은행나무는 이식성이 좋고 열악한 환경에서도 잘 자라기 때문에 도심 가로수나 조경수로 매우 적합한 수종이다. 은행나무는 암수딴그루 식물로 수나무와 암나무의 생식기관(수꽃과 암꽃)의 비교를 통하여 성을 식별할 수 있으나, 꽃이 달리기까지 약 20년 이상이 필요하다. 가로수용 은행나무는 주로 꽃이 생성되기 이전에 식재되기 때문에 암나무와 수나무 구분 없이 가로수로 식재되어왔다. 가로수로 식재된 암나무에서 열리는 은행나무 열매는 악취를 발산하고 거리 오염을 야기하고 있다. 따라서 본 연구에서는 유시에 수나무를 선별하기 위하여 기존에 보고된 수나무 특이 RAPD 변이체의 염기서열을 기반으로 수나무에서만 675 bp의 PCR 산물을 증폭하는 SCAR 마커(SCAR-GBM)를 개발하였다. SCAR-GBM 마커의 우성 마커 특성에 기인한 위음성(false-negative)문제를 해결하고 식별 효율을 향상시키기 위하여 SCAR-GBM 마커와 mtDNA의 atp1 영역을 증폭하는 범용 프라이머를 동시에 적용하는 multiplex PCR을 이용하였다. 그 결과 암나무와 수나무에서 공히 atp1 영역에 해당하는 1,039 bp의 PCR 산물이 증폭되었으며, 수나무에서만 특이적으로 SCAR-GBM 마커가 증폭되었다. 전국 8개 지역에서 채취된 암나무와 수나무 각 80개체에 대한 분석을 통하여 SCAR-GBM 마커와 multiplex PCR 방법의 재현성이 확인되었다.
은행나무는 이식성이 좋고 열악한 환경에서도 잘 자라기 때문에 도심 가로수나 조경수로 매우 적합한 수종이다. 은행나무는 암수딴그루 식물로 수나무와 암나무의 생식기관(수꽃과 암꽃)의 비교를 통하여 성을 식별할 수 있으나, 꽃이 달리기까지 약 20년 이상이 필요하다. 가로수용 은행나무는 주로 꽃이 생성되기 이전에 식재되기 때문에 암나무와 수나무 구분 없이 가로수로 식재되어왔다. 가로수로 식재된 암나무에서 열리는 은행나무 열매는 악취를 발산하고 거리 오염을 야기하고 있다. 따라서 본 연구에서는 유시에 수나무를 선별하기 위하여 기존에 보고된 수나무 특이 RAPD 변이체의 염기서열을 기반으로 수나무에서만 675 bp의 PCR 산물을 증폭하는 SCAR 마커(SCAR-GBM)를 개발하였다. SCAR-GBM 마커의 우성 마커 특성에 기인한 위음성(false-negative)문제를 해결하고 식별 효율을 향상시키기 위하여 SCAR-GBM 마커와 mtDNA의 atp1 영역을 증폭하는 범용 프라이머를 동시에 적용하는 multiplex PCR을 이용하였다. 그 결과 암나무와 수나무에서 공히 atp1 영역에 해당하는 1,039 bp의 PCR 산물이 증폭되었으며, 수나무에서만 특이적으로 SCAR-GBM 마커가 증폭되었다. 전국 8개 지역에서 채취된 암나무와 수나무 각 80개체에 대한 분석을 통하여 SCAR-GBM 마커와 multiplex PCR 방법의 재현성이 확인되었다.
Ginkgo (Ginkgo biloba L.) is one of the most appropriate roadside trees because of a good transplantation nature and ability to grow well in urban environment. Ginkgo is a dioecious species. Sex discrimination of ginkgo is possible through comparing morphological characters of reproductive organs. H...
Ginkgo (Ginkgo biloba L.) is one of the most appropriate roadside trees because of a good transplantation nature and ability to grow well in urban environment. Ginkgo is a dioecious species. Sex discrimination of ginkgo is possible through comparing morphological characters of reproductive organs. However, it needs more than about twenty years for reproductive organs to appear after sexual maturity. Until now, ginkgo trees for roadside plantation have been planted without discriminating the sex because ginkgo trees have been usually planted before sexual maturity. Ginkgo nuts from the female ginkgo trees planted along the roadside emit a foul odor, and make much pollution on the streets. Thus in this study a novel SCAR marker (SCAR-GBM) for the early sex discrimination was developed. Primers were developed on the basis of the sequence of male-specific RAPD variants reported previously. False-negative problem of SCAR marker, probably caused by dominant nature, was resolved by using multiplex PCR using primers of both the SCAR-GBM and a universal primer set of atp1 region in mitochondria DNA, which resulted in improved discrimination efficiency. The results showed that DNA bands of 1,039 bp were commonly amplified by the atp1 primer set in male and female trees, and SCAR-GBM markers of 675 bp were specifically amplified only in male trees. Reproducible and specific discrimination of the multiplex PCR was finally confirmed by applying multiple male and female individuals.
