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문제 정의
- 본 연구는 멜라닌 색소 생합성 관련 효소의 유전자 발현 조절 수준에서 그 색소 생성을 억제하는 물질을 탐색하고자 자치 (Lithospermum erythrorhizon)의 뿌리로부터 유용성 물질을 추출. 분획하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 tyrosinase 프로모터 활성 능, 세포독성 그리고 멜라닌 색소 생성 능을 조사하였다.
제안 방법
- 세포 내 유전자 도입 : B16 mouse melanoma cell을 RPMI medium 1640 평판배지에 세포수가3〜4><1。5이 되도록 접종한 후 24시간 배양한 다음, 배 양액 1 mL에 6 虬 LipofectAMINE 과 2 Ug의 total plasmid DNA를 5시간 처리 함으로써 형질 전환을 실시하였다.
- B16 mouse melanoma cell 내에 tyrosinase 프로모터가 삽입된 유전자를 도입하기 위해 LipofectAMINE(Life Te chnologies Inc.)을 이용한 다음과 같은 방법으로 stable transfection을 실시하였다.
- Plasmid DNA는 luciferase gene을 지닌 pGL2-basic vector(Promega)의 Sami site에 L5 Kb의 neomycin 저 항성 유전자를 삽입한 다음 1 Kb의 사람 tyrosinase 프로모터를 EcoRl/Kpril site에 클로닝을 하였다.
- Tyrosinase 프로모터를 도입하여 형질 전환된 B16 mouse melanoma cell은 위의 RPMI Medium 1640 완전 배지에 neomycin analogue인 Geneticin 418(200 Hg/mL)을 가한 선택배지를 이용하여 유지하였다.
- 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell을 RPMI medium 164。완전배지가 들어 있는 24 well plate에 세포 수가 well 당 6乂 10** 되게 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 그 후 각 각의 well에 지치 추출물은 10 Ug/mL, 100 Ug/mL, 500 卩 g/mL, 1 mg/mL의 농도로, 용매 분획물은 1 Ug/mL, 10 Ug/ mL, 100 Hg/mL, 500 Ug/mL의 농도로 6시간 동안 처리한 다음 luciferase 활성도를 측정하여 tyrosinase 프로모터 억제 효과를 조사하였다.
- B16 mouse melanoma cell을 RPMI medium 1640 완전배지가 들어 있는 24 well 배양접시에 세포 수가 6 X IO, 되게 접 종하여 24시간 동안 배양하였다. 그리고 모든 세포에 a -MSH< 100 pM의 농도로 전처리한 다음 지치 주줄 물을 각각 1 Ug/mL, 10 lig/mL 그리고 100 ]ig/mL의 농도로 3일 동안 처리하였다. 그.
- 멜라닌 색소 생성능은 Hosoi 등의 방법(22)을 변경하여 측정하였다. B16 mouse melanoma cell을 RPMI medium 1640 완전배지가 들어 있는 24 well 배양접시에 세포 수가 6 X IO, 되게 접 종하여 24시간 동안 배양하였다.
- 분말로 된 추출물 및 분획물 100 mg에 에탄올과 디메칠 설 퍼 옥사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 1:1로 혼합된 용매 1 mL씩을 가하여 완전히 용해시킨 후 여과하여 tyrosi nase 프로모터 활성능, 세포독성, 멜라닌 색소 생성능 측정에 이용하였다.
- 본 연구는 멜라닌 색소 생합성 관련 효소의 유전자 발현 조절 수준에서 그 색소 생성을 억제하는 물질을 탐색하고자 자치 (Lithospermum erythrorhizon)의 뿌리로부터 유용성 물질을 추출. 분획하여 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 tyrosinase 프로모터 활성 능, 세포독성 그리고 멜라닌 색소 생성 능을 조사하였다.
- 세포 내 유전자 도입을 통해 얻은 B16 mouse melanoma cel*; 형질전환 유무를 확인하기 위하여 luciferase 활성도를 측정하였다. 형질전환을 통하여 얻은 콜로니들을 trypsin- EDTA를 처 리 흐].
- 시료의 추출은 건조된 생약을 세절하여 0.1 kg씩을 취한 다음 메탄올을 가하여 실온에서 1주일 동안 정치 시 킨 후 3회 추출. 여과하였다.
