국내시판 식용버섯의 16종의 열수 추출물을 이용하여 L-DOPA oxidation activity, melanin 합성 억제활성을 통해 미백에 가장 효능이 우수한 버섯으로 갈색백만송이버섯 (No. 10)과 흰색만가닥버섯 (No. 15)를 선별하였다. 또 멜라닌 세포와 표피가 재현된 인공피부를 이용하여 이 두 가지 버섯 열수 추출물의 미백 효과를 확인한 결과 흰색만가닥버섯 (No. 15)이 가장 우수함을 확인하였다.
국내시판 식용버섯의 16종의 열수 추출물을 이용하여 L-DOPA oxidation activity, melanin 합성 억제활성을 통해 미백에 가장 효능이 우수한 버섯으로 갈색백만송이버섯 (No. 10)과 흰색만가닥버섯 (No. 15)를 선별하였다. 또 멜라닌 세포와 표피가 재현된 인공피부를 이용하여 이 두 가지 버섯 열수 추출물의 미백 효과를 확인한 결과 흰색만가닥버섯 (No. 15)이 가장 우수함을 확인하였다.
Hot water extracts from 16 domestic edible mushrooms including Pleurotus ferulae (Lanzi) X.L. Mao, Lentinula edodes (Berk.) Pegler, and Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow, which are commercially available, were used for determining the cosmetic potential of these mushrooms. In this study, we c...
Hot water extracts from 16 domestic edible mushrooms including Pleurotus ferulae (Lanzi) X.L. Mao, Lentinula edodes (Berk.) Pegler, and Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow, which are commercially available, were used for determining the cosmetic potential of these mushrooms. In this study, we carried out in vitro functional experiments to determine the inhibitory effects of these extracts on L-DOPA oxidation of tyrosinase and melanin synthesis. Based on the results of these experiments, H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow No. 10 and No. 15 were selected for further analysis. We analyzed the melanin synthesis inhibitory activity, TRP1 and MITF expression via real-time PCR, and Fontana Masson staining in artificial skin $Neoderm^{(R)}-ME$. Taken together, we observed that the hot water extract from H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow (No. 15) had better whitening effect than the extracts of other mushrooms. Thus, it can be a potential source of skin-whitening agent.
Hot water extracts from 16 domestic edible mushrooms including Pleurotus ferulae (Lanzi) X.L. Mao, Lentinula edodes (Berk.) Pegler, and Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow, which are commercially available, were used for determining the cosmetic potential of these mushrooms. In this study, we carried out in vitro functional experiments to determine the inhibitory effects of these extracts on L-DOPA oxidation of tyrosinase and melanin synthesis. Based on the results of these experiments, H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow No. 10 and No. 15 were selected for further analysis. We analyzed the melanin synthesis inhibitory activity, TRP1 and MITF expression via real-time PCR, and Fontana Masson staining in artificial skin $Neoderm^{(R)}-ME$. Taken together, we observed that the hot water extract from H. marmoreus (Peck) H.E. Bigelow (No. 15) had better whitening effect than the extracts of other mushrooms. Thus, it can be a potential source of skin-whitening agent.
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제안 방법
, Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. bigelow 등을 포함한 국내 식용버섯 16 종의 국내 식용버섯들의 열수 추출물을 이용하여 미백 기능성을 가진 향장 원료로서의 사용 가능성을 확인하고자 각 피부세포에서의 MTT assay를 통해 세포 안정성을 평가하고, L-DOPA 산화를 통한 tyrosinase 활성 억제 및 melanin contents formation 실험을 통한 미백 in vitro 실험을 진행한 후 in vivo 실험을 대체하고자 표피와 멜라닌세포가 재현된 인공피부 (Neoderm®-ME)를 사용하여 real-time PCR 및 melanin contents formation, Fontana-Masson staining을 실시하였다.
L-DOPA 에 1000 μg/ml의 각 버섯 열수 추출물을 처리하고 tyrosinase를 이용하여 공시료를 처리한 control 군을 기준으로 tyrosinase를 통한 L-DOPA oxidation inhibitory rate를 백분율로 계산하였다.
에탄올을 완전히 제거한 후 ultra pure water를 첨가하여 micro spectrophotometer (Titertek berthold, Germany)로 농도를 조절하고 reverse transcript를 통하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Takara사의 qPCR master mix시약을 이용하였고 Gene cycler (BioRad, USA)를 통해 37o에서 15분, 50oC에서 5분, 그리고 98oC에서 5분으로 각각 enzyme reaction time 및 enzyme inactivation time을 세팅하였다. 합성된 cDNA는 –20oC에 보관하며 필요시 사용했으며, real-time PCR은 SYBR (Takara, Japan) 및 각 각의 관련 gene의 primer (Table 2)를 첨가하여 Thermal cycler dice (Takara, Japan)를 통해 진행하였다.
