여드름은 만성 염증 질환으로 주로 청소년기에 발생하는 것으로 알려져 있으나 대기오염, 약물 남용 등의 원인에 의해 아동기 및 성인기에도 나타날 수 있다고 알려져 있다. 여드름을 유발하는 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나 한 가지 원인보다 스트레스, 호르몬의 변화, 유전, 외부 환경 등 다양한 요인들이 복합적으로 작용한다고 여겨지고 있다. Propionibacterium acnes (P. acnes)는 여드름을 유발하는 균으로 모낭 내에 상주하여 피지의 중성지방을 분해하고 유리 지방산을 형성하여 모낭 내 염증을 유발한다. 따라서 피지의 생성 증가는 P. acnes의 생존에 좋은 영향을 주고 피부에서 염증반응을 유발하는 monocytic cell의 활성화와 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 증가를 유발한다. 따라서 여드름 치료를 위해서는 P. acnes의 증식 억제 및 염증반응을 최소화하는 것이 중요하다. 본 논문에서는 유칼립투스(Eucalyptus globules) 추출물이 P. acnes에 의한 염증반응에 나타내는 효과를 확인하고자 하였다. 유칼립투스 추출물 처리는 P. acnes가 유도하는 염증 매개자로 알려진 $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$, IL-2와 인플라마좀 복합체인 NLRP3의 유전자 발현을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 유전자 발현에 중요하다고 알려진 전사인자(transcription factors) $NF-{\kappa}B$와 NFAT의 활성 역시 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 논문을 통해 유칼립투스 추출물이 P. acnes에 의해 초래되는 여드름의 치료 보조제로 사용될 수 있으며, 천연 추출물의 사용이 항생제 장기 복용으로 인해 유발되는 항생제 내성을 해결하는 좋은 대안이 될 것이라고 예상할 수 있다.
여드름은 만성 염증 질환으로 주로 청소년기에 발생하는 것으로 알려져 있으나 대기오염, 약물 남용 등의 원인에 의해 아동기 및 성인기에도 나타날 수 있다고 알려져 있다. 여드름을 유발하는 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나 한 가지 원인보다 스트레스, 호르몬의 변화, 유전, 외부 환경 등 다양한 요인들이 복합적으로 작용한다고 여겨지고 있다. Propionibacterium acnes (P. acnes)는 여드름을 유발하는 균으로 모낭 내에 상주하여 피지의 중성지방을 분해하고 유리 지방산을 형성하여 모낭 내 염증을 유발한다. 따라서 피지의 생성 증가는 P. acnes의 생존에 좋은 영향을 주고 피부에서 염증반응을 유발하는 monocytic cell의 활성화와 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 증가를 유발한다. 따라서 여드름 치료를 위해서는 P. acnes의 증식 억제 및 염증반응을 최소화하는 것이 중요하다. 본 논문에서는 유칼립투스(Eucalyptus globules) 추출물이 P. acnes에 의한 염증반응에 나타내는 효과를 확인하고자 하였다. 유칼립투스 추출물 처리는 P. acnes가 유도하는 염증 매개자로 알려진 $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$, IL-2와 인플라마좀 복합체인 NLRP3의 유전자 발현을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 유전자 발현에 중요하다고 알려진 전사인자(transcription factors) $NF-{\kappa}B$와 NFAT의 활성 역시 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 논문을 통해 유칼립투스 추출물이 P. acnes에 의해 초래되는 여드름의 치료 보조제로 사용될 수 있으며, 천연 추출물의 사용이 항생제 장기 복용으로 인해 유발되는 항생제 내성을 해결하는 좋은 대안이 될 것이라고 예상할 수 있다.
Acne is known as the most common skin disease. It commonly occurs during adolescents, but it is also present in children and adults because of air pollution, drug abuse and so on. In addition to the hormonal, genetic and environmental factors, Propionibacterium acnes (P. acnes) have also critical ro...
