The purpose of this study was to evaluate the protective effect of $PineXol^{(R)}$ on $H_2O_2$-induced cell death in SK-N-MC cells, and in early stage focal ischemia rodent model. SK-N-MC cells were pre-treated with $200{\mu}M$$H_2O_2$ or various concentr...
The purpose of this study was to evaluate the protective effect of $PineXol^{(R)}$ on $H_2O_2$-induced cell death in SK-N-MC cells, and in early stage focal ischemia rodent model. SK-N-MC cells were pre-treated with $200{\mu}M$$H_2O_2$ or various concentrations of $PineXol^{(R)}$ (10, 30, and 50 pg/mL) for 24 h, and then exposed to $H_2O_2$ for 3 h. Cell death was assessed by the CCK-8 assay, reactive oxygen species (ROS) assay, and lactate and dehydrogenase (LDH) release assay. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) expressions were also analyzed by western blotting. Focal ischemia rodent model was used as the in vivo model, and different concentrations of $PineXol^{(R)}$ (1, 10, and 100 mg/kg) were administered. One week after administration, reduction of infarct volume was analyzed by TTC staining. Cell viability of $H_2O_2$-treated SK-N-MC cells significantly increased by pre-treatment of $PineXol^{(R)}$ (p<0.05). $PineXol^{(R)}$ pre-treatment also induced significant decrease of ROS and LDH expressions. However, $PineXol^{(R)}$ did not affect the infarct volume. These results suggest that $PineXol^{(R)}$ has significant neuroprotective effect in vitro, but statistical significance was not confirmed in the in vivo focal ischemia model.
The purpose of this study was to evaluate the protective effect of $PineXol^{(R)}$ on $H_2O_2$-induced cell death in SK-N-MC cells, and in early stage focal ischemia rodent model. SK-N-MC cells were pre-treated with $200{\mu}M$$H_2O_2$ or various concentrations of $PineXol^{(R)}$ (10, 30, and 50 pg/mL) for 24 h, and then exposed to $H_2O_2$ for 3 h. Cell death was assessed by the CCK-8 assay, reactive oxygen species (ROS) assay, and lactate and dehydrogenase (LDH) release assay. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) expressions were also analyzed by western blotting. Focal ischemia rodent model was used as the in vivo model, and different concentrations of $PineXol^{(R)}$ (1, 10, and 100 mg/kg) were administered. One week after administration, reduction of infarct volume was analyzed by TTC staining. Cell viability of $H_2O_2$-treated SK-N-MC cells significantly increased by pre-treatment of $PineXol^{(R)}$ (p<0.05). $PineXol^{(R)}$ pre-treatment also induced significant decrease of ROS and LDH expressions. However, $PineXol^{(R)}$ did not affect the infarct volume. These results suggest that $PineXol^{(R)}$ has significant neuroprotective effect in vitro, but statistical significance was not confirmed in the in vivo focal ischemia model.
이뿐만 아니라 뇌세포에 작용하는 산화질소(NO)를 증가시켜 산소 공급과 영양소 운반을 개선하는 것으로도 해외에서 보고되었다(Zhang 등 1998; Nishioka 등 2012). 이에 본 연구에서는 국산 적송 껍질에서 추출한 PineXol®을 이용하여 in vitro 실험과 허혈성 뇌졸중 백서 모델을 이용한 in vivo 모델 실험을 통하여 그 효과를 알아보고자 하였다. 과산화수소로 세포사를 유도한 SK-N-MC 신경세포의 실험에서 PineXol® 30 pg/mL와 50 pg/mL 전처리군에서 과산화수소 단독처리군 보다 세포 생존률에 있어서 유의적인 차이를 확인할 수 있었다.
제안 방법
신경세포의 세포막은 다른 세포보다 지질 함량이 높아 산화 스트레스에 의해서 더욱 쉽게 파괴되는 구조를 가지고 있으며, 뇌에는 활성산소를 제거해주는 항산화제가 적기 때문에 쉽게 산화 스트레스 상태에 놓이게 되며, 이로 인하여 신경세포가 사멸하게 된다(Lenaz 등 1998). 따라서, 과산화수소를 이용하여 SKN-MC 신경세포를 산화 스트레스 상태로 유도함으로써 PineXol®의 세포막 보호 효과를 알아보기 위한 연구를 진행하였다. 세포질 성분인 Lactate dehydrogenase(LDH)를 측정한 결과는 Fig.
