕의 isopropanol(sigma, USA)을 첨가하여 실온 상태에서 5분 동안 방치한 후 RNA pellet을 얻기 위하여 4 ℃, 14,000 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리로 생긴 pellet에 냉장보관된 70 % ethanol과 함께 DEPC를 넣어 4 ℃, 7,500 rpm에서 5분간 원심분리 후 pellet만 남기고 모두 제거하고, 남은 ethanol은 실온에서 5분간 방치해 건조시킨 다음 DEPC-treated water에 녹여 spectrophotometer(Eppendorf, Germany)에서 OD260값을 읽어 RNA의 순도 및 농도를 정량하였다.
- PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 95 ℃에서 300초 동안 pre-denaturation, 94℃에서 40초 동안 melting, 55℃에서 40초 동안 annealing, 72 ℃에서 90초 동안 extension하는 과정을 34회 반복 수행한 후 마지막 cycle에서 72 ℃에서 600초 동안 extension 단계를 거치고 primer(senseprimer : 5'-TCCAATCTGCTCCTCC TACC-3', antisense primer :5'-CAACGATGAAGAACTCTGCG-3')를 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 mGluR5 유전자증폭을 시행하였다. 이렇게 증폭된 mGluR5의 DNA를 Greenview nucleic acid gel stain(IO Rodeo, 1 : 10,000)을 포함한 1.5 % agarose gel상에서 0.5x TBE buffer(80 mM Tris-HCL, 80 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.3)로 100 V에서 전기 영동시켜 관찰한 후 Image Station(Kodak, Japan)을 이용하여 촬영하였으며, Alphaease FC StandAlone Software(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 상등액은 rotary evaporator(Buchi, Netherlands)로 수분을 증발시켜 100 ㎖로 감압 농축하였으며, 농축된 약침액을 동결건조기(Samwon, Korea)로 -70 ℃에서 동결건조시켜 최종적으로 얻어진 약침액의 양은 16 g이었다. 이를 소분하여 생리식염수로 희석하였으며, pH meter(ORION, USA)로 각각 pH 7산도를 조절하여 조제한 후 냉장보관하였다가 시술에 사용하였다.
- 이와 같은 기존 연구를 토대로 風池(GB20)釣藤散 약침이 국소 뇌손상 유발 흰쥐 모델의 인지장애에 미치는 영향을 알아보고자Morris water maze test를 시행하고hippocampus CA1 부위의 mGluR5, Density of cresylviolet-stained neural cell, ChAT 발현 정도를 관찰하였다.
- 자침 및 약침 시술은 MCAO를 시행한 3일 후에 시작하였는데, 흰쥐에 뇌허혈을 유발하고 재관류하였을 때 해마의 CA1 부위의 신경세포들이 재관류 72시간 후에 죽기 시작한다는 것과39) 시술 직후에 흰쥐가 받는 스트레스를 고려하였다.
- 80 % O2에 5 % isoflurane(Hana Pharm, Korea)을 이용하여 흰쥐에게 흡입마취를 유도한 후 2 % isoflurane으로 마취를 계속 유지하였다. 좌측 중대뇌동맥을 폐색하기 위하여 경부 정중선을 따라 피부를 절개하고 흉골설골근과 저작근 사이에 좌측 총경동맥을 노출시켜 좌측 내경동맥의 원위부를 최대한 확보한 후 미세혈관 클립(WPI, USA)을 이용하여 결찰하고, 좌측 내경동맥과 intraluminal filament(직경 0.28 mm roundedtip)사이의 출혈을 방지하고자 6-0silksuture를 이용하여 좌측 총경동맥 근위부 및 좌측 외경동맥 분지부를 결찰하였다. 좌측 총경동맥의 좌측 외경동맥과 좌측 내경동맥 분지부에서 1 ㎝정도 되는 좌측 내경동맥의 원위부에 미세혈관 가위(WPI, USA)를 사용하여 혈관을 절제하고, 미세혈관 클립 또한 제거한 후 좌측 내경동맥 내로 20 ㎜의 치과 인상제(Durelon, Germany)가 발린 intraluminal filament를 좌측 내경동맥상의 구멍에 intraluminal filament가 faint resistance의 느낌이 느껴질 때까지 약 17 ㎜ 깊이로 부드럽게 삽입한 후, 그 끝이 좌측 중대뇌동맥까지 도달하도록 하여 좌측 중대뇌동맥 부위에 국소 허혈을 유발하였다.
