[논문]죽엽 열수추출물의 염증억제 효과

손진원; 박상미; 정지윤; 황보민; 조일제; 정태영; 박정아; 김상찬; 지선영

doi:10.14374/hfs.2016.24.4.259

죽엽 열수추출물의 염증억제 효과
Anti-inflammatory Effects of the Water Extract of Phyllostachys Folium via NF-κB Inhibition 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.24 no.4, 2016년, pp.259 - 269

손진원 (대구한의대학교 한의과대학) , 박상미 (대구한의대학교 한의과대학) , 정지윤 (대구한의대학교 한의과대학) , 황보민 (대구한의대학교 한의과대학) , 조일제 (대구한의대학교 한의과대학) , 정태영 (대구한의대학교 한의과대학) , 박정아 (대구한의대학교 한의과대학) , 김상찬 (대구한의대학교 한의과대학) , 지선영 (대구한의대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Phyllostachys Folium is leaves of Phyllostachys nigra var. henesis $S_{TAPF}$. In the East Asian traditional medicine, the herb has been used to treat nasal bleeding, dysuria, epilepsy and etc. The present study was conducted to evaluate the anti-inflammatory effects of the Phyllostachys Folium water extracts (PFE) in vitro and in vivo model. Methods : Cell viability was measured by MTT assay after the treatment of PFE and NO production was monitored by measuring the nitrite content in culture medium. iNOS, COX-2, $I{\kappa}B$, $p-I{\kappa}B{\alpha}$ amd $NF{\kappa}B$ were detected by immunoblot analysis, and levels of cytokine were analyzed by sandwich ELISA kit. Anti-edema effect of PFE was determined in the carrageenan-induced paw edema model in rats. Results : LPS increased NO and cytokines levels compared with control, these increases were attenuated by PFE. In addition, LPS-induced pro-inflammatory proteins such as iNOS, COX-2 were down regulated by PFE. These anti-inflammatory effect of PFE results from inhibition of phosphorylation of $I{\kappa}B$ and translocation of $NF-{\kappa}B$. Conclusion : These results show that PFE has some anti-inflammatory effects which might play a role in gram-negative bacterial infection inflammation and $NF{\kappa}B$ activated diseases.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

aereus, Salmonella typhimurium에 항균효과가 있음을 보고하였고, 송 등⁹⁾은 죽엽 물추출물이 Sarcoma-180을 처치한 생쥐의 생존율을 연장시키며, 암종/체중의 비율을 유의성 있게 감소시킴을 밝혀 죽엽의 항암활성을 제시하였다. 그러나 죽엽의 항염증효과에 관한 연구는 매우 제한적인 실정으로, 본 연구에서는 죽엽 열수추출물 (PFE)의 염증억제 기전 및 염증관련 cytokine의 발현에 대한 평가를 하였으며, in vivo 연구로 carrageenan으로 유도된 rat의 족부종에 대한 부종억제효과를 평가하였다.
본 연구는 죽엽의 항염증효과를 평가하기 위하여, LPS로 활성화된 Raw 264.7 cells에서 죽엽의 처치가 염증매개물질에 미치는 영향과 carrageenan으로 유도된 염증성 족부종에 대한 죽엽의 효능을 평가하고자 수행하였다.
본 연구에서는 PFE의 염증매개물질억제 작용이 NF-κB pathway와 관련됨을 평가하기 위하여 세포질에서 I-κBα의 발현과 인산화를 평가하고, 핵 분획으로의 NF-κB의 이동을 평가하였다.
본 연구에서는 세포질에서 IκBα의 발현과 인산화를, 핵분획에서 NF-κB의 발현을 평가하였다.
본 연구에서는 죽엽이 淸熱瀉火藥임에 근거하여 죽엽추출물의 항염증활성을 평가하고자 하였다. In vitro 연구로 LPS로 활성화된 설치류 대식세포주인 Raw 264.

