[논문]Meloidogyne incognita에 대한 Streptomyces flavogriseus KRA15-528의 살선충활성

오미라; 한재우; 최정섭; 최용호; 장경수; 최경자; 김헌

doi:10.5423/rpd.2016.22.4.227

[국내논문] Meloidogyne incognita에 대한 Streptomyces flavogriseus KRA15-528의 살선충활성
Nematicidal Activity of Streptomyces flavogriseus KRA15-528 to Meloidogyne incognita 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.22 no.4, 2016년, pp.227 - 235

오미라 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터) , 한재우 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터) , 최정섭 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터) , 최용호 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터) , 장경수 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터) , 최경자 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터) , 김헌 (한국화학연구원 친환경신물질연구센터)

초록
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뿌리혹선충에 의한 병 발생은 작물수확량의 감소를 초래하여 중요한 문제로 인식되고 있다. 화학농약의 사용은 선충방제를 위해 효과적인 방법 중의 하나로 고려되지만 환경 오염이나 인축에 대한 독성과 같은 문제를 야기하고 있다. 본 연구에서는 친환경 살선충제 개발에 사용될 수 있는 미생물을 선발하고자, 토양으로부터 분리한 670여 개의 방선균을 대상으로 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 조사하였다. 이들 중 가장 우수한 살선충 활성을 나타내는 KRA15-528 균주를 선발하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초하여 S. flavogriseus로 동정하였다. S. flavogriseus KRA15-28 균주 배양여액을 최종농도 10%가 되도록 J2 단계의 유충과 선충알에 각각 처리 시, 48시간 후 71%의 선충 치사율과 9일째에 54%의 선충 알 부화 억제율을 확인하였다. 배양여액을 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 용매 분획하여 에틸 아세테이트와 부탄올, 물 추출물에 대한 살선충 활성을 조사한 결과, 에틸 아세테이트 추출물로부터만 높은 살선충 활성을 확인하였다. 1,000, 500, $250{\mu}g/ml$의 농도에서 각각 91%, 53%, 30%의 치사율을 나타내었다. 이외에도, 오이에 대한 뿌리 혹 선충병 방제활성을 조사한 결과, 배양여액 처리구에서 눈에 띄게 뿌리혹형성이 억제되는 현상을 관찰하였다. 따라서, S. flavogriseus KRA15-528은 뿌리혹선충병을 방제에 사용할 수 있는 미생물제제로서의 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Plant disease caused by root-knot nematode is a major problem in crop production. Using of chemical pesticides, one of the most efficient methods to control nematodes, have raised issues in toxicity to humans and animals and environmental pollution. In this study, to select actinomycete strains that have potential to serve as a microbial agent for control of nematodes, we investigated nematicidal activity of culture broth from 670 Streptomyces isolates. A culture filtrate of KRA15-528 isolate that was identified as S. flavogriseus on the basis of 16S rRNA sequence analysis, showed strong nematicidal activity against second stage of juveniles of Meloidogyne incognita and inhibited egg hatching; exposure to 10% of culture filtrate resulted in 71% juvenile mortality at 48 hours afters treatment and suppressed egg hatching by 54% at 9 days after treatment. When the KRA15-528 culture filtrate was partitioned with ethyl acetate and butanol, ethyl acetate layer exclusively showed strong activity; 91%, 53%, 30% of mortality at 1,000, 500, $250{\mu}g/ml$, respectively. Additionally, the culture filtrate suppressed gall formation on cucumber plant by M. incognita with no phytotoxicity. These results suggest that S. flavogriseus KRA15-528 has potential to serve as a microbial nematicide for the control of root-knot nematode disease.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

incognita)에 대한 살선충 활성 조사를 실시하였고, 이 중 가장 우수한 활성을 갖는 Streptomyces flavogriseus KRA15-528 균주를 선발하였다. 선발된 균주에 대한 in vivo와 in vitro 살선충 활성 조사를 통해 친환경 살선충제로서의 개발 가능성을 검토하였다.
화학농약의 사용은 선충방제를위해효과적인방법중의하나로고려되지만환경오염이나 인축에 대한 독성과 같은 문제를 야기하고 있다. 본 연구에서는 친환경 살선충제 개발에 사용될 수 있는 미생물을 선발하고자, 토양으로부터 분리한 670여 개의 방선균을 대상으로 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 조사하였다. 이들 중 가장 우수한 살선충 활성을 나타내는 KRA15-528균주를 선발하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초하여 S.