Acne is known as the most common skin disease. It commonly occurs during adolescents, but it is also present in children and adults because of air pollution, drug abuse and so on. In addition to the hormonal, genetic and environmental factors, Propionibacterium acnes (P. acnes) have also critical roles in outbreak of acne by inducing inflammatory mediators. Increase of sebum production provides an ideal environment for P. acnes that induce inflammation on the skin by activation of monocytic cells and stimulation of inflammatory cytokines. In this study, natural extracts were investigated for anti-inflammatory effects against inflammatory acne by P. acnes infection in terms of reducing cytokine production. Eucalyptus globulus extracts effectively suppressed mRNA synthesis of inflammatory mediators such as $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$, IL-2, and NLRP3 in P. acnes-activated macrophages. Moreover, Eucalyptus globulus extracts inhibit activation of transcription factors, $NF-{\kappa}B$ and NFAT, which are known as key regulators of inflammatory cytokine production. This study suggests the potential of using Eucalyptus globulus extracts as alternative agents for the treatment of acne.
Acne is known as the most common skin disease. It commonly occurs during adolescents, but it is also present in children and adults because of air pollution, drug abuse and so on. In addition to the hormonal, genetic and environmental factors, Propionibacterium acnes (P. acnes) have also critical roles in outbreak of acne by inducing inflammatory mediators. Increase of sebum production provides an ideal environment for P. acnes that induce inflammation on the skin by activation of monocytic cells and stimulation of inflammatory cytokines. In this study, natural extracts were investigated for anti-inflammatory effects against inflammatory acne by P. acnes infection in terms of reducing cytokine production. Eucalyptus globulus extracts effectively suppressed mRNA synthesis of inflammatory mediators such as $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$, IL-2, and NLRP3 in P. acnes-activated macrophages. Moreover, Eucalyptus globulus extracts inhibit activation of transcription factors, $NF-{\kappa}B$ and NFAT, which are known as key regulators of inflammatory cytokine production. This study suggests the potential of using Eucalyptus globulus extracts as alternative agents for the treatment of acne.
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문제 정의
다음으로 P. acnes에 의한 염증반응에서 유칼립투스 추출물이 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시키는 것이 NFAT와 NF-κB의 전사활성과 관련이 있는지 확인하고자 하였다.
또한, 이러한 감소 효과가 실제 단백질 발현량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. Raw264.
본 논문에서는 유칼립투스(Eucalyptus globules) 추출물이 P. acnes에 의한 염증반응에 나타내는 효과를 확인하고자 하였다. 유칼립투스 추출물 처리는 P.
본 실험에서는 유칼립투스 추출물이 P. acnes로 인해 활성화된 Raw264.7 세포주에서 인플라마좀의 핵심단백질과 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향과 이러한 염증 매개 물질의 발현에 주요한 역할을 하는 전사인자들의 활성을 확인함으로써 유칼립투스 추출물의 항염증 효능을 살펴보고자 하였다.
본 연구에 앞서 염증반응 주요 조절 세포인 대식세포에 유칼립투스 추출물이 독성을 나타내는지 알아보기 위해 cell viability assay를 수행하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위한 실험방법으로 Trypan blue dye exclusion 방법에 의해 생존 세포수를 측정하였다.
본 연구에서는 여드름을 유도하는 원인균인 P. acnes를 대식세포주에 처리하였을 때 나타나는 염증성 사이토카인과 인플라마좀 복합체의 핵심단백질 유전자의 발현 양상을 확인하고 이를 억제할 수 있는 유칼립투스 추출물을 확인하였다. P.
제안 방법
25, 50, 100, 200, 500 µg/ml 농도의 유칼 립투스 추출물을 포함한 배양액에서 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포주를 12시간 동안 배양한 후 세포생존율을 측정하였다.
6시간 뒤 세포를 lysis하여 Western blot을 수행하여 IL-1β의 단백질 발현량을 확인하였다(Fig. 4D).
acnes의 membrane fraction을 50 µg/ml의 농도로 처리하였다. 6시간 뒤, 세포를 lysis하여 luciferase 활성 정도를 확인하였다. 그 결과 P.