- 28 mm roundedtip)사이의 출혈을 방지하고자 6-0silksuture를 이용하여 좌측 총경동맥 근위부 및 좌측 외경동맥 분지부를 결찰하였다. 좌측 총경동맥의 좌측 외경동맥과 좌측 내경동맥 분지부에서 1 ㎝정도 되는 좌측 내경동맥의 원위부에 미세혈관 가위(WPI, USA)를 사용하여 혈관을 절제하고, 미세혈관 클립 또한 제거한 후 좌측 내경동맥 내로 20 ㎜의 치과 인상제(Durelon, Germany)가 발린 intraluminal filament를 좌측 내경동맥상의 구멍에 intraluminal filament가 faint resistance의 느낌이 느껴질 때까지 약 17 ㎜ 깊이로 부드럽게 삽입한 후, 그 끝이 좌측 중대뇌동맥까지 도달하도록 하여 좌측 중대뇌동맥 부위에 국소 허혈을 유발하였다. 출혈을 방지하기 위하여 좌측 내경동맥상의 intraluminal filament 삽입 부위를 가볍게 묶은 후 절개된 피부를 봉합하였다.
- 좌측 총경동맥의 좌측 외경동맥과 좌측 내경동맥 분지부에서 1 ㎝정도 되는 좌측 내경동맥의 원위부에 미세혈관 가위(WPI, USA)를 사용하여 혈관을 절제하고, 미세혈관 클립 또한 제거한 후 좌측 내경동맥 내로 20 ㎜의 치과 인상제(Durelon, Germany)가 발린 intraluminal filament를 좌측 내경동맥상의 구멍에 intraluminal filament가 faint resistance의 느낌이 느껴질 때까지 약 17 ㎜ 깊이로 부드럽게 삽입한 후, 그 끝이 좌측 중대뇌동맥까지 도달하도록 하여 좌측 중대뇌동맥 부위에 국소 허혈을 유발하였다. 출혈을 방지하기 위하여 좌측 내경동맥상의 intraluminal filament 삽입 부위를 가볍게 묶은 후 절개된 피부를 봉합하였다.
- 수조를 4등분하여 1차부터 6차까지 platform을 같은 4분면에 두었으며, 수조 테두리에 방위를 표시하여 매 회마다 30초 간격을 두고 수영 시작 지점을 다르게 하였다. 한 차수에서 4회 반복 수영하는 과정 중 1분 안에 찾지 못하면 위치를 기억할 수 있도록 platform 위에 올려 15초 동안 주위를 관찰하도록 하여 인지를 시키고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다. 1분 안에 platform을 찾아 올라가면 그 순간부터 15초 동안 platform에서 주위를 관찰하도록 두었고, 30초 동안 쉬도록 한 뒤 다시 훈련을 실시하였다.
대상 데이터
- 동신대학교 부속 순천한방병원에서 구입한 釣藤散의 구성약물(Table 1)을 1첩(28 g)당 1,000 ㎖의 1차 증류수와 함께 100 ℃에서 열수 추출하고 원심분리기(Vision 6000CFI, Korea)로 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액은 rotary evaporator(Buchi, Netherlands)로 수분을 증발시켜 100 ㎖로 감압 농축하였으며, 농축된 약침액을 동결건조기(Samwon, Korea)로 -70 ℃에서 동결건조시켜 최종적으로 얻어진 약침액의 양은 16 g이었다.
- 체중이 약 210 g∼230 g인 Sprague Dawley계의 수컷 흰쥐들을 항온항습 환경의 사육장(실내온도 24±1 ℃, 습도 60 ± 5%)내에서 고형사료(pellet, Samyang, Korea)와 물을 충분히 공급하며 1주일 이상 실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험 기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취시켰다.