제안 방법

2015년도에 다양한 지역의 토양으로부터 방선균을 분리하였으며, 분리된 방선균의 살선충활성을조사하고자 다음과같은배지및배양조건을이용하였다. 방선균은 Bennett’s 한천배지(1% glucose, 0.
1% beef extract, 2% agar) (Hesseltine 등, 1954)에 도말하여 고체 배양한 후, 형성된 단일 콜로니를 tryptic soy broth 배지에 접종하고 28℃, 150 rpm 에서 2일 동안 전배양하였다. 전배양한 방선균은 glucosesoybean meal-starch (GSS) 배지(1% soluble starch, 2% glucose, 2.5% soybean meal, 0.1% beef extract, 0.4% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.025% K₂HPO₄, 0.1% CaCO₃) (Kim 등, 1989)에 1% (v/v)가 되도록접종하고 28℃, 150 rpm에서 7일동안 진탕 배양하여 살선충 활성조사에 사용하였다.
원예용 상토 (High; Punong, Gyeongju, Korea)를 직경 5 cm의 플라스틱 컵에 넣고 토마토를 파종하였다. 3주간 재배한 유묘를 플라스틱 포트에 이식한 뒤 뿌리혹선충의 알을 토마토 한 주당 5,000개씩 접종하였으며, 6주 동안 재배하여 혹이 심하게 형성된 토마토뿌리를 채취하였다.
먼저, 유충에 대한 살선충 활성을 조사 하기 위해 선충 현탁액을 96-well tissue culture plate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)의 각 well에 넣은 다음 방선균 배양여액의 농도가 10%, 5%, 2.5%, 1.25%가 되도록 처리하고 well당 최종 부피가 100 µl (약 50마리 J2)가 되도록 하였다.
96-well tissue culture plate의 각 well에뿌리혹선충 2령 유충(약 50마리/99 µl)을 치상한 후 각각의 시료를 처리하여 최종농도가 250, 500, 1,000 µg/ml가되도록 하였다.
16S rRNA 부분의 증폭을 위하여 universal primer set (27F, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; 1492R, 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)를 이용하였으며, 중합 효소 연쇄반응은 Ex Taq polymerase (Takara, Ohtsu, Japan)를 사용하여 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초에서 34회, 72℃에서 7분간 1회반응시켰다.
주사 전자현미경을 통하여 균주의 포자형태와 크기를 관찰 하기 위해 멸균된 금속을 Bennett’s 한전배지에 비스듬히 끼워 넣은 뒤 금속과 배지가 맞닿는 선을 따라 KRA15-528 균주를 도말하였다.
선발된 KRA15-528 균주의형태학적특성은 Bennett’s 한천배지에 접종하여 28℃ 배양기에서 10일 동안 배양한뒤 관찰하였다.
선충 알을 각 well에 약 50개씩 넣은 다음 방선균 배양여액의 농도가 10%, 5%, 2.5%로 되도록 처리하고 well당 최종 부피가 100 µl가 되도록 하였다.
GSS 배지에서 7일 동안 배양한 방선균 배양액을 4℃, 6,500 g 조건에서 10분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액을 사용하여 유충에 대한 살선충 활성과 알 부화 억제 활성 조사를 하였다. 먼저, 유충에 대한 살선충 활성을 조사 하기 위해 선충 현탁액을 96-well tissue culture plate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)의 각 well에 넣은 다음 방선균 배양여액의 농도가 10%, 5%, 2.