활성산소들은 화학적인 반응도가 매우 높아서 세포를 구성하고 있는 유전자, 단백질, 지질 등 여러 중요물질들과 반응하여 손상을 줌으로써 세포의 기능에 장해를 주고 염증, 노화, 암, 당뇨병, 고혈압 등을 일으키는 것으로 알려져 있다(Ryu SE 2013). 연구에 사용될 과산화수소의 세포 내 처리 농도를 알아내기 위하여 성장배양액에 과산화수소를 100~1,000 μM의 농도에 따라 각각 세포에 첨가하였으며, 24시간 후 세포생존율을 CCK-8 assay를 이용하여 측정하였다. Fig.
이는 항산화 효소가 활성산소를 제거하는 것을 말하며, 중요 항산화 효소로는 SOD(superoxide dismutase)와 CAT(catalase) 그리고 GPx(glutathione peroxidase) 등이 있다. 이에 본 실험에서는 SOD, CAT 그리고 GPx의 세포내 단백질 발현을 조사하였다. SK-N-MC 신경세포에 PineXol®을 24시간 전처리 후 과산화수소를 처리하였을 때, SOD, CAT, 그리고 GPx의 발현은 PineXol®의 농도에 따라서 증가하였다(Fig.
대상 데이터
2 μm 실린지 필터를 이용하여 여과한 후 본 실험에 사용하였다. SK- N-MC 신경세포주는 한국세포주은행에서 구입하여 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY)에 5% FBS와 1% penicillin과 streptomycin를 첨가한 후 37℃, 5 % CO2 배양기에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용된 소나무 껍질 추출물(PineXol®)은 뉴트라팜㈜ (NutraPharm Co., LTD, Gangneung, S. Korea)로부터 제공받아 사용하였으며, 농도에 따라서 3차 증류수에 희석한 후, 0.2 μm 실린지 필터를 이용하여 여과한 후 본 실험에 사용하였다. SK- N-MC 신경세포주는 한국세포주은행에서 구입하여 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY)에 5% FBS와 1% penicillin과 streptomycin를 첨가한 후 37℃, 5 % CO2 배양기에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
본 실험의 동물실험은 서울의료원 의학연구소 실험동물 운영위원회와 동물실험윤리위원회의 승인(A2016-002)을 받은 후 시행하였으며, 모든 과정은 식품의약품안전처 실험동물제도의 동물실험에 관한 법률 및 수행절차 규정을 준수하였다. 이번 실험에 사용되어진 실험동물은 생후 7주령 수컷 Spague-Dawley(SD) 백서들로 ㈜코아텍(KOATECH, Kyunggi-do, Korea)에서 구입하였으며, 동물실험실의 사육 환경은 실험기간 동안 온도(20~22℃), 습도(55~65%), 그리고 명암주기는 12시간 주기로 유지하였으며, 사료와 물은 실험 전까지 자유급이하였다.
데이터처리
모든 실험 결과는 각 항목에 따라 평균±표준편차로 표시하였다. 통계적 분석은 SPSS 20.0 K를 이용하여 one way ANOVA를 시행하였으며, p<0.05의 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
본 실험에 사용된 허혈성 뇌졸중 동물모델은 Koizumi(1986) 등이 최초로 사용한 중뇌대동맥폐쇄 방법을 변형한 동맥 내 세사 폐쇄 방법(intraluminal filament technique)을 이용하였다(Longa 등 1989). 백서는 질소와 산소를 7:3으로 혼합한 기체와 2% isoflurane를 이용하여 마취를 유도하였으며, 수술이 진행되는 동안 온도조절판을 이용하여 실험동물의 체온을 37℃로 유지하였다.
성능/효과
2와 같다. 과산화수소 단독처리군과 PineXol® 전처리군과의 비교 시 PineXol® 전처리군 30, 50 pg/mL에서 세포 생존율이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 식물이 가지고 있는 항산화능으로 인한 세포의 보호효과가 알려진 것처럼(Suh 등 2013), PineXol®이 가지고 있는 항산화물질들로 인하여 산화 스트레스 상태의 SK-N-MC 신경세포를 보호할 수 있음을 확인하였다.
과산화수소로 세포사를 유도한 SK-N-MC 신경세포의 실험에서 PineXol® 30 pg/mL와 50 pg/mL 전처리군에서 과산화수소 단독처리군 보다 세포 생존률에 있어서 유의적인 차이를 확인할 수 있었다. 또한 산화 스트레스에 대한 세포막 보호 효과를 알 수 있는 LDH와 ROS의 발현 감소 또한 본 연구를 통하여 확인할 수 있었으며, western blot을 이용한 세포 내 단백질 발현에서도 PineXol®의 농도 증가에 따라서 SOD, CAT, 그리고 GPx의 발현이 모두 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 PineXol® 이 가지고 있는 여러 항산화 물질들이 과산화수소로 유도된 산화 스트레스 상태의 SK-N-MC 신경세포를 보호하고 있음을 확인할 수 있는 결과라고 말할 수 있겠다.