- 건조 시 킨 후 분말 형태로 제조하였다. 용매 분획은 농축된 메탄올 추출물을 증류수로 현탁한 다음, 극성 도가 다른 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물을 이용하여 4개의 층으로 분획하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 농축하였다. 그리고, 이 농축물은 동결.
- 8의 25 mM tris-phosphate 완충용액으로 용해하였다. 용해된 세포들을 취하여 원심분리한 다음 얻어진 상등액에 대해 Luminometer(Lumat LB 9507, Ber- thold)를 이용하여 luciferase 활성도를 측정하였으며 lucif erase 활성 도가 가장 높게 나타난 B16 mouse melanoma cell을 선별하여 이용하였다.
- 유전자 발현 조절 수준에서 멜라닌 색소 생합성 억제물질을 탐색하고자 지치 뿌리로부터 유용성 물질을 추출. 분획하여 tyrosinase 프로모터를 지닌 B16 mouse melanoma cell에 처리한 결과 그 메탄올 추출물은 10 Pg/mL의 농도에서 약 33% 이상의 tyrosinase 프로모터 활성 억제 효과를 나타내었으며, 세포 활성 능이 100Rg/mL의 농도에서 약 108%로 매우 안전하였다.
- 형질 전환된 세포의 선별 : Stable transfection 처리 5시간 후 B16 mouse melanoma cell로부터 LipofectAMINE 시 약과 재조합된 DNA가 함유된 배지를 제거한 후 콜로니가 형성될 때까지 neomycin analogue인 Geneticin 418(600 Ug/ mL)이 들어 있는 선택배지에서 배양한 후 형질 전환된 B16 mouse melanoma cell을 선별하였다.
- 그. 후 세포들은 1 N NaOH와 10%(w/v) DMSO를 함유하고 있는 용액 1 mL를 가하여 80°C에서 2시간 동안 용해한 다음 UV/Visible spectropho- tometer를 이용하여 A470에서 흡광도를 측정한 후 단백질 mg당의 멜라닌 색소의 함량을 계산하였다. 멜라닌 색소의 함량은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
대상 데이터
- B16 mouse melanoma celKATCC CRL 6323)은 10% (w/v)의 fetal bovine serum(FBS, GibcoBRL), l%(w/v) antibiotic(Gibco BRL), 그리고 2 mM의 L-glutamine이 포함된 RPMI medium 1640(Gibco BRL) 에서 CO2 분압을 5%로 조절하여 37°C에서 배양하였으며, 세포는 36〜48시간 주기로 계대 배양하여 유지하였다.
- 본 실험에 사용한 지 치 뿌리 는 2004년 10월 광주시 내 건재상에서 구입하여 감정한 후 사용하였으며, 표준품은 전남대학교 생물학과 분자세포 생리학 실험실에 보관하였다.
이론/모형
- Then, the cells were solubilized with lysis buffer and centrifuged at 13, 000 x g for 2 ~ 3 min. The supernatants were used for luciferase assay. Values are the means of results from triplicate experiments.
- 2X104 되게 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. 그 후 지치 추출물을 각각의 well에 1 Ug/mL, 10 Ug/mL, 50 Hg/mL 그리고 100 卩g/mL의 농도로 6시간 동안 처리한 다음 Mosmann(21)의 방법에 따라 ELISA(Bio-Tek Inc.) 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다.
- 멜라닌 색소의 함량은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다. 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법(23)을 이용하여 결정하였다.
성능/효과
- 특호】, 10 Hg/mL의 동일한 농도에서 다른 추출물과 비교하였을 때 지치 추출물은 Okano(24)에 의해 보고된 대나무(Bamboo)꽃:추출물보다 효과가 낮았지만 현재 멜라닌 색소 생성 억제제로서, 알려져 있는 kojic acid와 비슷한 억제 효과를 나타내었다(25). 그러나 kojic acid는 6일 동안 처리하였을 때 나타난 결과이지 만 지치 추출물은 보다 짧은 3일 동안 처리하였을 때 거의 비슷한 효과를 나타낸 것으로 보아 지치 추출물이 kojic acid보다 우수한 효과를 지니고 있음이 증명되었다. 따라서 지치 추출물 내에는 tyrosinase 프로모터의 활성과 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 효과를 지니고 있는 성분들이 함유되어 있는 것으로 보여지며, 앞으로보다 많은 연구가 이루어진다면 멜라닌 색소 생합성 억제제로서 널리 이 용 되리라 생각되어진다.
