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문제 정의
- 그러나 거의 모든 농가에서 백신을 접종함에도 불구하고 매년 꾸준히 발생하고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 백신접종에도 불구하고 아직까지 매년 발생하고 있는 PED의 발생 이유를 분석하고자 충남에서 분리된 PEDV를 대상으로 S 유전자의 염기 및 아미노산 서열을 분석하였으며, 기존에 보고된 국내외 분리주 및 백신주 사이의 유전적 특성을 비교분석하였다.
제안 방법
- PCR은 cDNA template 1 μL, 10X LA PCR Buffer 5 μL, 25 mM MgCl2 5 μL, 2.5 mM dNTP Mixture 8 μL, 10 pM forward primer 1 μL, 10 pM reverse primer 1 μL, LA Taq DNA Polymerase (TaKaRa, Korea) 0.5 μL에총 반응용액 50 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후 PCR (denaturation 94oC/30 sec, annealing 52oC/30 sec, extention 72oC/90 sec, 35 cycles)을 핵산증폭기(C1000 Touch Thermal cycler, Bio-rad Inc., USA)를 사용하여 실시하였다.
- PEDV의 염기서열을 분석하기 위하여 S gene에서 증폭된 PCR 생성물을 Gel extraction kit를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석과 동일성은 Clustal W연산을 이용하여 다중 정렬하였으며, phylogenetic tree는 MEGA version 6 (Tamura 등, 2013)을 이용하여 neighbor-joining (NJ) method로 1,000회의 bootstrap을 실시하여 계통수를 생성하였으며, 분석된 유전자 서열은 GeneBank에 공개된 자료로 비교하였다(Table 3).
- S 유전자의 항원성에 대한 변이를 조사하고자 neutralizing epitope로 밝혀진 COE (503∼642 aa), SS2 (752∼758 aa), SS6 (768∼775 aa), 2C10 (1,372∼1,378 aa) 부위를 백신주인 SM-98주와 비교분석하였다.
- , USA)를 사용하여 실시하였다. 반응산물은 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 한 뒤 ethidium bromide로 염색하여 band를 확인하였으며 증폭된 유전자 크기는 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 같이 전기영동 하여 확인하였다.
- 소장 조직 유제를 PBS에 5% W/V로 만들어 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 채취하였다. 상층액에서 RNA추출은 MaxwellⓇ RSC Viral Total Nucleic acid Purification Kit (Promega, USA)를 이용하여 제조사의 술식에 따라 핵산을 추출하여 실험에 사용하였다.
- 설사증상을 보이는 자돈으로부터 PED를 확인하였으며 확인된 시료로부터 PED S gene을 증폭한 후 유전적 특성을 비교분석하였다. S gene의 염기서열은 분리주간 98.
대상 데이터
- 2016년 충남지역에서 PED로 진단된 농가의 시료(CNHS1, CNHS2, CNHS3, CNHS4, CNBR6)를 공시하였다(Table 1). 소장 조직 유제를 PBS에 5% W/V로 만들어 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 채취하였다.
- cDNA의 합성은 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio rad Laboratories, USA)를 이용하였으며, −20oC에 보관 후 PCR에 사용하였다.
- 1에 표시하였다. 합성한 primer로 증폭이 안되는 PEDVS3 region의 일부 시료(CNHS1, CNHS2, CNHS4)는 Genbank의 data (JN599150)를 기초로 primer를 제작하여 사용하였다(Table 2). cDNA의 합성은 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio rad Laboratories, USA)를 이용하였으며, −20oC에 보관 후 PCR에 사용하였다.
데이터처리
- PEDV의 염기서열을 분석하기 위하여 S gene에서 증폭된 PCR 생성물을 Gel extraction kit를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석과 동일성은 Clustal W연산을 이용하여 다중 정렬하였으며, phylogenetic tree는 MEGA version 6 (Tamura 등, 2013)을 이용하여 neighbor-joining (NJ) method로 1,000회의 bootstrap을 실시하여 계통수를 생성하였으며, 분석된 유전자 서열은 GeneBank에 공개된 자료로 비교하였다(Table 3).
이론/모형
- Putative similar regions of S gene of other distantly related coronavirus, transmissible gastroenteritis virus (TGEV), was also included in this study. Sequencing alignments were performed using the Clustal W program, and the phylogenetic tree was constructed from the aligned nucleotide sequences by using the neighbor-joining method. The bootstrap values were determined from 1,000 replicates of original data.
성능/효과
- PEDV S 유전자의 염기서열을 이용하여 국내외 분리주와 phylogenetic tree를 분석한 결과 본 연구에서 분리된 5주 모두 genogroup 2b (G2b) 계열에 속하였다. G2는 2개의 subgroup (G2a, G2b)으로 구성되는데 G2b에는 최근에 유행하는 국내 분리주(KNU-1305/2013, KNU-1409-1/2013)와 미국 분리주(IA2/2013, MN/2013, 13-019349/2013, IA1/2013), 캐나다 분리주(ON-007/2014)및 중국 분리주(CH/ZMDZY/1/2011, AH-2012/2012, JS-HZ2012/2012, BJ-2011-1/2011, GD-B/2012)가 속하였다.
- 0%)로 낮은 일치성을 보였다. Phylogenetic tree 분석에서는 기존에 국내에서 분리된 주와 같은 G2b 그룹에 속하는 것으로 확인되었다. 중화항체 유도부위로 알려진 COE (499∼638aa), SS2 (748∼755aa), SS6 (764∼771aa), 2C10(1,368∼1,374aa)에서는 백신주인 SM-98과 비교해서 14∼15개의 아미노산 변이가 나타났다.