시료가 균일하게 섞이도록 30초 동안 교반하였으며, 선충의 산소결핍과 건조를 방지하기 위하여 상대습도 100%의 플라스틱 통에 넣은 후 25℃에서 배양하였다. 실험은 3반복을 수행하였으며, 시료처리 48시간, 72시간, 96시간 후 광학 현미경(CKX41; Olympus, Tokyo, Japan)하에서 관찰하여 직선으로 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 판단하여 살선충률을 조사 하였다(Abbott, 1925). 알 부화 억제 활성을 조사하기 위해 유충에 대한 살선충 활성을 조사하기 위한 방법과 동일한 방법을 사용하였다.
5%로 되도록 처리하고 well당 최종 부피가 100 µl가 되도록 하였다. 배양조건은 유충에 대한 살선충 활성 실험에 사용했던 조건과 같으며, 선충알부화율은시료처리후 3일, 7일, 9일째조사하였다.
주사 전자현미경을 통하여 균주의 포자형태와 크기를 관찰 하기 위해 멸균된 금속을 Bennett’s 한전배지에 비스듬히 끼워 넣은 뒤 금속과 배지가 맞닿는 선을 따라 KRA15-528 균주를 도말하였다. 28℃에서 10일간 배양하여 금속을 타고 올라온 균체를 주사 전자현미경(MIRA3; TESCAN, Seoul, Korea)을 통해 관찰하였다(Williams와 Davies, 1967).
분리 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하였다. KRA15-528을 Bennett’s 액체배지 5 ml에 접종하여 28℃, 150 rpm 조건으로 3일간 배양하였다.
KRA15-528을 Bennett’s 액체배지 5 ml에 접종하여 28℃, 150 rpm 조건으로 3일간 배양하였다. 배양액을 4℃, 6,500g 조건으로 10분간 원심분리하여 얻은 균체로부터 cetyltrimethylammonium bromide를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다(Tripathi 와 Rawal, 1998). 16S rRNA 부분의 증폭을 위하여 universal primer set (27F, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; 1492R, 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)를 이용하였으며, 중합 효소 연쇄반응은 Ex Taq polymerase (Takara, Ohtsu, Japan)를 사용하여 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초에서 34회, 72℃에서 7분간 1회반응시켰다.
방선균배양여 액의 용매 분획에 따른 살선충 활성을 조사하기 위해 배양여액과 동량의 에틸 아세테이트와 부탄올을 이용하여 순차적으로 각각 2회씩 용매 분획하여 감압 농축하였다. 에틸 아세테이트, 부탄올, 물로부터 추출물 0.
방선균배양여 액의 용매 분획에 따른 살선충 활성을 조사하기 위해 배양여액과 동량의 에틸 아세테이트와 부탄올을 이용하여 순차적으로 각각 2회씩 용매 분획하여 감압 농축하였다. 에틸 아세테이트, 부탄올, 물로부터 추출물 0.01, 0.45, 0.59 g씩을 확보하였으며, 각 추출물을 100 mg/ml 농도가 되도록 메탄올 (에틸 아세테이트와 부탄올 추출물) 또는 50% 메탄올(물 추출물)에 용해하였다. 96-well tissue culture plate의 각 well에뿌리혹선충 2령 유충(약 50마리/99 µl)을 치상한 후 각각의 시료를 처리하여 최종농도가 250, 500, 1,000 µg/ml가되도록 하였다.
무처리 대조구로는 1% 메탄올을 사용하였으며, 실험은 3회 반복 수행되었다. 시료 처리 후 48시간 뒤, 살선충 률을조사하였다.
온실(25℃±5℃)에서 5일 동안 키운 ‘백미다다기’ 품종의 오이를 멸균한 모래 100 g이담긴직경 7 cm의 플라스틱 포트에 이식하였다.
뿌리혹 지수는 오이뿌리에 형성된 혹의 정도에 따라 0–4의 지수를 사용하여 5단계로조사하였다(0, 0%; 1, 1%–25%; 2, 26%–50%; 3, 51%–75%; 4, 76%–100%) (Taylor와 Sasser, 1978).