각 버섯 열수추출물의 in vitro 세포독성은 세포 내 미토콘드리아의 NAD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes와 MTT 용액의 반응을 이용하여 측정하였으며, 세포 생존율은 human keratinocyte인 HaCaT cell과 mouse melanocyte인 B16F10을 이용하여 버섯 열수추출물 무 처리군인 control 군을 기준으로 하여 백분율로 나타냈다. 즉, Fig 1.
각 버섯 열수추출물의 melanin contents 합성은 Hosoi 등 (1985)의 방법과 유 등 (2009)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, melanoma cell line인 B16F10 세포를 6well plate에 5×10 5 /well 농도로 분주하여 37oC, 5% CO2ncubator에 over night 하였다.
각 버섯 열수추출물의 tyrosinase 저해 활성은 Kong 등 (2000)과 권 등 (2015)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 96 well ELISA plate에 0.
다시 증류수 tapping하며 세척하고 Nuclear-fast red를 5분간 처리한 후 최종적으로 증류수로 가볍게 tapping하고 건조시킨 후 깨끗한 상태에서 cover slip을 덮고 1,500×(Olympus, Japn)에서 촬영하였다(최, 2011).
멜라닌 생성 자극 호르몬인 α-MSH와 공시료만을 처리한 control군을 기준으로 하여 각 버섯 추출물의 멜라닌 생성 자극 호르몬에 의한 멜라닌 생성의 저해율을 백분율로 계산하였다.
버섯 열수 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 사람 유래의 표피와 melanocyte가 구현된 Neoderm®-ME를 이용하여 melanin synthesis inhibitory activity, Fontana-masson염색과 real-time PCR을 수행하였다.
선행한 실험 결과를 참고로 갈색백만송이버섯 (No. 10) 과 흰색만가닥버섯 (No. 15) 열수 추출물을 선별하여 in vivo 실험을 대신할 수 있는 인공피부 in vitro 실험을 진행하였다. 버섯 열수 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 사람 유래의 표피와 melanocyte가 구현된 Neoderm®-ME를 이용하여 melanin synthesis inhibitory activity, Fontana-masson염색과 real-time PCR을 수행하였다.
상태에서 배양하였다. 시료는 총 6일 동안 처리하였고 배지는 3일에 한 번씩 교환하였다.
이후 배지를 제거하고 100 nM α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH :Sigma, USA)와 각 농도별 버섯 열수추출물이 첨가된 free-phenol red DMEM (Hyclone, USA)을 분주하여 72시간 배양하였다.
즉, melanoma cell line인 B16F10 세포를 6well plate에 5×10 5 /well 농도로 분주하여 37oC, 5% CO2ncubator에 over night 하였다.
추출물은 Whatman filter paper (No.3)으로 여과한 다음 rotary evaporator (Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Japan)을 통해 감압농축을 한 후 동결건조기(Ilshin, Korea)를 이용하여 분말화하였고, –20oC에서 보관하며 실험마다 필요한 농도에 맞춰 사용하였다 (Table 1).
본 실험에서 사용된 버섯은 아위느타리 및 황금송이, 표고, 양송이, 팽이, 참타리, 새송이, 느타리, 백만송이(흰색), 백만송이(갈색), 신령버섯, 목이, 고기느타리, 맛타리, 흰색만가닥버섯 그리고 갈색느티만가닥버섯로 수원 소재 이마트 및 농협하나로 마트에서 구입하였다. 추출물을 제조하기 위해 16 종의 버섯을 각각 수세 및 세절 후에 g당 20 배의 증류수를 가해 100oC 이상에서 30분간 자비하였다. 추출물은 Whatman filter paper (No.
합성된 cDNA는 –20oC에 보관하며 필요시 사용했으며, real-time PCR은 SYBR (Takara, Japan) 및 각 각의 관련 gene의 primer (Table 2)를 첨가하여 Thermal cycler dice (Takara, Japan)를 통해 진행하였다.
대상 데이터
Mold와 paraffin을 분리하여 paraffin block을 제조하고 block을 자르기 전까지 냉동실에 보관하였다. Block을 절단하기 위해서 micro tome(Leica)를 사용하였다. 먼저 세운 조직이 잘라낸 부분이 나올 때까지 10 μm두께로 trimming하였다.
국내시판 식용버섯의 16종의 열수 추출물을 이용하여 L-DOPA oxidation activity, melanin 합성 억제활성을 통해 미백에 가장 효능이 우수한 버섯으로 갈색백만송이버섯 (No. 10)과 흰색만가닥버섯 (No. 15)를 선별하였다. 또 멜라닌 세포와 표피가 재현된 인공피부를 이용하여 이 두 가지 버섯 열수 추출물의 미백 효과를 확인한 결과 흰색만가닥버섯 (No.
