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문제 정의
- LDL 콜레스테롤은 말초조직의 세포표면에 존재하는 LDL 수용체와 결합으로 대사가 조절되고 있는데, LDL 수용체의 이상을 초래하면 콜레스테롤의 조절이 일어나지 않아 콜레스테롤 과잉생산이 발생하고 고지혈증을 일으킨다6, 7). LDL 수용체의 결핍으로 죽상경화증 형성이 가속화 되는데, 이러한 이유로 본 실험에서는 LDL 수용체 결핍 마우스를 이용하여 영지버섯 70% 에탄올 추출물의 LDL 콜레스테롤 조절을 통한 죽상경화증 예방효과를 확인하고자하였다.
- 연구는 진행되지 않았다. 따라서 본 실험에서는 LDLr ko 마우스에 영지추출물의 투여로 혈중 지질농도 및 콜레스테롤 감소를 통한 죽상경화증 예방효과를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 1주간 적응기간을 거친 LDLr ko 마우스에 2주간 AIN-76A diet사료 (protein 20.8%, carbohydrate 67.7% fat 11.5%)에 적응시킨 후 실험동물을 정상군 (NOR), 대조군 (CON), 영지 추출물 100㎎/㎏ 투여군 (GL100), 영지 추출물 300㎎/㎏ 투여군 (GL300)으로 군 분리하여 실험에 사용하였다. 군 분리 후 정상군에는 AIN-76A diet사료를, 대조군 및 약물투여군에는 Western diet (D12079B)를 8주간 공급하였다(Table 1).
- 간 조직 고정 후 H&E염색을 실시하여 간 조직사진을 얻었다. 정상군의 간 조직(Fig.
- 간 조직에서의 조직병리학적 관찰을 수행하기 위해 간 조직을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행한 뒤 광학현미경위에서 특이 병변의 유무를 관찰하였다.
- 5%)에 적응시킨 후 실험동물을 정상군 (NOR), 대조군 (CON), 영지 추출물 100㎎/㎏ 투여군 (GL100), 영지 추출물 300㎎/㎏ 투여군 (GL300)으로 군 분리하여 실험에 사용하였다. 군 분리 후 정상군에는 AIN-76A diet사료를, 대조군 및 약물투여군에는 Western diet (D12079B)를 8주간 공급하였다(Table 1). Western diet는 콜레스테롤이 다량함유 되어있는 사료를 공급하여 약물투여군은 영지추출물을 각각 100㎎/㎏, 300㎎/㎏의 농도로 8주간 투여하였다.
- 대동맥에서의 조직병리학적 관찰을 수행하기 위해 대동맥을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 H&E 염색을 시행한 뒤 광학현미경 위에서 특이 병변의 유무를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 고콜레스테롤 식이인 Western diet를 섭취한 LDL receptor knockout 마우스에 100㎎/㎏, 300 ㎎/㎏의 농도로 영지 70% 에탄올 추출물을 8주간 투여하여 영지 추출물의 투여가 죽상경화증 예방에 효과가 있는지 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 부검 시 채취한 대동맥을 H&E염색을 실시하여 조직 사진을 얻었다. 대조군의 대동맥 조직(Fig.
- 비만이나 고콜레스테롤 식이에 의해 발생한 고지혈증이 죽상경화증의 직접적인 원인이 되므로 본 실험에서는 2주간 모든 LDLr ko 마우스에 11.5% 콜레스테롤이 함유되어있는 사료(AIN-76A)로 적응기간을 거친 후 죽상경화증 유발군 (CON, GL100, GL300)에는 고콜레스테롤 식이인 (D12079B) Western diet로 죽상경화증 유발과 함께 영지 추출물을 8주간 투여하여 체중증가와 식이효율을 확인하였다. 그 결과 대조군의 몸무게 증가는 정상군과 비교하여 큰 차이가 없었지만 GL300에서는 유의성 있게 체중의 변화가 감소하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22± 2℃, 습도 50±5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12 시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사 Co. Korea, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다.