온실(25℃±5℃)에서 5일 동안 키운 ‘백미다다기’ 품종의 오이를 멸균한 모래 100 g이담긴직경 7 cm의 플라스틱 포트에 이식하였다. 토마토에서 증식된 뿌리혹선충 알을 수거하여 각 포트당 5,000알을 접종하였다. 접종 후 한 시간 뒤, KRA15-528 균주의 배양여액을 오이 뿌리 주변에 10 ml씩 관주처리 하였으며, 일주일 후 같은 방식으로 배양여액을 한번 더 토양관주 처리하였다.
토마토에서 증식된 뿌리혹선충 알을 수거하여 각 포트당 5,000알을 접종하였다. 접종 후 한 시간 뒤, KRA15-528 균주의 배양여액을 오이 뿌리 주변에 10 ml씩 관주처리 하였으며, 일주일 후 같은 방식으로 배양여액을 한번 더 토양관주 처리하였다. 대조구로는 선충탄(a.
접종 후 한 시간 뒤, KRA15-528 균주의 배양여액을 오이 뿌리 주변에 10 ml씩 관주처리 하였으며, 일주일 후 같은 방식으로 배양여액을 한번 더 토양관주 처리하였다. 대조구로는 선충탄(a.i. 5% fosthiazate) 2,000배 희석액을 1회 처리하였으며, 무처리구로는 멸균수를 이용하였다. 실험은 각 처리구당 5개의 식물체를 사용하여 2반복을 수행하였고, 선충 알 접종 2주 후에 뿌리혹 지수를 조사하였다.
5% fosthiazate) 2,000배 희석액을 1회 처리하였으며, 무처리구로는 멸균수를 이용하였다. 실험은 각 처리구당 5개의 식물체를 사용하여 2반복을 수행하였고, 선충 알 접종 2주 후에 뿌리혹 지수를 조사하였다. 뿌리혹 지수는 오이뿌리에 형성된 혹의 정도에 따라 0–4의 지수를 사용하여 5단계로조사하였다(0, 0%; 1, 1%–25%; 2, 26%–50%; 3, 51%–75%; 4, 76%–100%) (Taylor와 Sasser, 1978).
살선충 활성을 가지는 균주의 선발을 위하여 670여 개의 방선균 배양여액을 이용하여 96-well tissue culture plate 에서 스크리닝을 수행하였다. 약 670개의 방선균 중 KRA15-528이 가장 높은 살선충 활성을 가지는 균주로 선발되었다.
KRA15-528 균주의 형태학적 특성 및 계통수 분석.
KRA15-528 균주배양여액으로부터살선충활성물질의특성을파악하고자용매분획된에틸 아세테이트, 부탄올, 물층을 각각 선충 현탁액에 처리해 보았다. 처리 후 48시간에서 관찰한 결과, 에틸 아세테이트 추출물 처리구에서 높은 살선충 활성이 나타났다(Fig.
KRA15-528 균주가 뿌리혹 선충에 대해 식물병방제 활성을 가지는지 알아보기 위하여 오이에 선충을 처리한 후 KRA15-528 균주의 배양여액을 처리하였다. 배양여액의 원액, 1/3배, 1/10배 희석액 처리구에서 각각 2.
flavogriseus로 동정하였다. S. flavogriseus KRA15-28 균주배양여액을 최종농도 10%가 되도록 J2 단계의 유충과 선충 알에 각각 처리 시, 48시간 후 71%의 선충 치사율과 9일째에 54%의선충알부화억제율을확인하였다. 배양여액을에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 용매 분획하여 에틸 아세테이트와 부탄올, 물 추출물에 대한 살선충 활성을 조사한결과, 에틸 아세테이트 추출물로부터만 높은 살선충 활성을 확인하였다.
1,000, 500, 250 μg/ml의 농도에서 각각 91%, 53%, 30%의치사율을나타내었다. 이외에도, 오이에대한뿌리혹선충병방제활성을조사한결과, 배양여액처리구에서 눈에띄게뿌리혹형성이억제되는현상을관찰하였다. 따라서, S.
뿌리에 생긴 혹과 난낭으로부터 뿌리 혹선충유충 (J2)을 분리하기 위해, 혹이 형성된 토마토 뿌리를 물로 세척한 후 1 cm 크기로 절단하였다. 토마토 뿌리가 0.
오이를 기주로 이용하여 KRA15-528 균주 배양여액의 뿌리혹 선충병방제 활성을 조사하였다. 온실(25℃±5℃)에서 5일 동안 키운 ‘백미다다기’ 품종의 오이를 멸균한 모래 100 g이담긴직경 7 cm의 플라스틱 포트에 이식하였다.

