본 연구에서 국립원예특작과학원 인삼특작부 추출물은행에서 분양받은 에탄올 추출물 시료(시료번호: 4)인 선이질풀(Geranium krameri)에 대한 다양한 생리활성을 조사하여 기능성소재 응용가능성을 검토하였다. 선이질풀 추출물은 멜라노마 세포에 대하여 낮은 세포독성을 나타냈다. 세포독성이 거의 없는 농도에서 선이질풀 추출물 처리 시 산화방지 활성($IC_{50}$, $8.72{\mu}g/mL$) 및 B. subtilis, E. coli, C. albicans에 대한 항균활성이 우수하게 나타났으며 타이로시네이즈 활성저해($IC_{50}$, $456.86{\mu}g/mL$) 및 멜라닌 함량 저하($IC_{50}$, $50.35{\mu}g/mL$)를 보여주었다. 또한, B16F10 세포에서 선이질풀 추출물 농도 의존적으로 타이로시네이즈 발현이 억제되었으며, 이는 선이질풀 추출물이 직접적인 타이로시네이즈 활성저해 및 세포 내 타이로시네이즈 발현을 억제시킴으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 미루어볼 때 선이질풀 추출물은 피부미백 소재 등 피부개선 효과를 지닌 기능성 화장품에 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
본 연구에서 국립원예특작과학원 인삼특작부 추출물은행에서 분양받은 에탄올 추출물 시료(시료번호: 4)인 선이질풀(Geranium krameri)에 대한 다양한 생리활성을 조사하여 기능성소재 응용가능성을 검토하였다. 선이질풀 추출물은 멜라노마 세포에 대하여 낮은 세포독성을 나타냈다. 세포독성이 거의 없는 농도에서 선이질풀 추출물 처리 시 산화방지 활성($IC_{50}$, $8.72{\mu}g/mL$) 및 B. subtilis, E. coli, C. albicans에 대한 항균활성이 우수하게 나타났으며 타이로시네이즈 활성저해($IC_{50}$, $456.86{\mu}g/mL$) 및 멜라닌 함량 저하($IC_{50}$, $50.35{\mu}g/mL$)를 보여주었다. 또한, B16F10 세포에서 선이질풀 추출물 농도 의존적으로 타이로시네이즈 발현이 억제되었으며, 이는 선이질풀 추출물이 직접적인 타이로시네이즈 활성저해 및 세포 내 타이로시네이즈 발현을 억제시킴으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 미루어볼 때 선이질풀 추출물은 피부미백 소재 등 피부개선 효과를 지닌 기능성 화장품에 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
We investigated the application of functional materials by examining a variety of physiological activities of Geranium krameri extract obtained from the National Institute of Horticultural and Herbal Science. Geranium krameri extract had a low cytotoxicity against murine melanoma B16F10 cells. At co...
We investigated the application of functional materials by examining a variety of physiological activities of Geranium krameri extract obtained from the National Institute of Horticultural and Herbal Science. Geranium krameri extract had a low cytotoxicity against murine melanoma B16F10 cells. At concentrations with little or no cytotoxicity, Geranium krameri extract showed high DPPH radical scavenging activity ($IC_{50}$, $8.72{\mu}g/mL$) and anti-microbial activities against Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Candida albicans. Additionally, Geranium krameri extract inhibited tyrosinase activity ($IC_{50}$, $456.86{\mu}g/mL$) and decreased melanin content ($IC_{50}$, $50.35{\mu}g/mL$). The treatment of B16F10 cells with Geranium krameri extract suppressed the protein expression of tyrosinase in a dose-dependent manner. These findings suggest that Geranium krameri extract inhibits melanin synthesis in murine melanoma B16F10 cells by suppressing intracellular tyrosinase expression, as well as directly inhibits tyrosinase activity simultaneously.