Ginkgo (Ginkgo biloba L.) is one of the most appropriate roadside trees because of a good transplantation nature and ability to grow well in urban environment. Ginkgo is a dioecious species. Sex discrimination of ginkgo is possible through comparing morphological characters of reproductive organs. However, it needs more than about twenty years for reproductive organs to appear after sexual maturity. Until now, ginkgo trees for roadside plantation have been planted without discriminating the sex because ginkgo trees have been usually planted before sexual maturity. Ginkgo nuts from the female ginkgo trees planted along the roadside emit a foul odor, and make much pollution on the streets. Thus in this study a novel SCAR marker (SCAR-GBM) for the early sex discrimination was developed. Primers were developed on the basis of the sequence of male-specific RAPD variants reported previously. False-negative problem of SCAR marker, probably caused by dominant nature, was resolved by using multiplex PCR using primers of both the SCAR-GBM and a universal primer set of atp1 region in mitochondria DNA, which resulted in improved discrimination efficiency. The results showed that DNA bands of 1,039 bp were commonly amplified by the atp1 primer set in male and female trees, and SCAR-GBM markers of 675 bp were specifically amplified only in male trees. Reproducible and specific discrimination of the multiplex PCR was finally confirmed by applying multiple male and female individuals.
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제안 방법
Gradient PCR 반응은 PCR 반응기(C1000 TouchTM Thermal Cycler, BIO-RAD, USA)를 이용하여 94 ℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 94 ℃에서 1분간 변성, 40~70 ℃ 범위에서(Table 1) 1분간 어닐링 및 72 ℃에서 1분간 합성(extension)을 총 35회 반복 수행하였고, 마지막으로 72 ℃에서 10분간 합성을 마무리하였다.
제2 프라이머는 식물체의 세포질 DNA를 증폭하는 프라이머를 이용하였다(Table 1). PCR 반응액의 조성과 반응조건은 상기된 SCAR 프라이머를 이용한 PCR 반응과 동일하였고, 세포질 DNA 증폭용 프라이머를 SCAR 프라이머와 동일한 농도로 첨가하였으며, 어닐링 온도는 gradient PCR에서 탐색된 수나무와 암나무의 식별이 가능한 온도조건을 적용하였다. Taq DNA 중합효소 등의 PCR 반응 시약과, PCR 기기의 종류에 따른 PCR 분석의 재현성을 확인하기 위하여, 다른 제조사의 중합효소(RBC Taq DNA polymerase, RBCBioscience, Taiwan)와 PCR 반응기(LifeTouch Thermal Cycler, BIOER Technology, China) 를 이용하여 multiplex PCR 분석을 실시하였다.
Gradient PCR 반응은 PCR 반응기(C1000 TouchTM Thermal Cycler, BIO-RAD, USA)를 이용하여 94 ℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시킨 후, 94 ℃에서 1분간 변성, 40~70 ℃ 범위에서(Table 1) 1분간 어닐링 및 72 ℃에서 1분간 합성(extension)을 총 35회 반복 수행하였고, 마지막으로 72 ℃에서 10분간 합성을 마무리하였다. PCR 산물은 2% 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동 하였으며, EtBr을 이용하여 염색한 후 UV를 조사하여 확인하였다.
SCAR 프라이머는 수나무와 암나무를 식별할 수 있는 RAPD 변이체의 염기서열 정보(GenBank Accession No. FI136224, Echenard et al., 2008)를 기반으로 Primer3(Untergasser et al., 2012) 프로그램을 이용하여 설계하였다.