대상 데이터

따라서, 본 연구에서는 토양에서 분리한 670여 개의 방선균을 대상으로 뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 살선충 활성 조사를 실시하였고, 이 중 가장 우수한 활성을 갖는 Streptomyces flavogriseus KRA15-528 균주를 선발하였다. 선발된 균주에 대한 in vivo와 in vitro 살선충 활성 조사를 통해 친환경 살선충제로서의 개발 가능성을 검토하였다.
Hwang 등(2014)에 의해 분리, 동정된 뿌리혹선충은 온실(25℃±5℃)에서 ‘서광’ 품종의 토마토에 증식시켜 실험에 사용하였다. 원예용 상토 (High; Punong, Gyeongju, Korea)를 직경 5 cm의 플라스틱 컵에 넣고 토마토를 파종하였다. 3주간 재배한 유묘를 플라스틱 포트에 이식한 뒤 뿌리혹선충의 알을 토마토 한 주당 5,000개씩 접종하였으며, 6주 동안 재배하여 혹이 심하게 형성된 토마토뿌리를 채취하였다.
96-well tissue culture plate의 각 well에뿌리혹선충 2령 유충(약 50마리/99 µl)을 치상한 후 각각의 시료를 처리하여 최종농도가 250, 500, 1,000 µg/ml가되도록 하였다. 무처리 대조구로는 1% 메탄올을 사용하였으며, 실험은 3회 반복 수행되었다. 시료 처리 후 48시간 뒤, 살선충 률을조사하였다.
Hwang 등(2014)에 의해 분리, 동정된 뿌리혹선충은 온실(25℃±5℃)에서 ‘서광’ 품종의 토마토에 증식시켜 실험에 사용하였다.

데이터처리

확인된밴드는 GeneAll Expin^TM PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea)의 방법에 따라 정제한 후 염기 서열 분석을 위해시 퀀싱분석서비스(Macrogen, Daejoen, Korea)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 BLASTn (http://www. ncbi.nlm.nih.gov) 프로그램을 통해 비교 분석되었다. 분자 계 통학적 계통수의 작성은 MEGA 프로그램 패키지를 사용하여수행하였으며(Tamura 등, 2013), 분석을 위한 염기 서열정렬은 CLUSTAL W (Larkin 등, 2007)를이용하였다.
gov) 프로그램을 통해 비교 분석되었다. 분자 계 통학적 계통수의 작성은 MEGA 프로그램 패키지를 사용하여수행하였으며(Tamura 등, 2013), 분석을 위한 염기 서열정렬은 CLUSTAL W (Larkin 등, 2007)를이용하였다. 분자계통 도는거리 행렬법 중의 하나인 neighbor-joining 방법(Saitou와 Nei, 1987)을 사용하여 구성하였고, bootstrap 분석은 1,000회수행하였다.
SAS 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 을 이용하여 일원 배치(one-way) ANOVA 분석을 하였으며, 처리 평균간 비교를 위하여 Duncan’s multiple range test (P=0.05)를 실시하여 유의성을 검정하였다.