We investigated the application of functional materials by examining a variety of physiological activities of Geranium krameri extract obtained from the National Institute of Horticultural and Herbal Science. Geranium krameri extract had a low cytotoxicity against murine melanoma B16F10 cells. At concentrations with little or no cytotoxicity, Geranium krameri extract showed high DPPH radical scavenging activity ($IC_{50}$, $8.72{\mu}g/mL$) and anti-microbial activities against Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Candida albicans. Additionally, Geranium krameri extract inhibited tyrosinase activity ($IC_{50}$, $456.86{\mu}g/mL$) and decreased melanin content ($IC_{50}$, $50.35{\mu}g/mL$). The treatment of B16F10 cells with Geranium krameri extract suppressed the protein expression of tyrosinase in a dose-dependent manner. These findings suggest that Geranium krameri extract inhibits melanin synthesis in murine melanoma B16F10 cells by suppressing intracellular tyrosinase expression, as well as directly inhibits tyrosinase activity simultaneously.
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문제 정의
이와 같이 전통적으로 이용이 되어 왔음에도 불구하고 과학적으로 활성메커니즘에 대한 연구가 부족하며 특히, 미백활성 등 피부개선 효과를 비롯한 기능성 화장품소재에 활용하기 위한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 선이질풀 잎 추출시료를 가지고 산화방지 및 항균활성 시험을 비롯한 생리활성 시험을 실시하였으며 또한 미백시험을 비롯한 피부효능 개선 시험 및 멜라닌 생성 억제에 대한 메커니즘을 조사하여 기능성 화장품 소재로서의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
본 연구에서 국립원예특작과학원 인삼특작부 추출물은행에서 분양받은 에탄올 추출물 시료(시료번호: 4)인 선이질풀(Geranium krameri)에 대한 다양한 생리활성을 조사하여 기능성소재 응용가능성을 검토하였다. 선이질풀 추출물은 멜라노마 세포에 대하여 낮은 세포독성을 나타냈다.
제안 방법
멜라닌(Melanin) 합성 주요 단계에 관여하는 타이로시네이즈 저해활성 측정은 효소 작용 결과 형성되는 DL-β-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) chrome을 비색법에 의해 측정하는 Masamoto 등의 방법(10)을 변형하여 측정하였다. 기질로서 5 mM DL-DOPA용액 0.2 mL, 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8) 0.2 mL 및 시료용액 0.5 mL의 혼합액에 mushroom 타이로시네이즈(Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO, USA) 0.1 mL (2,000 unit/mL)을 첨가하여37oC에서 10분간 반응시킨 다음 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 아래 식에 따라 타이로시네이즈 저해활성을 산출하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID50)을 계산하여 타이로시네이즈 저해활성 정도를 표현하였다.
처리된 세포 용해물을 4oC 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 획득한 상층액은 분석을 위해 −70oC에서 보관하였다. 단백질 농도는 단백질분석키트(protein assay kit) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 각 20 µg 단백질량에 해당되는 시료를 10%SDS-PAGE에서 전기이동 하여 분리 한 후, 폴리바이닐리텐 플루오린화물(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막에 옮겨 주었다.
이후 10분 간격으로 TBST로 5회 세척하고 enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로검출하였다. 단백질밴드는 광이미지시스템(photo-image system)(Molecular Dynamics, Uppsala, Sweden)기기를 사용하여 정량하였다.
멜라노마 세포를 alphamelanocyte stimulating hormone (α-MSH)첨가로 멜라닌 생성을 유도한 후, 상기 세포독성 실험에서 관찰된 추출물시료 농도로 처리하고 48시간 동안 37oC CO2 배양기에서 배양하였다.
멜라닌 정량은 Hosoi 등의 방법(11)을 변형하여 사용하였다. 즉 24 well plate에 2×104 cells/well로 멜라노마 세포를 분주하였고, 100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)으로 멜라닌 생성을 유도한 후, 선이질풀 추출물시료를 처리하여 48시간 동안 37oC CO2배양기에서 배양하였다.
멜라닌(Melanin) 합성 주요 단계에 관여하는 타이로시네이즈저해활성 측정은 효소 작용 결과 형성되는 DL-β-3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) chrome을 비색법에 의해 측정하는 Masamoto 등의 방법(10)을 변형하여 측정하였다.
산화방지효과는 [1-(시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]×100의 계산식에 의해 전자공여능(%)으로 나타내었으며, 대조구는 시료 대신 메탄올을 첨가하였고, positive control로 아스코브산(ascorbic acid)를 사용하였다.
선이질풀 추출물에 대한 세포독성 실험 측정에서 독성이 나타나지 않은 농도를 처리하여 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하였다(Fig. 5). 대조군 대비하여 10, 50, 100 µg/mL의 GKE 농도에서 각각 29.