제안 방법

Cytokine 및 prostaglandin E2 (PGE2)를 측정하기 위하여 6 well plate에 cells (5×105 /㎖)을 분주하고 PFE를 농도별로 처치한 다음, 1시간 후에 LPS를 처치하였다.
0 g/㎏ PFE군으로 나누었으며, 각군당 수는 5마리로 하였다. Dexamethasone과 PFE는 4일 동안 매일 1회 투여하였으며, 마지막 약물투여 1시간 후 carrageenan을 100 ㎕/rat로 rat의 오른쪽 발바닥에 주입하여 족부종을 유발하였다. 족부종의 측정은 carrageenan 주입 후 0, 1, 2, 3, 4시간에 부종 측정기 (Plethysmometer, LE 7500; LETICA Scientific Instruments, Spain)를 이용하여 부종 정도를 측정하였다.
본 연구에서는 죽엽이 淸熱瀉火藥임에 근거하여 죽엽추출물의 항염증활성을 평가하고자 하였다. In vitro 연구로 LPS로 활성화된 설치류 대식세포주인 Raw 264.7 cells 모델에서 염증의 기전 및 염증관련 cytokine의 발현에 대한 평가를 하였으며, in vivo 연구로 CA로 유도된 rat의 족부종에 대한 부종억제효과를 평가하였다.
/㎖)을 분주하고 PFE를 농도별로 처치한 다음, 1시간 후에 LPS를 처치하였다. LPS 처치 후 특정 시간에 배지를 수거하여 cytokine과 PGE₂를 측정하였다. Tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-6와 PGE₂는 ELISA kit를 사용하여 측정하였다.
PFE가 LPS에 의해 활성화된 NF-κB를 억제하여 in vitro에서 염증매개물질을 억제함을 확인하고, carrageenan (CA)으로 유도된 염증동물모델에서 족부 종을 측정하였다.
7 cells에서 NO의 생성을 억제할 수 있음을 의미한다. PFE가 NO를 억제함을 확인하고, NO를 생성함에 핵심적인 역할을 하는 iNOS 단백질의 발현을 살펴보았다. iNOS는 LPS에 의해 발현이 현저히 증가되었고, PFE에 의해 LPS로 유도된 iNOS의 발현량이 뚜렷하게 감소되었다.
PFE가 in vitro에서 LPS에 의해 활성화된 NF-κB pathway를 억제하여 염증매개물질을 억제함을 확인하고, in vivo로써 carrageenan으로 유도된 염증동물모델에서 PFE가 염증성 족부종을 억제할 수 있는지 평가하였다.
PFE가 유의한 세포독성 없이 NO를 억제 하였으므로, NO의 생성과 관련되는 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 단백질의 발현을 평가하였다. LPS 처치 시에는 iNOS 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 PFE를 처치한 실험군에서는 iNOS의 발현량이 뚜렷하게 감소되었다 (Fig.
PFE를 10-300 ㎍/㎖의 농도로 24시간 세포에 처리 하여 생성되는 NO양을 측정하였다. LPS군에서는 Control군에 비교하여 NO의 생성량이 2.
PFE를 1시간 전처치한 후, LPS를 24시간 처치하고, 각 군별 세포배양 상등액 50 ㎕을 96 well plate에 넣고, Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 50 ㎕를 혼합하고 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 Titertek Multiskan automatic microplate reader로 흡광도를 측정하였다.
Raw 264.7 cells를 96 well plate에 5×104 cells/well로 분주한 다음 PFE를 농도별로 처리하여 MTT assay를 시행하였다.
Tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-6와 PGE2는 ELISA kit를 사용하여 측정하였다.
1 ㎎/㎖)용액을 50 ㎕씩 넣고 4시간 배양한 후 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹여 Titertek Multiskan automatic microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, LPS와 PFE의 동시처리에 의한 세포생존율 역시 동일한 방법으로 세포생존율을 구하였다. 세포생존율은 control cells에 대한 백분율로 나타내었다.
7 cells를 96 well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주한 다음 PFE를 농도별로 처리하여 MTT assay를 시행하였다. 세포에 10-100 ㎍/㎖의 농도로 PFE를 처치한 후 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 24시간 배양하고, 각 well당 MTT (0.1 ㎎/㎖)용액을 50 ㎕씩 넣고 4시간 배양한 후 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹여 Titertek Multiskan automatic microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, LPS와 PFE의 동시처리에 의한 세포생존율 역시 동일한 방법으로 세포생존율을 구하였다.
실험은 아무런 처치를 하지 않은 군을 Control군, carrageenan (100 ㎕/rat)만을 피하주사한 CA군, carrageenan과 dexamethasone (1 ㎎/㎏, p.o.)을 투여한 DEXA군, carrageenan과 0.3 g/㎏의 PFE를 투여한 0.3 g/㎏ PFE군, carrageenan과 1.0 g/㎏의 PFE를 투여한 1.0 g/㎏ PFE군으로 나누었으며, 각군당 수는 5마리로 하였다. Dexamethasone과 PFE는 4일 동안 매일 1회 투여하였으며, 마지막 약물투여 1시간 후 carrageenan을 100 ㎕/rat로 rat의 오른쪽 발바닥에 주입하여 족부종을 유발하였다.
이 membrane에 iNOS, COX-2, p-IκB, NFκB, actin, lamin 등의 항체에 반응 및 blocking과 세척 후 horseradish peroxidase conjugated secondary antibody를 결합시키고, 이를 ECL western blotting detection reagents (Amersham)를 사용하여 발색하였다.
Dexamethasone과 PFE는 4일 동안 매일 1회 투여하였으며, 마지막 약물투여 1시간 후 carrageenan을 100 ㎕/rat로 rat의 오른쪽 발바닥에 주입하여 족부종을 유발하였다. 족부종의 측정은 carrageenan 주입 후 0, 1, 2, 3, 4시간에 부종 측정기 (Plethysmometer, LE 7500; LETICA Scientific Instruments, Spain)를 이용하여 부종 정도를 측정하였다.
죽엽 열수추출물(PFE)의 항염증효능을 평가하기 위하여, LPS로 활성화된 Raw 264.7 cells에서 NO의 생성량, iNOS, COX-2의 발현 및 TNF-α, IL-6, PGE2, NF-κB에 미치는 PFE의 영향 및 carrageenan으로 유도된 rat의 족부종에 미치는 PFE의 영향을 살펴 본바 다음과 같은 결론을 얻었다.
08 g을 얻었으며, 사용 때까지 -20℃에서 보관하였다. 죽엽추출물 (Phyllostachys Folium Extract; PFE)의 수율은 3.0%였으며 in vitro 처치시에는 DMEM에 녹여 사용하였으며, in vivo 실험에서는 생리식염수에 녹여 사용하였다.