이론/모형

분쇄한 시료는 230 mesh 체를 이용하여 찌꺼기를 거르고 550 mesh 체를 이용하여 알을 수집하였다(Barker 등, 1985). 체에 모인 선충 알은 멸균수로 3번 세척한 뒤 부화 억제 활성 조사에 이용되거나, Baermann funnel 방법을 이용하여 선충 알로부터 유충을 분리하였다 (Southey, 1986).
16S rRNA 부분의 증폭을 위하여 universal primer set (27F, 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′; 1492R, 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)를 이용하였으며, 중합 효소 연쇄반응은 Ex Taq polymerase (Takara, Ohtsu, Japan)를 사용하여 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초에서 34회, 72℃에서 7분간 1회반응시켰다. 확인된밴드는 GeneAll Expin^TM PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea)의 방법에 따라 정제한 후 염기 서열 분석을 위해시 퀀싱분석서비스(Macrogen, Daejoen, Korea)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 BLASTn (http://www.
분자 계 통학적 계통수의 작성은 MEGA 프로그램 패키지를 사용하여수행하였으며(Tamura 등, 2013), 분석을 위한 염기 서열정렬은 CLUSTAL W (Larkin 등, 2007)를이용하였다. 분자계통 도는거리 행렬법 중의 하나인 neighbor-joining 방법(Saitou와 Nei, 1987)을 사용하여 구성하였고, bootstrap 분석은 1,000회수행하였다.
(B) Phylogenetic analysis was performed based on 16S rRNA gene sequence of KRA15-528 and 21 species of the genus Streptomyces. Neighbor-joining method was used for this analysis, and numbers at nodes indicate levels of bootstrap support (%) by 1,000 resampled datasets. National Center for Biotechnology Information accession numbers of each sequence are in parentheses.