- 이 결과를 통해서 볼 때 지 치 용매 분획물들의 tyrosinase 프로모터 활성 억제 효과는 특정 용매 분획물에 한정하지 않고 본 연구에 이용된 모든 용매 분획물에서, 그리고 10Ug/mL 이하의 저농도보다는 100 ng/mL 또는 500 Ug/mL의 고농도로 처리하였을 때 나타났다. 그러나 용매 분획물들의 억제 효과는 메탄올 추출물에 비해 감소하는 결과를 보여주었다.
- 그러나 100 Ug/mL의 고농도에서 는 tyrosinase 프로모터의 활성을 크게 억제하는 효과를 나타내었다. 그리고 물 분획물은 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol과 같은 용매 분획물들에 비해 보다 높은 농도 즉, 500 Ug/mL의 고농도에서 tyrosinase 프로모터의 활성을 억제하였다. 이 결과를 통해서 볼 때 지 치 용매 분획물들의 tyrosinase 프로모터 활성 억제 효과는 특정 용매 분획물에 한정하지 않고 본 연구에 이용된 모든 용매 분획물에서, 그리고 10Ug/mL 이하의 저농도보다는 100 ng/mL 또는 500 Ug/mL의 고농도로 처리하였을 때 나타났다.
- 따라서 지치 추출물 내에는 멜라닌 색소 생합성 관련 효소인 tyrosinase의 프로모터 활성을 억제하는 성분들이 함유되 어 있지 만 용매 분획물 형태보다는 추출물 형태로 이용하는 것이 보다 효율적이라 판단된다.
- 또한, 지치 메탄올 추출물을 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물 등의 용매로 분획하여 얻은 물질들을 형질 전환된 세포에 처리한 결과Table 1에서 보여 주듯이 용매 분획물들은 농도에 따라 차이는 있었지만 서로 유사한 경향을 보여 주었다. 즉 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol과 같은 3종류의 용매 분획물들은 세 포에 1 Ug/ mL 와 10ug/mL의 농도에서 tyrosinase 프로모터의 활성을 억제하기보다는 오히려 증진시키는 결과를 보여주었다.
- 그리고 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물 등의 용매 분획물들도 농도에 따라 차이는 있었지 만 100 Pg/mL 또는 500 Hg/mL의 고농도에서 tyro sinase 프로모터의 활성을 억제하였다. 또한, 지치 메탄올 추출물의 농도를 달리하여 3일 동안 처리하였을 때 멜라닌 색소의 생성 능은 10 Pg/mL 와 100 Hg/mL의 농도에서 대조군 세포에 비해 각각 약 11%와 24%로 크게 감소하는 결과를 보여주었다.
- 유전자 발현 조절 수준에서 멜라닌 색소 생합성 억제물질을 탐색하고자 지치 뿌리로부터 유용성 물질을 추출. 분획하여 tyrosinase 프로모터를 지닌 B16 mouse melanoma cell에 처리한 결과 그 메탄올 추출물은 10 Pg/mL의 농도에서 약 33% 이상의 tyrosinase 프로모터 활성 억제 효과를 나타내었으며, 세포 활성 능이 100Rg/mL의 농도에서 약 108%로 매우 안전하였다. 그리고 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물 등의 용매 분획물들도 농도에 따라 차이는 있었지 만 100 Pg/mL 또는 500 Hg/mL의 고농도에서 tyro sinase 프로모터의 활성을 억제하였다.
- 세포 내 유전자 도입을 통하여 제조된 B16 mouse mel anoma cell에 지 치 메탄올 추출물을 처 리 하여 tyrosinase 프로모터의 억제 효과를 조사한 결과, 그 효과는 추출물의 처리 농도에 비례하는 경향을 나타내었다(Fig. 1). 즉 지치 추출물을 10 Hg/mL, 100 lig/mL, 500 Jig/mL 농도로 형질전환 된 세포에 처리하였을 때 세포의 tyrosinase 프로모터 활성은 각각 약 67%, 66%, 46%로서 억제하는 효과를 보여 주었다.