대상 데이터

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetraz oleum (MTT)와 LPS (Escherichia coli 026:B6; Difco, Detroit, MI, USA)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS), Penicillin 및 streptomycin은 Gibco/BRL (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. Western blot에 사용된 antibody들은 BD Bioscience (San Jose, CA, USA), Cayman (Ann Arbor, Mi, USA), Zymed (San Francisco, CA, USA)에서 각각 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell (Dassel, Germany)에서 구입하였다.
Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin 및100 ㎍/㎖ streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 환경이 유지되는 배양기에서 배양하였다.
TNF-α, IL-1β, IL-6의 ELISA kit는 Pierce endogen (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
Western blot에 사용된 antibody들은 BD Bioscience (San Jose, CA, USA), Cayman (Ann Arbor, Mi, USA), Zymed (San Francisco, CA, USA)에서 각각 구입하였고, NC paper는 Schleicher & Schuell (Dassel, Germany)에서 구입하였다.
실험동물은 4주령 된 Sprague-Dawley 계 수컷 흰쥐(130-160 g)를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 60%, 12시간 light/dark cycle을 유지하고, 사료 (Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음료는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 동물실험은 대구한 의대학교 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 규정에 따라 윤리위원회의 승인 (DHU2013-091)을 획득한 후 시행 하였다.
죽엽 (Phyllostachys Folium)은 대원약업사(대구)에서 구입하였으며, 죽엽 300 g에 물 1.5 ℓ를 넣고 약탕기 (대웅, 한국)로 3시간 추출한 후, 추출물을 거즈로 1차 여과하고 3000×g에서 3분간 원심분리하였다.

데이터처리

실험 결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 처치군 간의 유의성은 one way analysis of varience (ANOVA)로 검정한 후 Newman-Kleuls test로 검정하였다.