본 실험에서 사용된 버섯은 아위느타리 및 황금송이, 표고, 양송이, 팽이, 참타리, 새송이, 느타리, 백만송이(흰색), 백만송이(갈색), 신령버섯, 목이, 고기느타리, 맛타리, 흰색만가닥버섯 그리고 갈색느티만가닥버섯로 수원 소재 이마트 및 농협하나로 마트에서 구입하였다. 추출물을 제조하기 위해 16 종의 버섯을 각각 수세 및 세절 후에 g당 20 배의 증류수를 가해 100oC 이상에서 30분간 자비하였다.
인체 유래의 keratinocyte cell line인 HaCaT 세포주는 American Type culture Collection (ATCC, USA)에서 그리고 mouse 유래의 melanoma cell line인 B16F10 세포 주는 한국세포주은행 (KCLB, korea)에서 구입하여 실험을 진행하였다. 각 세포는 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS)와 1% penicillin-streptomycin(Hyclone, USA)이 첨가된 DMEM medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Hyclone, USA)을 이용하여 37oC, 5% CO2조건에서 배양하였다.
모든 결과는 mean±SD로 나타내었고, 통계처리는 GraphPad Prism (Ver. 5.01)을 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 이용하였으며 평균 차에 대한 통계적 유의성 검증은 Dunnett’s test를 통해 p < 0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
Cell viability는 Carmicheal 등 (1987)의 방법에 따라 살아있는 세포 내의 mitochondria dehydrogenase와 MTT 와의 반응을 이용하여 실행하였다. 각 세포는 5×10 4 /ml의 농도로 96 well plate (Thermo fisher scientific, USA)에 분주 후, 37oC, 5% CO2 조건에서 24 시간 배양하였다.
성능/효과
A와 같이 α-MSH 에 무 처리군인 control을 기준하여 계산하였을 때, 1000μg/ml의 갈색백만송이버섯과 1000 μg/ml의 흰색만가닥버섯 (No. 15) 열수 추출물은 양성대조군인 1000 μg/ml arbutin과 유사한 melanin 합성 저해 활성을 확인할 수 있었다.
는 real-time PCR을 측정하여 housekeeping gene인 βactin의 Cp값을 기준으로 ratio를 계산한 결과로 melanin synthesis pathway 중 5,6-Dihydroxyindole–2-carboxylic acid를 Indole-5,6-quinone carboxylic acid로 변환시키는중요인자 중 하나인 tyrosinase related protein 1 (TRP1) 의 발현이 흰색만가닥 (No. 15) 열수 추출물을 처리한 군에서 가장 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
15) 열수 추출물을 처리한 군에서 가장 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 또 synthesis pathway 중 tyrosinase와 TRP1, TRP2 생성에 관여하는 MITF의 발현 역시 흰색만가닥버섯 (No.15)열수 추출물을 처리한 군에서 가장 억제 되는 것을 알 수 있었다.
15)를 선별하였다. 또 멜라닌 세포와 표피가 재현된 인공피부를 이용하여 이 두 가지 버섯 열수 추출물의 미백 효과를 확인한 결과 흰색만가닥버섯 (No. 15)이 가장 우수함을 확인하였다.
15) 열수 추출물은 양성대조군인 1000 μg/ml arbutin과 유사한 melanin 합성 저해 활성을 확인할 수 있었다. 또한 조직 내에서 합성된 melanin은 Fontana-Masson 염색을 통하여 육안으로 확인한 결과 크기가 크고 다량의 melanin이 존재하는 control과 달리 갈색백만 송이버섯 (No. 10)과 흰색만가닥버섯 (No. 15) 열수 추출 물은 양성 대조군인 arbutin과 같이 melanin의 입자가 작아지고 수가 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4.B). Fig.
버섯 열수 추출물의 같은 농도인 1000 μg/ml에서는 arbutin군은 70%의 저해 효과를 나타내어 버섯 열수 추출물 보다 상대적으로 우수한 L-DOPA oxidation 저해능이 있었으며, 이는 고순도 기능성 물질과 조추출물간의 차이에 기인한 것으로 사료된다.
Wu 등 (2016)과 Hyde 등 (2010)의 결과에서 보듯이 미백 기능성화장품에 사용되고 있는 버섯으로는 식용버섯인 Lentinula edodes 이 외에 약용버섯인 Cordyceps sinensis와 Schizophyllum commune, Inonotus obliquus 등이 사용되고 있다. 본 연구 결과, 식용으로 시판되고 있는 흰색만가닥버섯과 갈색백만송이버섯 열수추출물에서도 Lentinula edodes와 Agaricus blazei Murill을 포함한 14종의 버섯 보다 높은 피부미백활성을 확인하였고, 인공 피부를 이용한 실험에서도 그 효능을 확인할 수 있었다. 앞으로 흰색만가닥버섯과 갈색백만송이버섯의 용매별 추출물 및 성분의 분석 등 추가적인 실험을 통해 추출물 내의 어떠한 물질이 melanin synthesis pathway에 직접 적인 활성에 관여하는지 증명함으로써 미백 기능성에 대한 각 버섯 추출물의 활용성이 더욱 증대될 것으로 판단된다.