성능/효과

살선충 활성을 가지는 균주의 선발을 위하여 670여 개의 방선균 배양여액을 이용하여 96-well tissue culture plate 에서 스크리닝을 수행하였다. 약 670개의 방선균 중 KRA15-528이 가장 높은 살선충 활성을 가지는 균주로 선발되었다. KRA15-528 균주를 선충 현탁액에 처리 후, 48시간째에 관찰 하였을 때 10% 처리구에서는 71%, 5%에서는 65%, 2.
약 670개의 방선균 중 KRA15-528이 가장 높은 살선충 활성을 가지는 균주로 선발되었다. KRA15-528 균주를 선충 현탁액에 처리 후, 48시간째에 관찰 하였을 때 10% 처리구에서는 71%, 5%에서는 65%, 2.5%에서는 61%의 높은 살선충률을 비롯하여 농도 의존적인 결과를 보여주었다. 또한 1.
1A). 배양여액 처리 후, 72시간 및 96시간째에서도 48시간째 관찰한 살선충률과 비슷한 살선충률을 나타내어 지속적인 살선충 활성을 보임을 알 수 있었다(data not shown). Jang 등(2015)은 S.
sampsonii KK1024 배양액을 10% 농도로 처리했을 때 21%의살선충률을 보고하고 있다. 하지만 본 연구에서는 KRA15-528 균주의 배양여액 10% 처리 시 71%의 높은 살선충 활성을 확인하였다(Fig. 1A). 배양조건 등 실험적 환경의 차이를 감안한다고 하더라도 앞선 연구 결과와 비교하여 본 실험에 사용된 Streptomyces sp.
배양조건 등 실험적 환경의 차이를 감안한다고 하더라도 앞선 연구 결과와 비교하여 본 실험에 사용된 Streptomyces sp. KRA15-528 균주가 in vitro에서 우수한 살선충률을 보여주고 있음을 알 수 있었다.
1B). 특히, 시료처리 후 9일째 관찰하였을 때, 무처리구의 알 부화율은 48%인 데 반해, 10%와 5% 처리구에서의 알 부화율은 22%와 28%였다. 즉, 배양여액 10%와 5% 처리구는 무처리구와 비교하여 약 54%와 41%의 선충 알 부화 억제율을 보여주었다(Fig.
KRA15-528 균주는 Bennett’s 한천배지에 도말하였을때 사상형의 균사는 회색 및 노란색을 띠며, 주사전자현미경으로 관찰 시 균사의 끝부분에 분절된 형태의 원통 모양 포자가 관찰되었다(Fig. 2A).
1B). 이와 같은 선충 알 부화 억제효과는 KRA15-528 균주가 친환경 방제제로서 개발 가능한 소재임을 나타내주는 결과로 생각되었다.
2A). 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 분자 계통학적 분석 결과, S. flavogriseus ATCC 33331과 99.86%, S. tanashiensis NBRC 12919와 98.49%, S. nojiriensis CSSP678과는 96.83%의 염기서열유사도를보였다(Fig. 2B). 이에상기에서분리된균주를S.
KRA15-528 균주배양여액으로부터살선충활성물질의특성을파악하고자용매분획된에틸 아세테이트, 부탄올, 물층을 각각 선충 현탁액에 처리해 보았다. 처리 후 48시간에서 관찰한 결과, 에틸 아세테이트 추출물 처리구에서 높은 살선충 활성이 나타났다(Fig. 3). 부탄올추출물과물층은 1,000 µg/ml 농도로처리시살선충 률이 각각 4%와 8%로 매우 낮았다(Fig.
에틸 아세테이트 추출물의 경우 250, 500, 1,000 µg/ml 처리구에서 각각 30%, 53%, 91%의 농도 의존적인 살선충률을 보여주었다(Fig. 3).
3). 또한, 72시간 및 96시간 후에도 지속적인 살선충 효과를 보여주었다(data not shown). 이들 결과를 바탕으로, 에틸 아세 테이트 추출물에는 KRA15-528 균주가 생성하는 살선충 활성 물질이 포함되어 있으리라 생각되며, 향후 살선충 활성 물질의 동정에 대한 연구가 필요하다.
4A) (Taylor와 Sasser, 1978). 또한, 오이 이외에도 토마토를 대상으로 한 실험결과에서도 KRA15-528 균주 배양여액에 의한 방제활성이 확인되었으며, 모든 in vivo 실험상의 처리구에서 약해는 발견되지 않았다(data not shown).
본 연구에서는 670여 개의 방선균 가운데 가장 살선충 활성이 우수한 S. flavogriseus KRA15-528 균주를 선발하였고, 본 균주의 살선충 활성물질은 에틸아세테이트로 추출이 가능한 세포외 물질로 확인되었다. 또한 오이를 이용한 온실 시험에서도 뿌리혹선충에 대하여 방제 활성을 보였다.
본 연구에서는 친환경 살선충제 개발에 사용될 수 있는 미생물을 선발하고자, 토양으로부터 분리한 670여 개의 방선균을 대상으로 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 조사하였다. 이들 중 가장 우수한 살선충 활성을 나타내는 KRA15-528균주를 선발하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초하여 S. flavogriseus로 동정하였다. S.
flavogriseus KRA15-28 균주배양여액을 최종농도 10%가 되도록 J2 단계의 유충과 선충 알에 각각 처리 시, 48시간 후 71%의 선충 치사율과 9일째에 54%의선충알부화억제율을확인하였다. 배양여액을에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 용매 분획하여 에틸 아세테이트와 부탄올, 물 추출물에 대한 살선충 활성을 조사한결과, 에틸 아세테이트 추출물로부터만 높은 살선충 활성을 확인하였다. 1,000, 500, 250 μg/ml의 농도에서 각각 91%, 53%, 30%의치사율을나타내었다.
이외에도, 오이에대한뿌리혹선충병방제활성을조사한결과, 배양여액처리구에서 눈에띄게뿌리혹형성이억제되는현상을관찰하였다. 따라서, S. flavogriseus KRA15-528은 뿌리 혹선 충병을 방제에 사용할 수 있는 미생물제제로서의 가능성이 있음을 확인할 수있었다.
특히, 시료처리 후 9일째 관찰하였을 때, 무처리구의 알 부화율은 48%인 데 반해, 10%와 5% 처리구에서의 알 부화율은 22%와 28%였다. 즉, 배양여액 10%와 5% 처리구는 무처리구와 비교하여 약 54%와 41%의 선충 알 부화 억제율을 보여주었다(Fig. 1B). 이와 같은 선충 알 부화 억제효과는 KRA15-528 균주가 친환경 방제제로서 개발 가능한 소재임을 나타내주는 결과로 생각되었다.