성능/효과

1. PFE는 LPS로 증가된 NO를 유의적으로 억제하였으며, iNOS의 발현 역시 억제하였다. 또한, PFE는 LPS에 의해 활성화된 Raw 264.
2. PFE는 LPS에 의해 발현이 증가된 COX-2 단백질의 발현을 감소시켰으며, PGE₂역시 PFE의 처치에 의하여 유의하게 감소하였다.
3. PFE는 LPS로 활성화된 p-I-κBα의 발현을 억제 하고, 핵분획에서의 NF-κB의 발현을 유의하게 억제하였다.
4. Carrageenan으로 유도된 rat의 족부종에 대하여 PFE (0.3g/kg)은 4시간에, PFE (1.0g/kg)은 1, 4시간에 염증성 부종을 유의성있게 억제하였다.
CA군의 족부종은 control군에 비교 하여, 1, 2, 3, 4 시간에 각각 149.61 ± 18.22, 164.85 ± 13.42, 174.25 ± 9.02, 169.01 ± 8.66 (%)로 유의한 발 부종을 유발하였다.
PFE 0.3 g/㎏를 투여한 군에서는 1-4 시간에 각각 133.31 ± 6.00, 161.51 ± 3.07, 169.68 ± 4.79, 146.90 ± 14.71 (%)를 나타내어 4 시간에 유의한 족부종의 억제를 나타내었으며, PFE 1.0 g/㎏를 투여한 군에서는 각각 122.97 ± 11.00, 150.11 ± 9.79, 157.74 ± 12.24, 140.59 ± 2.65 (%)로 1, 4시간에 유의한 족부종의 억제를 나타내었다 (Fig. 7).
PFE가 NO를 억제함을 확인하고, NO를 생성함에 핵심적인 역할을 하는 iNOS 단백질의 발현을 살펴보았다. iNOS는 LPS에 의해 발현이 현저히 증가되었고, PFE에 의해 LPS로 유도된 iNOS의 발현량이 뚜렷하게 감소되었다. 이러한 결과는 PFE가 NO를 억제함에 있어 iNOS단백질의 발현억제가 매개 됨을 시사한다.
또한 LPS는 control 대비 IL-6의 생성을 102.83 ± 4.90배로 유의성 있게 증가시켰으며, PFE는 100, 300 (㎍/㎖)에서 각각 53.67 ± 1.95, 33.16 ± 0.36배로 LPS로 증가된 IL-6를 유의성 있게 감소시켰다 (Fig. 5B).
또한 LPS는 control군 대비 IL-6의 생성을 102.83 ± 4.90배로 유의성 있게 증가시켰으며, PFE 는 100, 300 (㎍/㎖)에서 각각 53.67 ± 1.95, 33.16 ± 0.36배로 LPS로 증가된 IL-6를 유의성 있게 감소시켰다.
또한 PFE와 LPS의 병용처치에 의한 세포생존율은 control군을 100.00 ± 2.21%로 하였을 때, LPS 단독 처치군은 58.39 ± 3.56%로 유의하게 감소하였다.
본 연구에서 LPS는 control 대비 TNF-α의 분비를 108.65 ± 1.46배 유의성 있게 증가시켰으며, PFE는 100, 300 (㎍/㎖)의 농도에서 TNF-α의 생성량을 각각 85.84 ± 4.10배, 77.72 ± 2.55배로 유의성 있게 감소 시켰다 (Fig. 5A).
본 연구에서 LPS는 control 대비 TNF-α의 분비를 108.65 ± 1.46배 유의성 있게 증가시켰으며, PFE는 100, 300 (㎍/㎖)의 농도에서 TNF-α의 생성량을 각각 85.84 ± 4.10배, 77.72 ± 2.55배로 유의적으로 감소시켰다.
본 연구에서 PFE는 LPS에 의해 발현이 증가된 COX-2 단백질을 현저하게 감소시켰으며, PGE2는 control에서 24.55 ± 12.61 pg/㎖을 나타내었고, LPS는 3188.66 ± 237.74 pg/㎖로 PGE2를 유의성 있게 증가시켰으며, PFE는 100과 300 ㎍/㎖에서 PGE2를 각각 2317.59 ± 151.86, 1590.59 ± 120.37 (pg/㎖)로 유의성 있게 감소시켜 COX-2의 억제와 동일한 결과를 나타내었다.
본 연구에서는 PFE의 30, 100 그리고 300 ㎍/㎖의 농도는 LPS에 의해 증가된 NO의 생성량을 LPS 단독 처치군 대비 78.62, 74.64, 54.35(%)로 유의성 있게 감소시켰다. 또한 PFE 10-1000 ㎍/㎖ 및 PFE (10-300 ㎍/㎖)+LPS의 처치에서 어떠한 세포독성도 나타내지 않았다.
세포질에서 p-IκBα는 LPS처치에 의하여 뚜렷하게 증가하였으며, PFE 300 ㎍/㎖의 전 처치에 의해 IκBα의 인산화가 현저하게 감소되었다.
세포질에서 p-I-κBα 는 LPS처치에 의하여 뚜렷하게 증가하였으며, PFE 300 ㎍/㎖의 전 처치는 p-I-κBα가 현저하게 감소되었다, 또한 I-κBα는 LPS에 의하여 감소되었고, 이러한 감소는 PFE의 전 처치에 의하여 현저하게 증가되었다.
염증반응에서 중요한 역할을 하는 cyclooxygenase-2(COX-2)는 LPS 처치 시에는 COX-2 단백질이 현저 하게 발현 증가되었으나, PFE를 전처리한 실험군에서는 COX-2의 발현이 뚜렷하게 감소하였다 (Fig. 4A). Cyclooxygenase pathway를 통하여 생성되는 PGE₂는 Control군에서 24.
이러한 연구결과는 PFE가 NF-κB의 억제단백질중의 하나인 I-κBα의 인산화를 억제하고, 이로 말미암아 NF-κB의 핵으로의 전위를 억제하며, 그러한 결과로 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6, NO, PGE2의 감소가 유도됨을 의미한다.
이상의 in vitro 및 in vivo에서의 연구결과는 죽엽 열수추출물 (PFE)에는 항염증작용이 있음을 의미하며, 임상적으로 염증성 질환에 죽엽이 광범위하게 활용될 수 있는 것으로 사료된다.