Cell lysates는 SDS-PAGE를 수행한 후 GAPDH (Santa Cruz Biotechnology)와 IL-1β/IL-1F2 (R&D Systems)의 항체를 이용하여 단백질 발현정도를 확인한다.
배양한 세포에서 배양액을 제거하고 RiboEx (GeneAll) 1 ml을 이용하여 RNA를 분리한다. M-MLV reverse transcriptase (Promega)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행한다. 사용한 primer는 다음과 같다.
P. acnes 의 처리가 이러한 염증 매개 전사인자의 활성을 증가시킬 수있는지 확인하기 위해 Raw264.7 세포주에 NF-κB와 NFATluciferase reporter vector를 각각 transfection한 후 P. acnes를 50 µg/ml 처리하고 6시간 뒤 luciferase 활성 정도를 확인하였다.
P. acnes가 대식세포주에서 염증을 유발 할 수 있는 지를 확인 하기 위하여 Raw264.7 세포주에 P. acnes의 membrane fraction 을 10, 20, 50 µg/ml의 농도로 처리하고 6시간 동안 배양한 후, RT-PCR을 통해 염증성 사이토카인의 mRNA 발현량을 확인 하였다.
P. acnes에 의해 유도되는 염증반응을 유칼립투스 추출물이 제어할 수 있는지 확인하기 위해 Raw264.7 세포주에 유칼립투스 추출물을 30분간 전처리 하였다. 이후 P.
7 세포주를 24시간 배양한 후 이들 세포를 25, 50, 100, 200, 500 µg/ml 농도의 유칼립투스 추출물이 첨가된 배양액에서 12시간 배양하였다. Trypan blue dye로 세포를 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포수를 현미경으로 측정하여 단위 부피당 세포수를 계산하였다.
두 가지 서로 다른 세포생존율 측정방법을 통한 유칼립투스 추출물의 세포독성을 평가한 결과를 토대로 유칼립투스 추출물에 의한 세포독성을 최소화하고 염증반응 억제 효능을 극대화 하기 위해 세포생존율이 50% 이상을 나타내는 농도를 사용하고자 하였다. 따라서 이후의 실험에서는 유칼립투스 추출물은 50 µg/ml의 농도로 사용하였다.
유칼립투스는 분쇄기(DA700-G, DAESUNG ARTLON, Paju, Korea)를 통해 분말화 한 후 사용하였다. 분쇄물의 20배의 70% 에탄올(w/v)을 첨가하고 상온 조건에서 3시간 동안 교반기(RW20DZM.n, IKA Korea Ltd.)를 이용하여 추출하였다. 이후 제조된 추출물을 여과하여 얻어진 여액을 회전증발농축기(LABOTORA 4000eco, Heidolph Instruments GmbH&Co)를 이용하여 용매를 제거하여 분말 형태의 시료를 수득하였다.
acnes의 membrane fraction을 50 µg/ml 처리하여 6시간 동안 배양한다. 세포를 lysis한 후 luminometer를 이용하여 luciferase activity를 측정하였다.
이를 위해 Raw264.7 세포주에 NF-κB와 NFAT-luciferase reporter vector를 각각 transfection하였다.
이후 P. acnes의 membrane fraction을 50 µg/ml의 농도로 처리하고 6시간 뒤, 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-2, NLRP3 및 TNF-α의 mRNA 양을 RT-PCR을 통해 확인하였다.
이후 제조된 추출물을 여과하여 얻어진 여액을 회전증발농축기(LABOTORA 4000eco, Heidolph Instruments GmbH&Co)를 이용하여 용매를 제거하여 분말 형태의 시료를 수득하였다.
대상 데이터
Raw264.7 세포주는 ATCC에서 구입하였으며 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin과 streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
이 분말을 영하 20°C 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 동결건조분말은 실험 시 dimetyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해시킨 후 사용하였다.