후속연구

또한, 72시간 및 96시간 후에도 지속적인 살선충 효과를 보여주었다(data not shown). 이들 결과를 바탕으로, 에틸 아세 테이트 추출물에는 KRA15-528 균주가 생성하는 살선충 활성 물질이 포함되어 있으리라 생각되며, 향후 살선충 활성 물질의 동정에 대한 연구가 필요하다.
flavogriseus ACTK2 균주의부탄올 추출물은 Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Enterococcus aerogenes, Fusarium proliferatum 등에 대하여 항균활성을 가진다는 연구결과가 보고되어 있다(Dezfully와 Ramanayaka, 2015; Ghorbel 등, 2014; Zhao 등, 2003). 본 연구에서 선발된 S. flavogriseus KRA15-528 균주는 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등에 방제활성이 없는 것으로 관찰되었지만(data not shown), 항균활성에 대한 방선균의 넓은 스펙트럼을 고려한다면 다양한 식물병원균을 이용한 방제활성의 조사가 필요하리라 생각 된다.
현재까지 보고된 방선균에 의해 생산되는 살선충 물질들, 예를 들면, avermectins, bafilomycin, lecanicidins 등은 세포내 물질로 알려져 있다(Burg 등, 1979; Lacey 등, 1995; Nonaka 등, 2000). 본 연구에서 S. flavogriseus KRA15-528 균주의 배양여액으로부터확인된살선충활성은활성물질이세포외물질일것으로 추정되며, 동시에 상기 균주로부터 살선충 활성을 갖는 세포내 물질을 동정한다면 고활성을 보이는 미생물 살선충 재개발이 가능해지리라 생각된다.
또한 오이를 이용한 온실 시험에서도 뿌리혹선충에 대하여 방제 활성을 보였다. 향후, 본 균주를 이용하여 미생물 살선충제를 개발하기 위해서는 살선충 활성 물질 분리 및 구조동정, 최적발효공정, 최적의 살선충 활성을 위한 제제 개발 등의 추가적인 연구가 필요 하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	뿌리혹선충은 무엇인가?	뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 식물 뿌리에 절대기생하며 토마토, 고구마, 참외, 오이 등 주요 농작물에 심각한 피해를 야기하는 토양 병원균 중의 하나이다. 전 세계적으로 작물 피해의 약 11%가 선충에 의한 것으로 알려져 있으며 (McCart, 2009), 국내의 경우에도 경북 성주, 충남 공주 등의 포장에서 뿌리혹선충에 의한 병 발생 피해사례가 보고되고 있다(Park 등, 2011, 2012).
	다양한 뿌리혹선충 중 경제적으로 중요한 종은 무엇인가?	전 세계적으로 작물 피해의 약 11%가 선충에 의한 것으로 알려져 있으며 (McCart, 2009), 국내의 경우에도 경북 성주, 충남 공주 등의 포장에서 뿌리혹선충에 의한 병 발생 피해사례가 보고되고 있다(Park 등, 2011, 2012). 현재까지 동정된 약 90여 종 이상의 다양한 뿌리혹선충 중에서도 M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. hapla 등은 넓은 기주 범위를 가지며 작물 수확량을 감소시키기 때문에 경제적으로 중요한 뿌리혹선충으로 간주하고 있다(Kim 등, 2011, 2014; Trudgill과 Blok, 2001). 뿌리혹선충에 의해 감염된 식물체의 뿌리에는 거대한 혹이 형성되며, 이로 인해 식물체는 물과 영양분의 흡수나 미네랄의 이동 등에 방해를 받게 되어 정상적인 생장이 어려워진다(Williamson과 Hussey, 1996).
	뿌리혹선충병의화학적방제수단이 가진 문제점은?	뿌리혹선충병의화학적방제수단으로는 메틸 브로마이드(methyl bromide) 등의 훈증제와 포스티아제이트(fosthiazate) 등의살선충제가주로이용되어왔다. 하지만 이러한 화학적 방제는인축에 대한 위험성과 잔류 독성, 환경오염, 생태계 교란 등과 같은 다양한 문제점을 노출하고있으며, 이로 인해 보다 안전한 살선충제의 개발이 요구되고 있다. 환경 친화적으로 식물기생선충을 방제하기 위하여 식물 추출물이나 미생물, 또는 미생물의 이차 대사산물을 이용한 방법들이고려되고 있으며, 동시에 많은 연구들이 진행되어 오고 있다(Akhtar와 Malik, 2000; Kerry, 2000; Oka 등, 2000; Rodriguez-Kabana 등, 1987; Sharon 등, 2001).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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