후속연구

이러한 결과로 보아, 淸熱瀉火藥으로 사용되는 죽엽이 그람 음성균의 감염이나 NF-κB가 활성화되어 나타나는 염증성 질환의 치료에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	죽엽이란 무엇인가?	죽엽 (竹葉; Phyllostachys Folium)은 禾本科 (벼 과; Gramineae)에 속한 여러 해 살이 常綠喬木인 솜대 Phyllostachys nigra var. henonis S TAPF 의 잎을 건조한 것으로 1-3) , 性味는 甘淡寒하며, 心肺膽胃에 작용한다. 淸熱除煩, 生津利尿의 효능으로 熱病煩渴, 小兒驚癎, 咳逆吐衄, 面赤, 小便短赤, 口糜舌瘡 등을 치료한다 3) .
	죽엽의 효능으로 치료하는 병증은 무엇이 있는가?	henonis S TAPF 의 잎을 건조한 것으로 1-3) , 性味는 甘淡寒하며, 心肺膽胃에 작용한다. 淸熱除煩, 生津利尿의 효능으로 熱病煩渴, 小兒驚癎, 咳逆吐衄, 面赤, 小便短赤, 口糜舌瘡 등을 치료한다 3) .
	죽엽에는 어떤 성분이 있는가?	죽엽에는 friedelin, glutinol, luteolin 6-C-α -L-arabinopyranoside, tricin, isoorientin 등의 성분이 있는 것으로 알려져 있으며 4) , 생리활성에 대한 연구로는 죽엽추출물이 고지방식이 및 알콜로 유도된 동물모델에서의 고지질혈증 개선효과 2,5) , 죽엽의 항산화 화합물인 methyl chlorogenic acid 유도체 (MCGA)-3의 항산화효과 6) , 죽엽물추출물의 GABA신경계를 통한 항불안효과 7) , 죽엽 물추출물 및 에탄올추출물의 항균효과 8) , 죽엽물추출물의 항암효과 9) , CCl4 로 유도된 간손상 및 알콜의 반복투여로 유도된 간손상에 대한 간보호효과 2,10) 가 보고되었다. 그러나 아직까지 죽엽의 항염증효과에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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