선이질풀 추출물에 대한 항균활성 측정을 위하여 추출물 시료를 최종농도가 100 µg/mL가 되도록 처리한 후, 시간별로 각각 시험군에 대한 time curve를 작성하였다(Fig. 3).
선이질풀 추출물에 의한 타이로시네이즈 단백질 발현에 미치는 영향을 B16F10 세포에 독성이 없는 농도에서 측정하였다(Fig.6). B16F10 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후,α-MSH와 GKE 모두 처리 하지 않은 대조군와 대비하였을 때,α-MSH와 함께 각각 무처리, 10, 50, 및 100 µg/mL의 GKE 농도에서 각각 148, 131, 126, 및 112%로 농도 의존적으로 타이로시네이즈 발현이 억제되었으며, 100 µg/mL GKE 농도에서 대조군과 통계적으로 차이가 없이 저하되는 것을 확인하였다.
시료의 항산화효과는 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl,Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 라디칼에 대한 전자공여능(electron donating ability, EDA)으로 측정하였다(9). 즉, 0.
타이로시네이즈는 구리를 포함한 효소로서 멜라닌 형성에 중요한 역할을 한다. 이러한 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해하기 위한 타이로시네이즈 저해활성을 측정하기 위하여 선이질풀 추출물에 대한 mushroom 유래의 타이로시네이즈 저해활성을 관찰하였다(Fig. 4). 추출물시료 10, 50, 100 µg/mL의 경우, 각각 8.
이후 10분 간격으로 TBST로 5회 세척하고 2차 항체(rabbit anti-mouse IgGHRP: 1:5000, Santa Cruz Biotechnology, Carlsbad, CA, USA)로1시간 동안 반응시켰다. 이후 10분 간격으로 TBST로 5회 세척하고 enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로검출하였다. 단백질밴드는 광이미지시스템(photo-image system)(Molecular Dynamics, Uppsala, Sweden)기기를 사용하여 정량하였다.
즉, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이는지 알아보기 위해 각각 균주 배양액에 선이질풀 추출물의 처리농도가 100 µg/mL 이 되도록 처리하여 일정 시간별로 배양액을 채취하였다.
즉, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이는지 알아보기 위해 각각 균주 배양액에 선이질풀 추출물의 처리농도가 100 µg/mL 이 되도록 처리하여 일정 시간별로 배양액을 채취하였다. 채취한 배양액을 십진희석법으로 희석하고 각각 균주평판배지에 접종하여 배양한 후, 생성되는 콜로니의 수를 측정하고 CFU/mL로 환산하였다.
여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH (10% DMSO) 200 µL를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도값을 측정하였다. 추출물을 처리하지 않은 시료군을 대조군으로 하고 결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서 의 결과 수치로 50% 멜라닌 생성 저해 농도(ID50)을 계산하여 멜라닌 생성 저해 활성을 표현하였다.
항균효과는 time-curve를 작성하여 확인하였다. 즉, 시간별로 항균작용이 어떤 변화를 보이는지 알아보기 위해 각각 균주 배양액에 선이질풀 추출물의 처리농도가 100 µg/mL 이 되도록 처리하여 일정 시간별로 배양액을 채취하였다.
대상 데이터
미국 세포주은행(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받은 멜라노마 세포(murine melanomaB16F10)를 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, Gibco,Waltham, MA, USA)이 포함된 dulbecco’s Modified Eagle’smedium (DMEM)에서 배양하고 24 well plate에 2×104 cells/well의 농도로 세포를 접종한 후, 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
데이터처리
모든 실험은 독립적으로 3회 반복 시행하고 실험결과는 평균±표준평균오차로 표기하였으며, 통계적 유의성은 Student’s t-test로 검토하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 유의하다고 판단하였다.
선이질풀 추출물에 의한 타이로시네이즈 단백질 발현을 분석하기 위하여 western blot을 시행하였다. 멜라노마 세포를 alphamelanocyte stimulating hormone (α-MSH) 첨가로 멜라닌 생성을 유도한 후, 상기 세포독성 실험에서 관찰된 추출물시료 농도로 처리하고 48시간 동안 37oC CO2 배양기에서 배양하였다.