- 실험 종료 후 각 실험동물로 부터 분리한 혈장 (plasma)에서 간 기능의 지표인 alanine aminotransferase (ALT) 및 aspartate aminotransferase (AST)를 생화학 자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 실험 종료 후 각 실험동물로부터 분리한 혈장에서 creatinine을 생화학 자동 분석기(Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 실험 종료 후 각 실험동물로부터 분리한 혈장에서 지질함량의 지표인 triglyceride (TG), total cholesterol (TC), High-density lipoprotein (HDL)의 함량을 생화학 자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다. LDL의 수치는 Iranian 2008 Formula for LDL Cholesterol (TC/1.
- 영지추출물에는 당 성분이 많아 에탄올을 이용하여 추출하였을 때 물 추출물과 비교하여 유효 성분이 다량 추출되기 때문에 영지 500g을 한일분쇄기 (FM-700SS, 한국)로 분쇄하여 환류추출기 (heating Mantle, MS-DM609/20L)에 넣고 45℃에서 70% 에탄올을 2L 가하여 60분 추출한 후 다시 70% 에탄올 2L를 가하여 같은 조건으로 60분 동안 재탕하였다. 그 후 감압증류기 (N-1200A, EYELA.
- 영지추출물을 8주간 투여 후 각 실험동물을 간, 신장조직과 피하 (subcutaneous), 부고환 (epididymal), 신장 주변 (kidney leaf) 및 내장 (intraabdominal)의 지방조직 (adipose tissue) 을 부위별로 적출하여 무게를 측정하였다.
- 영지추출물의 통해 체중의 조절 및 식이효율의 변화를 확인하였다 (Table 2). 정상군(7.
- 영지추출물의 투여를 통해 LDLr ko 마우스의 조직무게 변화를 측정하였다(Fig. 1.). 대조군의 간 무게 (1.
대상 데이터
- 본 실험을 위하여 LDLr ko 마우스 6주령 수컷을 Jackson Lab. ((주)중앙실험동물, 경기도)에서 분양받아 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22± 2℃, 습도 50±5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12 시간 주기로 조절하였다.
- 본 실험에 사용한 영지 Ganoderma lucidun(GL)는 옴니허브 (대구, 한국)에서 구입한 것을 생약규격집에 맞추어 관능 검사하여 규격에 합격한 것만을 정선하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험동물은 각 군당 6마리를 사용하였고, 모든 수치는 mean ±standard error (Mean±S.E)로 표시하였으며, Student's T-test 분석방법을 이용하여 각 자료의 통계적 유의성을 검증 하였고, 대조군과 투여군 사이에 p-value<0.05 일 때 유의성이 있는 것으로 판정 하였다.
이론/모형
- LDL의 수치는 Iranian 2008 Formula for LDL Cholesterol (TC/1.19+TG/1.9–HDL/1.1–38 (mg/dL))을 이용하여 계산하였다15).
성능/효과
- 1. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스의 체중증가는 영지추출물 300㎎/㎏ 투여군에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소되었다.
- 2. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스의 간 조직 및 신장조직 무게는 영지추출물 투여군은 대조군과 큰 차이가 없었으며, 지방조직에서는 영지추출물 300㎎/㎏ 투여군에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다.
- 3. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스의 간 기능 지표의 수치를 확인한 결과 ALT의 수치는 영지추출물 100㎎/㎏에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였지만 AST의 수치는 감소하는 경향만 보였다. 4.
- Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스의 간 기능 지표의 수치를 확인한 결과 ALT의 수치는 영지추출물 100㎎/㎏에서 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였지만 AST의 수치는 감소하는 경향만 보였다. 4. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스의 신장기능의 지표 변화를 확인한 결과 영지추출물 투여군 모두 대조군에 비해 유의한 감소를 보였다.