여드름 유발균인 Propionibacterium acnes (KCTC3314)는 KCTC생물자원센터로(Korea)부터 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 균주는 reinforced clostridial medium (Merck Millipore) 배지에 37°C, 혐기 조건으로 배양하였다.
유칼립투스는 (주)허브마을을 통해 구입하여 사용하였다. 유칼립투스는 분쇄기(DA700-G, DAESUNG ARTLON, Paju, Korea)를 통해 분말화 한 후 사용하였다.
유칼립투스는 (주)허브마을을 통해 구입하여 사용하였다. 유칼립투스는 분쇄기(DA700-G, DAESUNG ARTLON, Paju, Korea)를 통해 분말화 한 후 사용하였다. 분쇄물의 20배의 70% 에탄올(w/v)을 첨가하고 상온 조건에서 3시간 동안 교반기(RW20DZM.
데이터처리
모든 실험결과는 3회 반복 실험에 대한 평균(mean)±표준편차(SD)로 표시하였고, unpaired Student’s t-test를 시행하여 P< 0.05인 경우 유의적인 것으로 판정하였다.
이론/모형
본 연구에 앞서 염증반응 주요 조절 세포인 대식세포에 유칼립투스 추출물이 독성을 나타내는지 알아보기 위해 cell viability assay를 수행하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위한 실험방법으로 Trypan blue dye exclusion 방법에 의해 생존 세포수를 측정하였다. 25, 50, 100, 200, 500 µg/ml 농도의 유칼 립투스 추출물을 포함한 배양액에서 마우스 대식세포주인 Raw264.
성능/효과
MTT assay를 통한 세포생존율 측정 결과 유칼립투스 추출물은 25 µg/ml의 농도에서 72.5%, 50 µg/ml의 농도에서 50.9%, 100 µg/ml의 농도에서 18.2%, 200 µg/ml의 농도에서 18.4%, 500 µg/ml의 농도에서 5.7%로 나타났다(Fig. 2).
MTT assay를 통한 세포생존율 측정에서는 유칼립투스 추출물을 50 µg/ml 의 농도보다 높게 처리하였을 때, 세포생존율이 50% 미만으로 급격하게 감소하였다.
P. acnes를 대식세포주에 처리하고 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 IL-1β, IL-2, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인뿐만 아니라 인플라마좀 복합체의 핵심단백질인 NLRP3의 mRNA 발현량이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
Trypan blue dye exclusion 방법에 의한 세포생존율 측정법에서는 200 µg/ml의 농도를 처리하였을 때, 세포생존율이 50% 미만으로 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
그 결과 P. acnes에 의해 증가했던 IL-1β의 단백질 발현량이 유칼립투스 추출물에 의해 확연히 감소하였다.
그 결과 P. acnes에 의해 증가했던 NF-κB와 NFAT reporter gene 활성이 유칼립투스 추출물에 의해 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4B and C).
그 결과 Raw264.7 세포주에서 염증성 사이토카인으로 알려진 TNF-α, IL-1β, IL-2의 mRNA 발현량이 P. acnes 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 3A).
acnes를 50 µg/ml 처리하고 6시간 뒤 luciferase 활성 정도를 확인하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 P. acnes를 처리하자 luciferase 활성이 현저히 증가됨을 확인하였다(Fig. 3B and C).
그 결과 유칼립투스 추출물을 전 처리한 실험군에서는 P. acnes에 의해 증가했던 IL-1β, IL-2, TNF-α 및 NLRP3의 mRNA 발현량이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A).
따라서 P. acnes로 염증이 유도된 Raw264.7 세포주에서 NFAT와 NF-κB 전사인자들이 활성화되어 IL-1β, IL-2, TNFα와 같은 염증성 사이토카인 및 인플라마좀 복합체의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.