또한 산화 스트레스에 대한 세포막 보호 효과를 알 수 있는 LDH와 ROS의 발현 감소 또한 본 연구를 통하여 확인할 수 있었으며, western blot을 이용한 세포 내 단백질 발현에서도 PineXol®의 농도 증가에 따라서 SOD, CAT, 그리고 GPx의 발현이 모두 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 PineXol® 이 가지고 있는 여러 항산화 물질들이 과산화수소로 유도된 산화 스트레스 상태의 SK-N-MC 신경세포를 보호하고 있음을 확인할 수 있는 결과라고 말할 수 있겠다. 하지만 본 실험에서는 PineXol®이 가지고 있는 항산화능을 세포 수준에서 확인할 수 있었지만, 백서를 이용한 in vivo 실험에서는 PineXol®을 여러 농도로 일주일간 경구 투여한 결과에서 뇌병변 감소와 같은 효과는 확인할 수 없었다.
후속연구
이는 경구 투여되는 식품의 유효성분이 체내에 작용하기에 저농도이었거나, 짧은 투여기간으로 인하여 효과를 나타내지 못한 것으로 사료된다. 추후 연구에서는 세포 내 항산화 방어체계를 강화시키는 분자세포생물학적 작용 기전 연구와 동물 모델을 이용한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소가 과잉 생성되면 어떤 악영향이 발생되는가?
생체 내 생성되는 활성산소(reactive oxygen species; ROS)는 미토콘드리아에서 ATP를 만들어내는 과정에서 일정량 발생하며, 그로 인해 세포 내 유전자 발현, 세포 활동 등을 조절하는 신호전달 물질이지만, 과잉 생성되게 되면 단백질과 DNA 손상, 세포의 사멸과 이상 증식, 그리고 조직이나 기관들을 손상시켜 노화와 각종 질병들을 유발하는 주요 원인으로 알려져 있다(Duran 등 2002; Yong 등 2007; Park & Kweon 2013). 그 중 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 심혈관 질환, 암, 노화와 관련성이 높다고 보고되었으며(Alfadda & Sallam 2012), 이에 따라 체내에 생성되는 ROS를 제거하기 위하여 합성 항산화제 등이 초기에는 많이 사용되었으나, 발암과 독성으로 인한 인체에 대한 안정성에 문제가 있다는 것이 알려지게 되면서 그 사용이 감소하고 있다(Branen AL 1975; Ito 등 1983).
활성산소와 관련성이 높은 질환은?
생체 내 생성되는 활성산소(reactive oxygen species; ROS)는 미토콘드리아에서 ATP를 만들어내는 과정에서 일정량 발생하며, 그로 인해 세포 내 유전자 발현, 세포 활동 등을 조절하는 신호전달 물질이지만, 과잉 생성되게 되면 단백질과 DNA 손상, 세포의 사멸과 이상 증식, 그리고 조직이나 기관들을 손상시켜 노화와 각종 질병들을 유발하는 주요 원인으로 알려져 있다(Duran 등 2002; Yong 등 2007; Park & Kweon 2013). 그 중 뇌졸중, 파킨슨병, 알츠하이머병, 심혈관 질환, 암, 노화와 관련성이 높다고 보고되었으며(Alfadda & Sallam 2012), 이에 따라 체내에 생성되는 ROS를 제거하기 위하여 합성 항산화제 등이 초기에는 많이 사용되었으나, 발암과 독성으로 인한 인체에 대한 안정성에 문제가 있다는 것이 알려지게 되면서 그 사용이 감소하고 있다(Branen AL 1975; Ito 등 1983). 최근 들어서 인체에 무해한 비타민(vitamin), 카테킨(cathechin), 플라보노이드(flavonoid) 등과 같은 천연 항산화제를 임상에 적용함으로서(Devasagayam 등 2004), 다양한 질병에 약제로 사용하려는 노력들이 시도되고 있다(Kalt W 2006; Anna 2011 등; Kamel 2014 등).
소나무 껍질의 효능은?
소나무 껍질은 폴리페놀 성분을 많이 함유하고 있어 항산화 효과, 항염증 작용 그리고 면역력 증진 등과 같은 여러 종류의 생리활성 효과를 가지고 있는 것으로 보고되었다(Roh- dewald PA 2002). 대표적인 외국산 제품인 피크노제놀(pycno- genol)의 경우, 프랑스산 해송 껍질에서 추출한 추출물로, 카페인산(caffeic acid), 페룰산(ferulic acid) 등과 같은 다양한 페놀산을 함유하고 있어 항산화 효과가 매우 뛰어나다고 알려져 있으며(Hasegawa N 2002; Saliou 등 2002), 국내에서도 동해안의 적송 껍질 추출물(파인엑솔, PineXol®)을 개발하여 2006년도에 상품화 하였다(Choi 등 2007).