- 5. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스의 혈중 TG 및 HDL의 수치는 영지추출물 투여군이 대조군에 비해 감소하는 경향만 보였으며, TC와 LDL의 수치는 영지추출물 300㎎/㎏투여군에서 대조군과 비교하여 유의한 감소를 보였다.
- 6. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스에 영지추출물의 투여는 간 조직 내의 지방축적을 막았고, 간세포의 손상을 억제하였다.
- 7. Western diet 공급한 LDLr ko 죽상경화증 마우스에 영지추출물의 투여는 대동맥 조직벽의 두께가 증가하는 것과 플라크 형성을 막았다.
- 94IU/l로 감소하는 경향만 보였다. AST의 수치 또한 대조군은 148.60±35.96IU/l으로 정상군의 수치 (112.33±8.67 IU/l)에 비해 증가하는 경향을 보였고, GL100의 AST수치는 67.75±9.12IU/l, GL300은 91.25 ±6.43IU/l으로 감소하는 경향만 보였다(Fig. 2.).
- 4B). HDL 콜레스테롤의 함량을 측정한 결과 정상군은 203.33±41.81 mg/dl, 대조군은 192.40±14.98mg/dl, GL100은 211.50 ±8.73mg/dl, GL300은 182.75±9.48mg/dl로 각 군간의 차이가 없었다(Fig. 4C). 반면 LDL 콜레스테롤의 수치는 대조군이 1171.
- LDLr ko 마우스에 8주간 Western diet를 시행한 후 채취한 혈액에서 신장 기능 지표를 측정한 결과(Fig. 3.) 대조군의 creatinine 수치 (0.32±0.01umol/l)는 정상군의 수치(0.28 ±0.01umol/l)에 비해 유의하게 증가하였고 (p<0.01), GL100의 creatinine 수치 (0.18±0.01umol/l)와 GL300의 수치 (0.20±0.01umol/l) 모두 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다 (p<0.001).
- 03g)은 유의하게 감소하였다. LDLr ko 마우스에 영지추출물을 투여한 결과 대조군의 부고환 지방 무게 (0.89±0.16g)는 정상군 부고환지방의 무게 (0.18±0.02g)에 비해 유의성 있게 증가하였고 (p< 0.001), 영지 추출물을 투여한 GL100 (0.86±0.19g) 크게 변화가 없었지만 GL300 (0.25±0.12g)에서는 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다 (p<0.01). 신장주변 지방을 측정한 결과 정상군 (0.
- 또한 혈장에서 간 기능의 지표인 ALT, AST를 측정한 결과 영지추출물의 투여가 정상군의 수치와 비슷하게 감소하는 것을 확인하였고, 이는 영지추출물의 투여가 간 손상을 억제 할 것으로 예상된다. Western diet를 실시한 대조군의 간 조직사진에서는 정상군과 비교하여 현저하게 지방 방울의 수가 증가한 것을 발견하였지만, 영지추출물 투여군에서는 농도 의존적으로 지방방울이 감소하고 간세포가 정상적인 모양을 이루는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 영지추출물은 지방의 축적을 억제함으로 죽상경화증을 예방할 뿐만 아니라 간 기능의 손상을 막아주는 것으로 예상된다.
- 001). 내장지방의 무게 역시 대조군 (0.32±0.08g)에서는 정상군 (0.11±0.4g)에 비해 유의성 있는 증가를 보였고(p<0.05), GL100 (0.26±0.07g)과 GL300 (0.15±0.03g)에서는 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
- ). 대조군의 간 무게 (1.19±0.12 g)는 정상군의 간 무게 (0.73±0.06g)에 비해 유의성 있는 증가를 보였고 (p<0.01), GL100 (1.07±0.04g)과 GL300 (1.09±0.02g)은 감소하는 경향을 보였다. 신장 무게는 대조군 (0.