PCR 반응액의 조성과 반응조건은 상기된 SCAR 프라이머를 이용한 PCR 반응과 동일하였고, 세포질 DNA 증폭용 프라이머를 SCAR 프라이머와 동일한 농도로 첨가하였으며, 어닐링 온도는 gradient PCR에서 탐색된 수나무와 암나무의 식별이 가능한 온도조건을 적용하였다. Taq DNA 중합효소 등의 PCR 반응 시약과, PCR 기기의 종류에 따른 PCR 분석의 재현성을 확인하기 위하여, 다른 제조사의 중합효소(RBC Taq DNA polymerase, RBCBioscience, Taiwan)와 PCR 반응기(LifeTouch Thermal Cycler, BIOER Technology, China) 를 이용하여 multiplex PCR 분석을 실시하였다.
은행나무 수나무와 암나무 식별을 위한 SCAR 마커를 분석하기 위하여 인천, 상주(경북), 청주(충북), 춘천(강원), 나주(전남), 세종(충남), 오산(경기), 진주(경남)의 8개 지역에 식재된 은행나무를 대상으로 개화기에 수꽃과 암꽃의 형태를 확인한 수나무와 암나무 각 10개체(총 160개체)를 이용하였다(Figure 1). 각 개체로부터 채취된 잎으로부터 DNA 추출 Kit(ExgeneTM Plant SV mini, GeneAll, Korea)를 이용하여 제조사의 사용법에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 분광측정기(Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA)을 이용하여 농도를 측정하였으며, 5 ng/µL로 희석시켜서 분석에 이용하였다.
, 1997). 따라서 본 연구의 multiplex PCR은 SCARGBM 프라이머 만을 이용한 독립적인 PCR 조건을 동일하게 적용하면서 미토콘드리아 DNA 증폭용 프라이머를 동일한 농도로 추가하여 수행하였다. 그 결과, SCARGBM/atp1 조합에서 예상된 증폭 결과가 안정적으로 확인되었으며(Figure 3B and Figure 4), gradient PCR에서도 50~64.
본 연구는 화기 형태 등 외부 형태를 기준으로 은행나무의 성을 식별하는 방법이 장시간 소요되는 문제를 해결하고, 수나무와 암나무의 활용 목적에 따른 적절한 식재를 위하여, 은행나무 성식별 DNA 마커(SCAR 마커)를 개발하였으며, 식별 효율을 향상시키기 위하여 multiplex PCR 분석법을 적용하였다.
프라이머의 길이는 18~22 nucleotieds, 최적 Tm 값은 57~63℃의 범위에서 60 ℃로 조정하였다. 새롭게 설계된 SCAR 프라이머를 이용하여 수나무와 암나무를 식별할 수 있는 RAPD 변이체와 동일한 식별 양상을 나타내는 PCR 온도 조건을 탐색하기 위하여 gradient PCR을 실시하였다. PCR 반응액은 전체 12 µL 당 10 ng주형 DNA, 1X PCR reaction buffer, 0.
, 2012) 프로그램을 이용하여 설계하였다. 염기서열 내 프라이머의 설계 위치는 RAPD 프라이머 영역(10 nucleotieds)의 일부를 포함하기 위하여 프라이머의 시작 위치를 염기서열 양 말단의 10 nucleotieds 이내로 설정하였다. 프라이머의 길이는 18~22 nucleotieds, 최적 Tm 값은 57~63℃의 범위에서 60 ℃로 조정하였다.
은행나무 암수식별을 위한 SCAR 마커 적용 시 우성 마커 특성에 따른 위음성 문제를 해결하기 위하여 수나무 특이적인 SCAR 프라이머와 함께 암·수 여부와 상관없이모든 은행나무 개체에서 DNA가 증폭되는 제2의 프라이 머를 동시에 적용하는 mutiplex PCR을 수행하였다.
, 2012). 이러한 문제를 해결하기 위하여 수나무 또는 암나무 여부와 관계없이 분석된 모든 개체에서 PCR 증폭이 가능한 프라이머 세트를 추가하여 SCAR-GBM 마커와 함께 적용하는 multiplex PCR을 수행하였다.
이러한 환경오염 문제의 해결책은 수나무와 암나무를 사용 목적에 맞게 사전에 선별하여 식재하는 것이다. 이를 위하여 본 연구에서는 SCAR 마커 기술을 이용하여 은행나무 수나무에서만 특이적인 DNA 밴드를 증폭하는 SCAR-GBM 마커를 개발하였으며, multiplex PCR 기법을 이용하여 단일 SCAR 마커 분석 과정에서 우성마커의 특성으로 인해 발생될 수 있는 위음성 오류문제를 해결하였다. 본 연구의 은행나무 암수식별 방법은 현재 국내와 중국에 특허로 등록(National Institute of Forest Science, 2014; 2015)되어 있으며, 향후 유시 생장 단계에서 은행나무의 성을 식별함으로써 은행나무를 성별에 맞게 효율적으로 활용하는데 유용할 것이다.