- 그리고 물 분획물은 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol과 같은 용매 분획물들에 비해 보다 높은 농도 즉, 500 Ug/mL의 고농도에서 tyrosinase 프로모터의 활성을 억제하였다. 이 결과를 통해서 볼 때 지 치 용매 분획물들의 tyrosinase 프로모터 활성 억제 효과는 특정 용매 분획물에 한정하지 않고 본 연구에 이용된 모든 용매 분획물에서, 그리고 10Ug/mL 이하의 저농도보다는 100 ng/mL 또는 500 Ug/mL의 고농도로 처리하였을 때 나타났다. 그러나 용매 분획물들의 억제 효과는 메탄올 추출물에 비해 감소하는 결과를 보여주었다.
- 그리고 tyrosinase 프로모터 활성을 크게 억제하였던 500 Ug/mL의 고농도에서는 배양 중에 세포의 분해가 일어나 MTT assay를 실시하는 과정 중에 세포가 대부분 손실됨으로서 세포독성을 평가하는 것이 어려웠다. 이 결과를 통해서 볼 때 지치 추출물을 이용하여 tyrosinase 프로모터 활성을 효과적으로 억제하기 위 해 서 는 고농도로 이용하기보다는 세포 안전성 이 확보된 100 Jig/ mL 이하의 농도로 이용하는 것이 바람직하다고 판단된다.
- 1). 즉 지치 추출물을 10 Hg/mL, 100 lig/mL, 500 Jig/mL 농도로 형질전환 된 세포에 처리하였을 때 세포의 tyrosinase 프로모터 활성은 각각 약 67%, 66%, 46%로서 억제하는 효과를 보여 주었다. 그러나 1 mg/mL의 고농도에서는 광학 현미경으로 확인할 정도로 세포가 심하게 분해됨으로서 tyrosinase 프로모터의 활성 능을 측정할 수가 없었다.
- 2와 같이 추출물의 처리농도에 따라 다른 결과를 보여주었다. 즉, 지치 추출물은 농도 증가에 따라 세포의 활성 능이 증가하기 시작하여 50 lig/mL의 농도에서 약 211 %로 2배 이상 증진되었으나 100 lig/mL의 농도에서는 세포 활성 능이 108%로 감소하였다. 그리고 tyrosinase 프로모터 활성을 크게 억제하였던 500 Ug/mL의 고농도에서는 배양 중에 세포의 분해가 일어나 MTT assay를 실시하는 과정 중에 세포가 대부분 손실됨으로서 세포독성을 평가하는 것이 어려웠다.
- 3). 지치 추출물을 1 Ug/mL의 저농도로 세포에 처리하였을 때의 멜라닌 색소 생 성능은 102%로 대조군과 거의 유사하였으나, 10 Ug/mL 와 100 Rg/mL의 농도로 세포에 처리하였을 때의 멜라닌 색소의 생성 능은 대조군의 약 89%와 76%의 수준이었다. 특호】, 10 Hg/mL의 동일한 농도에서 다른 추출물과 비교하였을 때 지치 추출물은 Okano(24)에 의해 보고된 대나무(Bamboo)꽃:추출물보다 효과가 낮았지만 현재 멜라닌 색소 생성 억제제로서, 알려져 있는 kojic acid와 비슷한 억제 효과를 나타내었다(25).
후속연구
- 그러나 kojic acid는 6일 동안 처리하였을 때 나타난 결과이지 만 지치 추출물은 보다 짧은 3일 동안 처리하였을 때 거의 비슷한 효과를 나타낸 것으로 보아 지치 추출물이 kojic acid보다 우수한 효과를 지니고 있음이 증명되었다. 따라서 지치 추출물 내에는 tyrosinase 프로모터의 활성과 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 효과를 지니고 있는 성분들이 함유되어 있는 것으로 보여지며, 앞으로보다 많은 연구가 이루어진다면 멜라닌 색소 생합성 억제제로서 널리 이 용 되리라 생각되어진다.
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