- 대조군의 대동맥 조직(Fig. 6B)에서는 동맥벽의 두께가 정상군(Fig. 6A)과 비교하여 두꺼워짐을 확인할 수 있었으며, 또한 플라크가 발생하였음을 확인할 수 있었다. 하지만 GL100의 대동맥 사진(Fig.
- 01g)에서는 큰 변화를 보이지 않았다. 대조군의 피하지방 무게 (1.27±0.20g)는 정상군 (0.35 ±0.05g)에 비해 유의성 있는 증가를 보였고 (p<0.001), GL100 (0.88±0.23g)은 대조군과 비교하여 감소하는 경향만 보였지만 GL300 (0.42±0.03g)은 유의하게 감소하였다. LDLr ko 마우스에 영지추출물을 투여한 결과 대조군의 부고환 지방 무게 (0.
- 하지만 영지 추출물에서 TG의 수치는 농도 의존적으로 적게 증가하는 것을 보였으며, TC와 LDL의 수치가 GL300에서 유의한 억제를 관찰할 수 있었다. 따라서 혈중 지질의 감소가 간 조직의 손상 및 지질의 축적을 막을 수 있었고, 죽상경화증을 억제하였을 것으로 예상된다.
- 본 실험에서도 간 조직의 무게가 정상군과 비교하여 대조군에서 유의하게 증가하였지만, 영지추출물을 투여한 군에서는 감소하는 경향을 보였다. 또한 혈장에서 간 기능의 지표인 ALT, AST를 측정한 결과 영지추출물의 투여가 정상군의 수치와 비슷하게 감소하는 것을 확인하였고, 이는 영지추출물의 투여가 간 손상을 억제 할 것으로 예상된다. Western diet를 실시한 대조군의 간 조직사진에서는 정상군과 비교하여 현저하게 지방 방울의 수가 증가한 것을 발견하였지만, 영지추출물 투여군에서는 농도 의존적으로 지방방울이 감소하고 간세포가 정상적인 모양을 이루는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 혈중 creatinine의 수치는 혈류량의 감소가 발생하였을 경우 증가하게 된다25). 본 실험에서 혈중 creatinine의 수치를 확인한 결과 대조군의 경우 creatinine의 수치가 정상군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었는데 이는 고콜레스테롤 식이를 통하여 죽상경화증이 유발되어 혈류량이 감소하였을 것으로 사료된다. 하지만 영지추출물 투여군에서는 creatinine의 수치가 대조군과 비교하여 유의적인 감소를보였는데 이러한 결과는 영지추출물이 죽상경화증을 예방하여 혈류량 감소를 억제하였기 때문으로 사료된다.
- Nuotio-Antar AM 등의 연구에 따르면 LDLr ko 마우스에 Western diet를 실시한 결과 간 조직의 무게 증가 및 간 조직에서 지방의 양이 증가하는 것이 관찰 되었다23, 24). 본 실험에서도 간 조직의 무게가 정상군과 비교하여 대조군에서 유의하게 증가하였지만, 영지추출물을 투여한 군에서는 감소하는 경향을 보였다. 또한 혈장에서 간 기능의 지표인 ALT, AST를 측정한 결과 영지추출물의 투여가 정상군의 수치와 비슷하게 감소하는 것을 확인하였고, 이는 영지추출물의 투여가 간 손상을 억제 할 것으로 예상된다.
- 선행연구에 의해서도 LDLr ko 마우스 Western diet가 중성지방 및 지단백의 증가를 가져오고 그 결과 죽상경화증의 경과가 진행됨이 보고되어 있다. 본 실험에서도 대조군에서 TG, TC, LDL의 수치가 고지혈증이 지속됨에 따라 정상군에 비해 유의한 증가를 보였다. 하지만 영지 추출물에서 TG의 수치는 농도 의존적으로 적게 증가하는 것을 보였으며, TC와 LDL의 수치가 GL300에서 유의한 억제를 관찰할 수 있었다.