또한, SCAR-GBM/trnV 인트론 프라이머 조합은 수나무 특이적인 DNA 밴드는 거의 증폭되지 않았고, trnV 인트론에 해당하는 암·수 공통의 DNA 밴드만 증폭되어 암·수 여부를 명확히 식별할 수 없었다. 최종적으로 SCAR-GBM/atp1 프라이머 조합을 이용한 multipex PCR의 재현성을 확인하기 위하여 전국 8개 지역에서 채취된 은행나무 수나무와 암나무 각 10개체씩을 대상으로 multiplex PCR을 수행하였다. 그 결과 수나무 80개체에서 모두 2개의 DNA 밴드가 증폭되었고, 암나무 80개체에서 모두 1개의 DNA 밴드가 증폭되었다.
추출된 DNA는 분광측정기(Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA)을 이용하여 농도를 측정하였으며, 5 ng/µL로 희석시켜서 분석에 이용하였다.
대상 데이터
Figure 4. Multiplex PCR products, amplified with SCAR-GBM/atp1 primer combination, from 10 individuals of each male (M) and female (F) trees. PCR reactions were conducted at 63 ℃ annealing temperature.
은행나무 수나무와 암나무 식별을 위한 SCAR 마커를 분석하기 위하여 인천, 상주(경북), 청주(충북), 춘천(강원), 나주(전남), 세종(충남), 오산(경기), 진주(경남)의 8개 지역에 식재된 은행나무를 대상으로 개화기에 수꽃과 암꽃의 형태를 확인한 수나무와 암나무 각 10개체(총 160개체)를 이용하였다(Figure 1). 각 개체로부터 채취된 잎으로부터 DNA 추출 Kit(ExgeneTM Plant SV mini, GeneAll, Korea)를 이용하여 제조사의 사용법에 따라 DNA를 추출하였다.
성능/효과
프라이머 설계과정에서 SCAR-GBM 프라이머가 증폭하는 PCR 산물의 예상된 크기가 675 bp 인 점을 고려할 때(Table 1), 수나무 특이적인 DNA 밴드가 정확히 증폭된 것으로 확인되었으며, 최종적으로 염기서열 분석을 통하여 수나무에서만 증폭된 PCR 산물의 DNA 염기 서열이 기존에 보고된 염기서열과 일치함이 확인되었다(자료 미제시). SCAR-GBM 마커에 의한 수나무 특이적인 변이의 개체 간 재현성을 확인하기 위하여 지역별 1개체씩 총 8개체를 대상으로 PCR 반응을 수행한 결과 63 ℃어닐링 온도에서 수나무에서만 특이적인 DNA 밴드가 확인되어 수나무와 암나무 개체를 식별할 수 있는 DNA 마커로 판단되었다(Figure 2C and D).
cob, atp1 유전자 및 trnV 인트론 영역의 프라이머를 단독으로 PCR을 수행한 결과 수나무 또는 암나무 여부에 관계없이 분석된 모든 개체에서 각각 약 350 bp, 1,000 bp 및 550 bp 의 DNA 밴드가 관찰되었다(Figure 3A).
각각의 세포질 DNA 프라이머와 SCAR-GBM 프라이머를 동시에 단일 PCR 반응액에 첨가하여 multiplex PCR을 수행한 결과 SCARGBM/atp1 프라이머 조합에서 수나무에서는 약 700 bp와 1,000 bp의 2개의 DNA 밴드가 관찰되었으며, 암나무에서는 약 1,000 bp의 1개의 DNA 밴드만 관찰되었다.
최종적으로 SCAR-GBM/atp1 프라이머 조합을 이용한 multipex PCR의 재현성을 확인하기 위하여 전국 8개 지역에서 채취된 은행나무 수나무와 암나무 각 10개체씩을 대상으로 multiplex PCR을 수행하였다. 그 결과 수나무 80개체에서 모두 2개의 DNA 밴드가 증폭되었고, 암나무 80개체에서 모두 1개의 DNA 밴드가 증폭되었다. 이러한 결과로부터 SCAR-GBM 마커의 수나무 특이성과 multiplex PCR의 높은 재현성을 확인할 수 있었다(Figure 4).