참고문헌 (32)
Alexandrova ML, Bochev PG. 2005. Oxidative stress during the chronic phase after stroke. Free Radic Biol Med 39:297-316
Choi JH, Choi MK, Han OT, Han SJ, Chung SJ, Shim CK, Kim DD. 2007. Evaluation of skin absorption of catechin from topical formulations containing Korea pine bark extract ( $PineXol^{(R)}$ ). J Korean Pharm Sci 37:359-364
Devasagayam TP, Tilak JC, Boloor KK, Sane KS, Ghaskadbi SS, Lele RD. 2004. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects. J Assoc Physicians India 52:794-804
Duran EH, Morshed M, Taylor S, Oehninger S. 2002. Differences in generation of reactive oxygen species (ROS) in highly motile fractions of spermatozoa as a discriminating tool for semen samples from infertility patients. Fertil Steril Sep 78:S263-264
Hasegawa N. 2002. Inhibition of lipogenesis by pycnogenol. Phytother Res 14:472-473
Ito N, Fukushima S, Hasegawa A, Shibata M, Ogiso T. 1983. Carcinogenecity of butylated hydroxyanisole in F344 rats. J Cancer Inst 70:343-347
Jeon YH, Choi SW and Kim MR. 2009. Antimutagenic and cytotoxic activity of ethanol and water extracts from rubus coreanum. Korean J Food Cookery 2:379-386
Kalt W. 2006. Effects of production and processing factors on major fruit and vegetable antioxidant. J Food Sci 70:11-19
Kamel KM, Abd El-Raouf OM, Metwally SA, Abd El-Latif HA, El-Sayed ME. 2014. Hesperidin and rutin, antioxidant citrus flavonoids, attenuate cisplatin-induced nephrotoxicity in rat. J Biochem Mol Toxicol 28:312-319
Koizumi J, Yoshida Y, Nakazawa T, Ooneda G. 1986. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke 8:1-8
Lee YH, Shin MH, Kweon SS, Choi JS, Park MS, Cho KH, Lim YS. 2012. Awareness of stroke warning signs and risk factors: Result Of a 2010 Community Survey in Gwangju Metropolitan City. J Korean Neurol Assoc 30:26-32
Lee YJ, Han OT, Choi HS, Lee BY, Chung HJ, Lee OH. 2013. Antioxidant and anti-adipogenic effects of $PineXol^{(R)}$ . Korean J Food Sci Technol 45:97-103
Min HK, Kim HJ, and Chang HC. 2008. Growth-inhibitory effect of the extract of porphyran Chungkookjang on cancer cell. Korea J Korean Soc Food Sci Nut 37:826-833
Nishioka K, Hidaka T, Nakamura S. 2007. $Pycnogenol^{(R)}$ , French maritime pine bark extract, augments endothelium-dependent vasodilation in humans. Hypertens Res 30:775-780
Park JH, Kweon GR. 2013. Clinical applications of antioxidants Hanyang. Med Rev 33:130-136
Rohdewald PA. 2002. Review of the French maritime pine bark extract (pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int J Clin Pharm Th 40:158-168
Saliou C, Rimbach G, Moini H, McLaughlin L, Hosseini S, Lee J, Watson RR, Packer L. Solar. 2002. Ultraviolet-induced erythema in human skin and nuclear factor-kappa- ${\beta}$ -dependent gene expression in keratinocytes are modulated by a French maritime pinebark extract. Free Radical Bio Med 30:154-160
Sarmadi BH, Ismail A. 2010. Antioxidative peptides from food proteins. Peptides 31:1949-1956
Suh Jh, Paek OJ, Kang YW, Ahn JE, Yun J, Oh KS, An YS, Park SH, and Lee SJ. 2013. Study on the antioxidant activity in the various vegetables. J Fd Hyg Safety 28:337-341
Sung SJ, Jung DG, Lee WK, Kim YJ, Lee HS. 2009. Life style and eating behavior of stroke patients in Daegu and Gyeongbuk province. Korea J Korean Soc Food Sci Nut 38:319-332
Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. 2007. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 39:44-84
Yong L, Hendrik J, Vreman RJW, Tjoson T, Toshihiro Y, and Linda J N-H. 2007. Heme oxygenase-1 stabilizes the bloodspinal cord barrier and limits oxidative stress and white matter damage in the acutely injured murine spinal cord. J Cerb Blood Flow Metab 27:1010-1021
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