성능/효과
B16F10 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후,α-MSH와 GKE 모두 처리 하지 않은 대조군와 대비하였을 때,α-MSH와 함께 각각 무처리, 10, 50, 및 100 µg/mL의 GKE 농도에서 각각 148, 131, 126, 및 112%로 농도 의존적으로 타이로시네이즈 발현이 억제되었으며, 100 µg/mL GKE 농도에서 대조군과 통계적으로 차이가 없이 저하되는 것을 확인하였다.
GKE 각각에 대한 같은 시료농도 대조구인 아스코르브산과 비교 하였을 때는 소거활성이 다소 낮았으나, 100 µg/mL의 추출물 농도에서는 대조구와 거의 같은 라디칼 소거활성을 보였다(91.30%).
추출물을 처리하지 않은 시료군을 대조군으로 하고 결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서 의 결과 수치로 50% 멜라닌 생성 저해 농도(ID50)을 계산하여 멜라닌 생성 저해 활성을 표현하였다.
산화방지효과는 [1-(시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]×100의 계산식에 의해 전자공여능(%)으로 나타내었으며, 대조구는 시료 대신 메탄올을 첨가하였고, positive control로 아스코브산(ascorbic acid)를 사용하였다. 각 처리농도에서 의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID50)을 계산하여 DPPH 소거 활성 정도를 표현하였다.
결과는 %로 환산하였다. 각 처리농도에서 의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID50)을 계산하여 세포 독성 정도를 표현하였다.
1 mL (2,000 unit/mL)을 첨가하여37oC에서 10분간 반응시킨 다음 475 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 아래 식에 따라 타이로시네이즈 저해활성을 산출하였다. 각 처리농도에서의 결과 수치로 50% 저해 농도(ID50)을 계산하여 타이로시네이즈 저해활성 정도를 표현하였다.
대조군 대비하여 10, 100, 250, 500 µg/mL의 GKE농도에서 각각 0, 3.58, 19.80, 56.24% 세포독성을 나타냈으며,50% 세포독성을 나타내는 농도(ID50)는 469.26 µg/mL로 나타났다.
대조군 대비하여 10, 50, 100 µg/mL의 GKE 농도에서각각 29.11, 47.50, 78.31%의 멜라닌 생성 억제 활성을 확인하였다.
3). 대조군의 경우 시간이 경과함에 따라 균의 증식에 변함이 없었으나 추출물 시료 처리 경우는 배양 12시간 경과 후, Bacillus subtilis, Escherichiacoli, Candida albicans 각각 대조군에 대하여 46.15, 53.84, 32.96%의 증식 억제가 확인되었다. 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인 할 수 있었다.
따라서 이후의 실험은 독성이 거의 없는 100 µg/mL 이하의농도에서 진행하였으며 멜라닌 생성 억제효과로서 보고된 해양천연물 미역쇠 추출물(12)의 경우에도 세포독성이 거의 없는 농도가 100 µg/mL 이하인 것과 비교하였을 때 천연물시료로서 독성이 없는 안전한 물질로 판단된다.
또한, 50% 멜라닌 저해활성 농도는 50.35 µg/mL이였으며 다른 천연소재 중 미백활성 효과로서 보고된 바(18) 있는 백합뿌리추출물 100 µg/mL의 경우 74% 멜라닌 생성 저해활성을 보이는것을 고려하면 멜라닌 생성 저해 활성이 매우 우수함을 의미한다.
35 µg/mL)를 보여주었다. 또한, B16F10 세포에서 선이질풀 추출물 농도 의존적으로 타이로시네이즈 발현이 억제 되었으며, 이는 선이질풀 추출물이 직접적인 타이로시네이즈 활성저해 및 세포 내 타이로시네이즈 발현을 억제시킴으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때 선이질풀 추출물은 피부미백 소재 등 피부개선 효과를 지닌 기능성 화장품에 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
즉, 시험재료에 있어서 피부미백효과는 멜라닌 생성 저해에 따른 타이로시네이즈 저해효과가 나타나야 한다. 본 연구의 선이질풀 추출물의 경우도 멜라닌 저해 활성이 우수하였으며 이에 따른 타이로시네이즈 저해활성도 높았다.