따라서 본 연구의 multiplex PCR은 SCARGBM 프라이머 만을 이용한 독립적인 PCR 조건을 동일하게 적용하면서 미토콘드리아 DNA 증폭용 프라이머를 동일한 농도로 추가하여 수행하였다. 그 결과, SCARGBM/atp1 조합에서 예상된 증폭 결과가 안정적으로 확인되었으며(Figure 3B and Figure 4), gradient PCR에서도 50~64.1 ℃ 어닐링 온도에서 미토콘드리아 DNA와 수나무 특이 DNA가 안정적으로 증폭되는 결과를 나타내어(Figure 5), SCAR-GBM/atp1 조합을 이용한 multiplex PCR 조건 이 특정한 반응 조건에 제한적이지 않으면서도 특이적인 PCR 결과를 나타내는 것으로 판단되었다. 또한 본 연구에서 사용된 시약(dNTP, Taq DNA 중합효소) 및 PCR 기기 외의 다른 브랜드의 시약과 PCR 기기를 이용한 분석 에서도 일관성 있는 결과가 관찰되었다(자료 미제시).
5 ℃ 범위의 어닐링 온도에서 공히 약 700 bp의 DNA 밴드가 증폭되었다(Figure 2A and B). 그러나 64.8 ℃ 어닐링 온도에서는 수나무에서만 DNA 밴드가 선택적으로 증폭되었으며, 67.7 ℃ 어닐링 온도 이상에서는 수나무와 암나무 모두 DNA 밴드가 증폭되지 않았다. 따라서 RAPD 변이체에서 나타난 수나무에서만 증폭 되는 변이 양상을 재현하기 위한 SCAR-GBM의 최적 PCR 반응 온도는 대략적으로 62~65 ℃ 범위인 것으로 확인되었다.
7 ℃ 어닐링 온도 이상에서는 수나무와 암나무 모두 DNA 밴드가 증폭되지 않았다. 따라서 RAPD 변이체에서 나타난 수나무에서만 증폭 되는 변이 양상을 재현하기 위한 SCAR-GBM의 최적 PCR 반응 온도는 대략적으로 62~65 ℃ 범위인 것으로 확인되었다. 프라이머 설계과정에서 SCAR-GBM 프라이머가 증폭하는 PCR 산물의 예상된 크기가 675 bp 인 점을 고려할 때(Table 1), 수나무 특이적인 DNA 밴드가 정확히 증폭된 것으로 확인되었으며, 최종적으로 염기서열 분석을 통하여 수나무에서만 증폭된 PCR 산물의 DNA 염기 서열이 기존에 보고된 염기서열과 일치함이 확인되었다(자료 미제시).
각각의 세포질 DNA 프라이머와 SCAR-GBM 프라이머를 동시에 단일 PCR 반응액에 첨가하여 multiplex PCR을 수행한 결과 SCARGBM/atp1 프라이머 조합에서 수나무에서는 약 700 bp와 1,000 bp의 2개의 DNA 밴드가 관찰되었으며, 암나무에서는 약 1,000 bp의 1개의 DNA 밴드만 관찰되었다. 따라서 분석된 모든 개체에서 1개 이상의 DNA 밴드를 확인할 수 있으며, 이를 통해 PCR 과정에서 발생할 수 있는 위음성 여부를 확정할 수 있게 되었다(Figure 3B). 반면, SCARGBM/cob1 프라이머 조합의 multiplex PCR에서는 수나무 특이 DNA 밴드와 cob1 유전자에 해당하는 암·수 공통의 DNA 밴드가 희미하게 증폭되어 암·수 여부를 명확히 식별할 수 없었다.
1 ℃ 어닐링 온도에서 미토콘드리아 DNA와 수나무 특이 DNA가 안정적으로 증폭되는 결과를 나타내어(Figure 5), SCAR-GBM/atp1 조합을 이용한 multiplex PCR 조건 이 특정한 반응 조건에 제한적이지 않으면서도 특이적인 PCR 결과를 나타내는 것으로 판단되었다. 또한 본 연구에서 사용된 시약(dNTP, Taq DNA 중합효소) 및 PCR 기기 외의 다른 브랜드의 시약과 PCR 기기를 이용한 분석 에서도 일관성 있는 결과가 관찰되었다(자료 미제시). 이는 개발된 SCAR-GBM 마커를 실제 이용하는 측면에서 다양한 실험실 환경으로 인한 미세한 분석조건의 차이에 의해서 분석결과에 오류가 초래되지 않고 일관된 결과를 나타낼 수 있는 유용한 특성으로 생각된다.