데이터처리
- 모든 측정값은 Excel statistic program(Microsoft, USA)을 이용하여 평균치와 표준오차(mean±standard error)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS(SPSS 12.0, USA)를 사용하여 비모수적 방법으로 Mann-Whitney U test를 시행하였다.
이론/모형
- 국소 뇌허혈은 Longa 등16)의 방법에 따라 좌측중대뇌동맥을 폐색시켜 유발하였다. 80 % O2에 5 % isoflurane(Hana Pharm, Korea)을 이용하여 흰쥐에게 흡입마취를 유도한 후 2 % isoflurane으로 마취를 계속 유지하였다.
- 전자의 경우 측부순환이 없고 정상체온에서 4~ 8분 내에 비가역적인 신경세포 파괴가 발생하지만29), 후자의 경우 전뇌에만 제한적인 허혈 상태를 유발하기 때문에 후뇌의 혈류가 영향을 받지 않아 호흡과 체순환에 영향을 주지 않는 장점이 있어28) 본 연구에서는 이를 이용하였다.
성능/효과
- 1. Morris water maze test에서 釣藤散 약침이 단기 기억에 미치는 영향은 Acu군의 2회차에서 유의한 감소를 보였고, 장기기억에 미치는 영향은 PA-J2군의 4차에서 유의한 감소를 보였다.
- 2. mGluR5 발현 정도는 대조군에 비해 PA-J1군에서 유의하게 증가하였다.
- 3. Cresyl violet 염색을 통한 신경세포 손상 방어 효과는 대조군에 비해 PA-J1군과 PA-J2군에서 유의하게 증가하였다.
- 4. ChAT 발현 정도는 대조군에 비해 PA-J1군과 PAJ2군에서 유의하게 증가하였다.
- 風池(GB20) 釣藤散 약침이 hippocampal CA1 부위의 cresyl violet으로 염색된 신경세포의 밀도에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 20.4 ± 0.61(density), Acu군은21.3±0.51(density), PA-J1군은 25.3±1.44(density), PA-J2군은 24.8 ± 0.87(density)을 각각 나타내었다.
- 風池(GB20) 釣藤散 약침이hippocampal CA1 부위의 ChAT 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 37.3 ± 0.78(density), Acu군은 37.7 ± 0.92(density), PA-J1군은 53.9 ± 0.84(density), PA-J2군은 57.4 ± 0.81(density)을 각각 나타내었다.
- 風池(GB20) 釣藤散 약침이hippocampal CA1 부위의 mGluR5 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군은 103.1 ± 10.31(× 1000 O.D.), Acu군은 124.8 ± 4.37(×1000O.D.),PA-J1군은 132.5±4.14(×1000O.D.), PA-J2군은 117.4 ± 6.61(× 1000 O.D.)을 각각 나타내었다.
- 각 군의 해마 CA1 부위를Cresyl violet에 염색한 후 관찰한 결과, 대조군에 비해 모든 군에서 신경세포의 밀도가 증가하는 것을 볼 수 있었으며 특히 PA-J1군, PA-J2군에서 유의하게 증가하여(p ＜ 0.001) 風池(GB20) 釣藤散 약침이 뇌허혈로 유발된 신경세포 손상에 대한 방어 효과가 있는 것으로 생각된다.
- 각 군의 해마 CA1부위 ChAT 발현 정도를 관찰한 결과 모든 군에서 대조군보다 증가하였고, PA-J1군과 PA-J2군에서 유의한 증가를 보여(p ＜ 0.001) 風池(GB20) 釣藤散 약침이 ChAT 활성을 증가시키고 콜린성 신경섬유의 기능회복을 돕는 작용이 있을 것으로 판단된다.