세포독성이 거의 없는 농도에서 선이 질풀 추출물 처리 시 산화방지 활성(IC50, 8.72 µg/mL) 및 B. subtilis, E. coli, C. albicans에 대한 항균활성이 우수하게 나타났으며 타이로시네이즈 활성저해(IC50, 456.86 µg/mL) 및 멜라닌 함 량 저하(IC50, 50.35 µg/mL)를 보여주었다.
96%의 증식 억제가 확인되었다. 즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인 할 수 있었다. 또한, 소라쟁이(15) 추출물의 경우 본 시험균들에 대하여 항균활성이 보고된 바와 같이 향후 화장품 소재 개발 시 유통기한 확보에 따른 천연방부제로서의 소재개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 생각한다(16).
즉, 모든 시험균의 증식이 억제됨을 확인 할 수 있었다. 또한, 소라쟁이(15) 추출물의 경우 본 시험균들에 대하여 항균활성이 보고된 바와 같이 향후 화장품 소재 개발 시 유통기한 확보에 따른 천연방부제로서의 소재개발 가능성을 기대할 수 있을 것으로 생각한다(16).
선이질풀 추출물시료가 대조군 kojic acid와 비교했을 때 50% 저해활성 농도는 높게나타났으나 다른 천연소재 중 우수한 미백활성 효과로서 보고된바(17) 있는 선학초 추출물 100 µg/mL에서 26.0% 타이로시네이즈 저해활성을 보이는 것과 비교하였을 때, 향후 미백 기능성 소재로서의 활용 가능성이 높다고 생각된다.
또한, B16F10 세포에서 선이질풀 추출물 농도 의존적으로 타이로시네이즈 발현이 억제 되었으며, 이는 선이질풀 추출물이 직접적인 타이로시네이즈 활성저해 및 세포 내 타이로시네이즈 발현을 억제시킴으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로 미루어 볼 때 선이질풀 추출물은 피부미백 소재 등 피부개선 효과를 지닌 기능성 화장품에 활용하기 위한 매우 효과적인 재료가 될 수 있다고 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부 표피의 역할은?
피부는 진피와 표피로 구성되어 있으며 이중 표피는 피부 최외각에 위치하며 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되고 유지됨으로써 외부의 다양한 물리적, 화학적 및 기계적자극에 대한 방어와 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능을 한다. 또한 표피 최하층에서 지속적으로 증식하는 기저세포가각질층으로 이동하는 동안 단계적으로 형태와 기능상의 변화를거치며 형성된 각질형성세포는 일정기간이 지나면 피부에서 탈락되고, 표피 최하층으로부터 올라온 새로운 각질형성세포가 그기능을 대신하는 표피분화 또는 각화의 과정을 반복하게 된다.
각질형성세포가 생성하는 물질은?
또한 표피 최하층에서 지속적으로 증식하는 기저세포가각질층으로 이동하는 동안 단계적으로 형태와 기능상의 변화를거치며 형성된 각질형성세포는 일정기간이 지나면 피부에서 탈락되고, 표피 최하층으로부터 올라온 새로운 각질형성세포가 그기능을 대신하는 표피분화 또는 각화의 과정을 반복하게 된다.이러한 각질형성세포는 천연보습인자와 세라마이드(ceramide), 콜레스테롤과 지방산과 같은 세포 간 지방질을 형성하여 피부장벽으로서의 기능을 보유하게 된다(1).
멜라닌 생합성을 조절하는 것은?
그러나 피부표면에 과도한 멜라닌 합성과 축적은기미, 주근깨와 같은 과 색소 침착 증상이 나타나게 된다(3). 멜라닌 생성은 타이로시네이즈, 타이로시네이즈 연관 단백질-1(tyrosinase related protein-1, TRP-1), TRP-2 효소에 의해 조절되며 타이로시네이즈는 구리를 포함한 효소로서 멜라닌 형성에 중요한역할을 하고 있다(4). 타이로시네이즈는 멜라노좀내에서 타이로신(tyrosine)을 산화시켜 dihydroxyphenylalanine (DOPA)을 생성하는 타이로신 하이드록시화 효소(tyrosine hydroxylase)로서, 또한,DOPA를 산화시켜 DOPA 퀴논(quinone)을 만드는 DOPA 산화효소(oxidase)로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는 핵심 효소로작용한다(5).
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