- S gene의 염기서열은 분리주간 98.5∼99.9%, 아미노산은 96.7∼99.9%의 일치성을 보였으며, 미국 분리주인 IA2와 가장 높은 상동성을 보였다.
- 기존 국내에서 분리된 KNU-1305, KNU-1409-1과의 염기서열과 아미노산은 각각 99.0∼99.4%, 97.5∼99.3%의 높은 상동성을 보였다(Table 4).
- 본 연구에서 분리된 5개의 PEDV (CNHS1, CNHS2, CNHS3, CNHS4, CNBR6) S 유전자 염기서열을 분석한 결과 4,161 bp 길이의 염기서열과 1,386개의 아미노산으로 암호화되어 있었다. 염기서열과 아미노산 상동성을 분석한 결과 분리주간 염기서열 상동성은 98.
- 이 시기에 유행했던 야외분리주의 S 유전자를 분석한 결과 G2a 그룹으로, G1a 그룹에 속해 있는 CV777주나 국내 백신주와는 차이가 있었으며 이 후 폭발적으로 발생했던 2013∼2014년에는 G2b 그룹으로 미국 분리주와 상당히 밀접해 있음이 보고되었다(Lee와 Lee, 2014; Lee 등, 2015). 본 연구에서 분리된 5주의 S 유전자의 염기서열도 G2b 계열로 백신주인 SM-98 및 DR-13주와는 다른 그룹을 형성하고 있으며 2013년에 발생했던 IA2, MN, 13-019349주 등 미국 분리주와 가장 유사함을 보여 앞서 보고된 결과와 일치함을 알 수 있었다.
- 염기서열과 아미노산 상동성을 분석한 결과 분리주간 염기서열 상동성은 98.5∼99.9%, 아미노산 상동성은 96.7∼99.9%을 나타내었으며 가장 높은 상동성을 보이는 주는 IA2 (미국 분리주)로 염기서열 상동성은 99.1∼99.5%, 아미노산 상동성은 97.8∼99.4%였다.
- PEDV S protein은 표면에 위치한 유일한 표면단백질로 중화항체 생성에 관여하며 유전자의 변이에 따라 PED의 병원성 및 백신개발에 영향을 미칠 수 있기 때문에 S 유전자의 genotype은 매우 중요하다고 알려져 있다(Song 등, 2015). 이번 충남지역에서 분리한 5주의 염기서열 및 아미노산서열을 분석한 결과 1,386개의 아미노산을 암호화하는 4,161개의 염기로 구성되어 있었으며 CV777과 비교해서는 9개의 염기(3개의 아미노산), SM98과는 18개의 염기(6개의 아미노산)가 더 길었다. S 유전자 중 가장 변이가 심하다고 알려져 있는 N-terminal 부분에서 CV777과는 아미노산 삽입 2부위(4-aa, 1-aa) 및 결손 1부위(2-aa), SM-98과는 아미노산 삽입 2부위(4-aa, 1-aa) 및 결손 2부위(4-aa, 2-aa)가 관찰되었다.
- 중화항체 유도부위로 알려진 COE (499∼638aa), SS2 (748∼755aa), SS6 (764∼771aa), 2C10(1,368∼1,374aa)에서는 백신주인 SM-98과 비교해서 14∼15개의 아미노산 변이가 나타났다.
- G2는 2개의 subgroup (G2a, G2b)으로 구성되는데 G2b에는 최근에 유행하는 국내 분리주(KNU-1305/2013, KNU-1409-1/2013)와 미국 분리주(IA2/2013, MN/2013, 13-019349/2013, IA1/2013), 캐나다 분리주(ON-007/2014)및 중국 분리주(CH/ZMDZY/1/2011, AH-2012/2012, JS-HZ2012/2012, BJ-2011-1/2011, GD-B/2012)가 속하였다. 한편 국내 백신주로 사용되고 있는 DR-13과 SM-98주는 G1 계열로 현재 유행하고 있는 PEDV와는 계통발생학적으로 차이가 있음을 알 수 있었다(Fig. 3).
후속연구
- 중화항체 유도부위로 알려진 COE (499∼638aa), SS2 (748∼755aa), SS6 (764∼771aa), 2C10(1,368∼1,374aa)에서는 백신주인 SM-98과 비교해서 14∼15개의 아미노산 변이가 나타났다. 본 연구에서 분리된 PEDV의 아미노산 변이가 항원성 변화를 유발하는지에 대해서는 좀 더 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 유전자 염기서열 분석을 통해 충남지역에서 분리된 PEDV가 최근 국내에서 유행하는 같은 계열의 바이러스임이 확인되었으나 RNA 바이러스 특성상 변이가 매우 빠르게 이루어질 것이며, 국내 백신주로 사용되는 SM-98과 DR-13주와의 염기서열 및 아미노산서열을 비교하였을 때 각각 5.3∼6.9% 및 5.7∼8.8%의 많은 차이가 있음을 볼 때 앞으로도 국내에 유행하는 PEDV 변이주에 대한 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다.
- 지속적으로 PED 백신을 접종함에도 불구하고 질병의 발생이 감소되지 않는 이유로 현재까지 많은 연구자들이 야외주와 백신주간의 유전자적 차이로 인해 방어력이 저하되는 것으로 추정하고 있다. 이에 국내 유행하는 야외주를 이용한 백신 개발의 필요성이 요구되고 있지만 Chen 등(2014)의 연구에 따르면 바이러스 특성상 세포배양을 통한 계대 시 감염력이 소실되어 바이러스 분리가 어렵다고 보고되고 있어 바이러스 특성 규명을 위한 좀 더 구체적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
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