4A). 따라서 유칼립투스 추출물이 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시킴으로써 P. acnes에 의한 염증반응을 억제할 수 있음을 확인하였다.
acnes)는 여드름을 유발하는균으로 모낭 내에 상주하여 피지의 중성지방을 분해하고 유리지방산을 형성하여 모낭 내 염증을 유발한다. 따라서 피지의 생성 증가는 P. acnes의 생존에 좋은 영향을 주고 피부에서 염증반응을 유발하는 monocytic cell의 활성화와 염증성 사이토 카인(pro-inflammatory cytokine)의 증가를 유발한다. 따라서 여드름 치료를 위해서는 P.
3A). 또한 인플라마좀 복합체로 알려진 NLRP3의 발현 또한 농도 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3A).
본 연구의 실험 결과를 종합해 보았을 때 유칼립투스 추출물은 Raw264.7 세포주의 NF-κB와 NFAT 전사인자들의 활성을 억제함으로써 P. acnes에 의해 유발된 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킨다.
뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 유전자 발현에 중요하다고 알려진 전사인자(transcription factors) NF-κB와 NFAT 의 활성 역시 유칼립투스 추출물을 처리하였을 때 감소하는 것을 알 수 있었다.
유칼립투스 추출물 처리는 P. acnes가 유도하는 염증 매개자로 알려진 TNF-α, IL-1β, IL-2와 인플라마좀 복합체인 NLRP3의 유전자 발현을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
이를 통해 유칼립투스 추출물이 NF-κB와 NFAT와 같은 전사인자들의 발현을 억제시킴으로써 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
후속연구
따라서 본 논문을 통해 유칼립투스 추출물이 P. acnes에 의해 초래되는 여드름의 치료 보조제로 사용될 수 있으며, 천연추출물의 사용이 항생제 장기 복용으로 인해 유발되는 항생제내성을 해결하는 좋은 대안이 될 것이라고 예상할 수 있다.
유칼립투스 추출물이 염증반응의 시작 단계인 염증성 사이토카인 분비에 유의한 수준의 억제 효과가 있다는 본 연구 결과를 바탕으로 향후 유칼립투스 추출물이 염증성 여드름 완화 목적의 의약품과 화장품 등에 널리 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
8-cineole의 항균효과 역시 보고된 바 있다(Sadlon and Lamson, 2010). 향후 1.8-cineole이 P. acnes 에 의해 유발되는 염증반응과 인플라마좀 활성화를 제어할수 있는지에 대한 연구를 추가적으로 진행하여 유칼립투스 추출물의 작용 기전을 밝히는데 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
여드름 치료를 위해서 P. acnes의 증식 억제 및 염증반응을 최소화하는 것이 중요한데 이와 관련된 피지의 역할은?
acnes)는 여드름을 유발하는균으로 모낭 내에 상주하여 피지의 중성지방을 분해하고 유리지방산을 형성하여 모낭 내 염증을 유발한다. 따라서 피지의 생성 증가는 P. acnes의 생존에 좋은 영향을 주고 피부에서 염증반응을 유발하는 monocytic cell의 활성화와 염증성 사이토 카인(pro-inflammatory cytokine)의 증가를 유발한다. 따라서 여드름 치료를 위해서는 P.
인플라마좀은 무엇인가?
인플라마좀은 면역세포에서 발현되는 단백질 복합체로써, 평소에는 세포 내에 존재하던 단백질들이 자극에 의해 단백질 복합체를 형성하여 활성이 일어난다. 대표적으로 NLRP1, NLRP3가 있으며 caspase-1과 결합하여 pro-IL-1β를 활성형으로 전환시켜 세포로부터 IL-1β의 분비를 유도하는 것으로 알려져 있다(Lee, 2013).
염증에 관여하는 물질은 어떤 것이 있는가?
염증은 병원체의 침입이나 조직 손상으로부터 우리 몸을 보호하는 방어 기전 중 하나이지만 면역반응이 강하게 일어나면 세포 또는 조직이 공격을 받아 만성 면역 질환을 일으키는 나쁜 의미의 염증반응이 진행되며, 이 과정에는 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)과 인플라마좀(inflammasome) 등 다양한 물질이 관여한다(Lee et al., 2015).
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