이로써 각 버섯 열수추출물의 농도를 1000 μg/ml로 설정하여 실험을 진행하였고 keratinocyte와 melanoma에대한 세포독성이 없다는 것을 확인할 수 있었다.
즉, Fig. 3과 같이 아위느타리 (No.1)과 느타리(참타리) (No. 6), 큰느타리 (No. 7), 흰색백만 송이버섯 (No. 9), 갈색백만송이버섯 (No. 10), 산느타리 (No. 13), 흰색만가닥버섯 (No. 15), 갈색느티만가닥 버섯 열수 추출물 (No. 16)이 1000 μg/ml의 arbutin과 유사한 정도의 높은 melanin synthesis inhibitory rate를 확인할 수 있었다.
후속연구
그 밖에 권(2015)이 사용한 양성대조군인 200 μM arbutin와 비슷한 농도의 50 ppm 큰느타리 매탄올 추출물의 melanin synthesis inhibitory rate를 비교해 보았을 때, 큰느타리의 메탄올 추출물이 본 연구에서 사용한 열수추출물보다 조금 더 우수한 효과가 있는 것으로 보고하고 있으며 huang 등(2014)의 연구결과에서도 신령버섯 메탄올 추출물이 열수추출물 보다 melanin 생성을 억제할 수 있는 것으로 판단되었으며 향 후 추출용매에 따른 버섯 추출물의 melanin 생성억제 효과는 좀 더 연구가 진행되어야 할 것으로 사료되었다.
본 연구 결과, 식용으로 시판되고 있는 흰색만가닥버섯과 갈색백만송이버섯 열수추출물에서도 Lentinula edodes와 Agaricus blazei Murill을 포함한 14종의 버섯 보다 높은 피부미백활성을 확인하였고, 인공 피부를 이용한 실험에서도 그 효능을 확인할 수 있었다. 앞으로 흰색만가닥버섯과 갈색백만송이버섯의 용매별 추출물 및 성분의 분석 등 추가적인 실험을 통해 추출물 내의 어떠한 물질이 melanin synthesis pathway에 직접 적인 활성에 관여하는지 증명함으로써 미백 기능성에 대한 각 버섯 추출물의 활용성이 더욱 증대될 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
버섯은 어디에 속해있는가 ?
이 중 버섯은 미생물 중에서 균류에 속하며, 분류학적으로는 대부분의 담자균류와 일부의 자낭균류가 속해있다 (Yoo, 2005). 정의로는 눈으로 볼 수 있고 손으로 만질 수 있는 정도로 큰 자실체를 가지며, 유성생식을 하므로 생식기관인 자실체는 반드시 유성포자를 형성하고, 땅속, 땅위, 나무 등에서 생육하는 균류를 모두 포함한다(Chang, 1993).
버섯의 특징은 ?
정의로는 눈으로 볼 수 있고 손으로 만질 수 있는 정도로 큰 자실체를 가지며, 유성생식을 하므로 생식기관인 자실체는 반드시 유성포자를 형성하고, 땅속, 땅위, 나무 등에서 생육하는 균류를 모두 포함한다(Chang, 1993). 그리고 버섯은 특유한 맛과 향기를 지닌 기호성이 높은 식품이며(Ota, S., 1984) 일반적으로 지질이 적고 당과 단백질 및 핵산이 풍부하며 특히 Vitamin D의 전구체인 ergosterol을 함유하고 있어 식용 외에도 일부가 민간요법이나 한방의약에 쓰이고 있고 어린이와 임산부, 노화가 시작되는 중년 이후의 사람들에게 유용하다고 알려져 있다(성, 2000). 버섯이 가지는 약리작용으로는 Pleurotusferulae의 콜레스테롤저해 및 유해산소 제거 (Hong, 2004), Lentinula edodes (Berk.
버섯의 정의는 ?
이 중 버섯은 미생물 중에서 균류에 속하며, 분류학적으로는 대부분의 담자균류와 일부의 자낭균류가 속해있다 (Yoo, 2005). 정의로는 눈으로 볼 수 있고 손으로 만질 수 있는 정도로 큰 자실체를 가지며, 유성생식을 하므로 생식기관인 자실체는 반드시 유성포자를 형성하고, 땅속, 땅위, 나무 등에서 생육하는 균류를 모두 포함한다(Chang, 1993). 그리고 버섯은 특유한 맛과 향기를 지닌 기호성이 높은 식품이며(Ota, S.
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