- 그 결과 대조군의 몸무게 증가는 정상군과 비교하여 큰 차이가 없었지만 GL300에서는 유의성 있게 체중의 변화가 감소하였다. 식이 효율 역시 GL300에서 대조군에 비교하여 유의한 감소를 보였는데 이러한 결과를 보았을 때 영지추출물은 체중증가의 감소를 통한 고지혈증 억제로 죽상경화증을 예방하는 효과가 있을 것으로 생각된다.
- 01). 신장주변 지방을 측정한 결과 정상군 (0.13±0.03g)에 비해 대조군 (0.37± 0.06g)에서 유의적인 증가를 보였고 (p<0.01), GL100의 지방 무게 (0.26±0.07g)는 감소하는 경향을 보였지만 GL300 (0.04±0.00g)에서는 정상군보다 감소하였다 (p<0.001). 내장지방의 무게 역시 대조군 (0.
- 5B). 영지추출물을 투여한 GL100에서는 대조군에 비하여 지방방울의 수가 크게 관찰되지 않았고(Fig. 5C), GL300에서는 지방방울이 거의 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 세포의 형태도 유지하고 있음을 확인 할 수 있었다(Fig. 5D).
- 영지추출물의 투여를 통해 죽상경화증의 예방 효과를 확인한 결과 동맥벽에 염증반응 및 지질축적의 주 역할을 하는 LDL 콜레스테롤의 수치를 감소 뿐만 아니라 동맥 조직에서의 효과 또한 확인하였다. 이러한 작용의 정확한 기전은 밝혀지지 않았지만 영지추출물이 죽상경화증 예방효과에 효과가 있다고 생각되며 추후연구를 진행할 예정이다.
- (Table 2). 정상군(7.75±0.97g)과 대조군(7.17 ±1.78g)의 체중의 변화는 큰 차이가 없었지만, GL100 (6.25±0.32g)에서는 감소하는 경향을 보였으며 GL300 (4.50±0.50g)에서는 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다 (p<0.05). 체중에 섭식량을 나눈 값으로 계산한 식이 효율은 정상군 (3.
- 05). 체중에 섭식량을 나눈 값으로 계산한 식이 효율은 정상군 (3.92±0.55%)에 비하여 대조군 (5.86±1.45 %)에서 증가하였으나 GL100 (4.84±0.22%)에서는 감소하는 경향을 보였고, GL300 (3.18±0.32%)은 대조군에 비해 유의하게 (p<0.05) 감소하였다(Table 2).
- 본 실험에서도 대조군에서 TG, TC, LDL의 수치가 고지혈증이 지속됨에 따라 정상군에 비해 유의한 증가를 보였다. 하지만 영지 추출물에서 TG의 수치는 농도 의존적으로 적게 증가하는 것을 보였으며, TC와 LDL의 수치가 GL300에서 유의한 억제를 관찰할 수 있었다. 따라서 혈중 지질의 감소가 간 조직의 손상 및 지질의 축적을 막을 수 있었고, 죽상경화증을 억제하였을 것으로 예상된다.
- 혈장에서 TG의 함량을 측정한 결과 정상군 (113.60± 8.85mg/dl)에 비하여 대조군의 TG수치 (835.75±216.92 mg/dl)는 유의성 있게 증가하였고 (p<0.01), 영지추출물 투여군인 GL100의 TG수치 (714.25±186.78mg/dl)와 GL300 의 TG수치 (425.25±77.14mg/dl)는 대조군에 비하여 농도 의존적인 감소경향을 보였다(Fig. 4A). 혈장 TC의 수치는 대조군 (1146.
후속연구
- 효과 또한 확인하였다. 이러한 작용의 정확한 기전은 밝혀지지 않았지만 영지추출물이 죽상경화증 예방효과에 효과가 있다고 생각되며 추후연구를 진행할 예정이다.
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