또한, SCAR-GBM/trnV 인트론 프라이머 조합은 수나무 특이적인 DNA 밴드는 거의 증폭되지 않았고, trnV 인트론에 해당하는 암·수 공통의 DNA 밴드만 증폭되어 암·수 여부를 명확히 식별할 수 없었다.
본 연구에서 개발된 SCAR-GBM 마커는 우성 마커 형태로 수나무에서만 특이적으로 증폭되어 PCR 산물을 확인할 수 있는 반면에 암나무는 DNA가 증폭되지 않아 PCR 산물이 관찰되지 않았다. PCR 산물이 관찰되지 않는 경우 실제로 분석된 개체가 암나무이기 때문에 PCR 산물이 증폭되지 않은 것인지, 아니면 실제로는 수나무이지만 DNA의 순도 불량, DNA 또는 기타 PCR 관련 시약의 누락과 같은 PCR 반응에 부정적인 영향을 주는 요소에 의해 PCR 과정에서 DNA가 증폭되지 않는 것(위음성) 인지에 대한 불확실성의 문제가 제기될 수 있다(Mastan et al.
본 연구에서 설계된 SCAR 프라이머 세트(이하 SCARGBM)를 이용하여 기존에 보고된 수나무에서만 증폭되는 RAPD 변이 양상을 재현하기 위한 최적 PCR 반응 온도를 탐색하기 위해서 gradient PCR을 수행한 결과 수나무와 암나무 모두 40~61.5 ℃ 범위의 어닐링 온도에서 공히 약 700 bp의 DNA 밴드가 증폭되었다(Figure 2A and B). 그러나 64.
, 2011). 본 연구에서도 기존의 RAPD 분석에서 확인된 수나무 특이적인 DNA 변이체로부터 개발된 SCAR-GBM 프라이머에 의한 증폭산물이 우성 마커의 형태로 나타나 일반적인 SCAR 마커의 특성을 나타내었다. 이러한 결과는 SCARGBM 프라이머의 염기서열이 RAPD 변이체 염기서열의양 말단에 존재하는 RAPD 프라이머의 염기서열을 일부 포함하고, 약 20개 nucleotides 이상으로 특이성이 높게 설계되었으며(Table 1, 재료 및 방법 참조), 40~61.
본 연구에서도 기존의 RAPD 분석에서 확인된 수나무 특이적인 DNA 변이체로부터 개발된 SCAR-GBM 프라이머에 의한 증폭산물이 우성 마커의 형태로 나타나 일반적인 SCAR 마커의 특성을 나타내었다. 이러한 결과는 SCARGBM 프라이머의 염기서열이 RAPD 변이체 염기서열의양 말단에 존재하는 RAPD 프라이머의 염기서열을 일부 포함하고, 약 20개 nucleotides 이상으로 특이성이 높게 설계되었으며(Table 1, 재료 및 방법 참조), 40~61.5℃ 어닐링 온도 범위에서 수나무와 암나무에서 모두 동일한 크기의 DNA 밴드가 증폭되어 수나무와 암나무 게놈 상에 공히 SCAR-GBM 프라이머가 결합하는 부위가 존재함을 알 수 있었다. 그러나 비교적 높은 어닐링 온도조건(62~65 ℃ 범위)에서 암나무에서 SCAR-GBM 프라이머에 의한 PCR 증폭산물이 관찰되지 않았는데 이는 프라이머가 결합하는 위치에서의 미세한 염기서열 변이에 따른 비상보성으로 인하여 비교적 높은 어닐링 온도조건에서 프라이머와 주형 DNA의 불완전 결합으로 인한 DNA 합성(extension)반응의 실패에 의한 것으로 판단된다.
그 결과 수나무 80개체에서 모두 2개의 DNA 밴드가 증폭되었고, 암나무 80개체에서 모두 1개의 DNA 밴드가 증폭되었다. 이러한 결과로부터 SCAR-GBM 마커의 수나무 특이성과 multiplex PCR의 높은 재현성을 확인할 수 있었다(Figure 4).