- 단기 기억에서는 PA-J1군의 4회 차를 제외한 모든 군에서 platform에 도달하기까지 거리가 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였으며, 그중에서도 유의한 감소를 보인 것은 Acu군의 2회 차로(p ＜ 0.05) 단기 기억에 대해서는 釣藤散 약침보다 침을 시술한 군의 효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
- 본 연구에서 Acu군과 PA-J1군, PA-J2군 모두에서 대조군에 비해 mGluR5의 밀도가 증가하는 경향을 보이며, 그중에서도 PA-J1군에서 유의한 증가가(p ＜ 0.05) 관찰되어 風池(GB20) 釣藤散 약침이 mGluR5의 발현을 통한 신경 보호 및 신경조직형성 효과를 유도한 것으로 보인다.
- 본 연구에서는Morris water maze를 이용한 행동학적 변화에 있어 단기 기억 및 장기기억의 유의한 회복이 관찰되었으며, mGluR5 발현, 신경세포 밀도, ChAT 발현에 유효한 영향이 있는 것으로 나타나 風池(GB20)釣藤散 약침이 뇌허혈 상태에서 신경세포 손상을 방어하는 신경 보호 효과와 아세틸콜린을 증가시키는 효능으로 인지장애를 개선하는데 유효할 것이라고 사료된다.
- 장기 기억에서는 대조군에 비해 Acu군과 PA-J1군, PA-J2군의 모든 차수에서 platform에 도달하기까지 거리가 감소하는 경향을 보여 風池(GB20)자침 및 釣藤散 약침 시술이 장기 기억 회복에도 효과를 보였고, 특히 PAJ2군의 4차에서 유의한 감소가(p ＜ 0.05) 일어나 장기기억에 있어서는 風池(GB20)釣藤散 약침의 효과가 가장 우수했다. 다만 4차 훈련까지는 모든 군에서 platform에 도달하는 거리가 꾸준하게 감소하는 모습을 보이다가 이후의 훈련에서는 오히려 증가하는 양상을 나타내는데, 이러한 결과는 Diamond 등43)의 연구 결과에 근거하여 장기간 동안 스트레스를 유발하는 환경에 노출된 것을 원인으로 해마가 손상되어 오히려 공간 기억 능력이 저하된 것이 아닌가 생각된다.
후속연구
- 본 연구에서는Morris water maze를 이용한 행동학적 변화에 있어 단기 기억 및 장기기억의 유의한 회복이 관찰되었으며, mGluR5 발현, 신경세포 밀도, ChAT 발현에 유효한 영향이 있는 것으로 나타나 風池(GB20)釣藤散 약침이 뇌허혈 상태에서 신경세포 손상을 방어하는 신경 보호 효과와 아세틸콜린을 증가시키는 효능으로 인지장애를 개선하는데 유효할 것이라고 사료된다. 다만 단기 기억에 있어서는 Acu군에서 보다 우수한 효과를 보였는데 이는 혈관성 치매 환자의 단기 기억장애에 침치료를 활용할 수 있는 근거가 될 것으로 생각된다. 또한 장기 기억에서는 PA-J2군, mGluR5발현에서는PA-J1군, 신경세포의 밀도와 ChAT 발현에서는 PA-J1군과 PA-J2군 모두에서 유의미한 결과가 나타나 각 항목에 대한 유의성과 風池(GB20) 釣藤散 약침의 농도가 비례하는지 여부를 밝히기에는 어려움이 있었다.
- 또한 장기 기억에서는 PA-J2군, mGluR5발현에서는PA-J1군, 신경세포의 밀도와 ChAT 발현에서는 PA-J1군과 PA-J2군 모두에서 유의미한 결과가 나타나 각 항목에 대한 유의성과 風池(GB20) 釣藤散 약침의 농도가 비례하는지 여부를 밝히기에는 어려움이 있었다. 앞으로 국내에서도 활발한 연구가 이루어져 본 연구의 한계를 보완하고 임상에서 釣藤散을 활용할 수 있는 실험적 근거가 마련되길 기대한다.
- 뇌허혈 상태에서는Ach의 방출 감소, ChAT-면역반응성 소실 등으로 해마 CA1구역 추체신경세포의 지연성 신경세포사가 유도된다52) .이를 근거로 해마에서 ChAT의 활성을 증가시키면 아세틸콜린의 합성을 촉진시켜 기억력 및 인지장애를 개선하는 효과가 있을 것으로 사료된다.
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