따라서 RAPD 변이체에서 나타난 수나무에서만 증폭 되는 변이 양상을 재현하기 위한 SCAR-GBM의 최적 PCR 반응 온도는 대략적으로 62~65 ℃ 범위인 것으로 확인되었다. 프라이머 설계과정에서 SCAR-GBM 프라이머가 증폭하는 PCR 산물의 예상된 크기가 675 bp 인 점을 고려할 때(Table 1), 수나무 특이적인 DNA 밴드가 정확히 증폭된 것으로 확인되었으며, 최종적으로 염기서열 분석을 통하여 수나무에서만 증폭된 PCR 산물의 DNA 염기 서열이 기존에 보고된 염기서열과 일치함이 확인되었다(자료 미제시). SCAR-GBM 마커에 의한 수나무 특이적인 변이의 개체 간 재현성을 확인하기 위하여 지역별 1개체씩 총 8개체를 대상으로 PCR 반응을 수행한 결과 63 ℃어닐링 온도에서 수나무에서만 특이적인 DNA 밴드가 확인되어 수나무와 암나무 개체를 식별할 수 있는 DNA 마커로 판단되었다(Figure 2C and D).
후속연구
이를 위하여 본 연구에서는 SCAR 마커 기술을 이용하여 은행나무 수나무에서만 특이적인 DNA 밴드를 증폭하는 SCAR-GBM 마커를 개발하였으며, multiplex PCR 기법을 이용하여 단일 SCAR 마커 분석 과정에서 우성마커의 특성으로 인해 발생될 수 있는 위음성 오류문제를 해결하였다. 본 연구의 은행나무 암수식별 방법은 현재 국내와 중국에 특허로 등록(National Institute of Forest Science, 2014; 2015)되어 있으며, 향후 유시 생장 단계에서 은행나무의 성을 식별함으로써 은행나무를 성별에 맞게 효율적으로 활용하는데 유용할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
은행나무는 언제부터 지구에 살기 시작했는가?
은행나무(Ginkgo biloba L.)는 고생대 페름기(2억 8천 ~2억 3천 년 경)에 지구상에 출현하여 중생대 쥬라기에 가장 번성하였으며, 살이 있는 화석으로 불리기도 한다(Major, 1967). 은행나무는 높이가 60 m, 지름 4 m에 달하는 낙엽 교목으로 암수의 생식기관 및 생식세포가 각각의 다른 개체에서 발생하는 암수딴그루(자웅이주, dioecism) 식물이다(Lee, 2003).
은행나무 열매의 문제점은 무엇인가?
은행나무 열매(이하 은행)는 암나무에서만 열리며 독특한 악취를 발산하는데(Wada and Haga, 1997), 가로수로 암나무가 식재된 경우 가을철 은행의 악취와 낙과로 인한 거리오염으로 도시 미관이 저해되고 사람들에게 불편을 주는 문제가 발생해왔다. 은행나무의 성은 생식기관 즉, 꽃의 형태나 열매의 결실 여부로 식별될 수 있으나, 성목이 되어 생식기관이 출현하는데 까지 약 20~30년이 소요 되는데(Singh et al.
PCR 기반의 분자마커 기술인 RAPD 마커의 단점은 무엇인가?
(2008)은 PCR 기반의 분자마커 기술인 RAPD 마커를 이용하여 암나무와 수나무 식별이 가능한 DNA 변이체를 확인하였다. 그러나 일반적으로 핵형분석은 실험과정이 복잡하고 고도의 분석기술을 요하는 단점이 있으며, PCR 기반의 RAPD 마커는 핵형분석과 비교하여 실험이 단순하지만 무작위로 선정된 10개의 뉴클레오 타이드로 구성된 짧은 임의 프라이머(random primer)를 이용하므로 다수의 DNA 조각이 증폭되어 동시에 분석되기 때문에 개체별로 암수 특이 DNA 조각의 존재 여부를 확인하는 것이 용이하지 않기 때문에 암수식별의 신뢰도가 떨어지는 단점이 있다.
참고문헌 (21)
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Echenard, V., Lefort, F., Calmin, G., Perroulaz, R., and Belhahri, L. 2008. A new and improved automated technology for early sex determination of Ginkgo biloba. Arboriculture and Urban Forestry 34: 300-307.
Jiang, L., You, R.L., Li, M.X., and Shi, C. 2003. Identification of a sex-associated RAPD marker in Ginkgo biloba. Acta Botanica Sinica 45(6): 742-747.
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