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문제 정의
- 본 연구는 조제유류 중 지방산에 대해 최신 분석법을 마련하고자 수행하였다. 조제유류 중 지방산 함량 분석을 위해 GC를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통 중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다.
- 본 연구에서는 최신 지방산 분석법을 검토하고 시험법 검증 가이드라인을 참고하여 밸리데이션을 수행한 후 식품에 대한 적용성을 확인하여 분석법을 확립하고자 한다.
제안 방법
- AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시하는 방법참고하여 GC의 분석조건에 따라 linoleic acid 및 α-linolenic acid 표준물질 검량선의 기울기(S) 및 표준편차를 이용하여 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기로 나눈 것을 검출한계(검출한계 = 3.3×δ/S), 10배를 곱한 것을 정량한계 (정량한계 = 10×δ/S)로 하였다. Linoleic acid 및 α- linolenic acid의 검출 한계는 각각 0.
- 정확성은 표준인증물질인 SRM 1849a (Infant formula)를 이용하여 회수율을 구하여 확인하였고, 정밀성은 시료량을 달리하여 반복성(repeatability) 을 측정하였으며, 실험실간 비교시험을 통한 재현성 (reproducibility)을 relative standard deviation (% RSD)으로나타내었다. GC분석을 통해 검출된 시험용액 중 각 지방산 메틸 에스테르의 피크는 표준물질과 피크의 retention time을 비교하여 확인하였다. 분석된 데이터는 지방산 메틸에스테르에 대한 결과이므로 탄소계수를 대상으로 각각의 전환계수를 계산하여 지방산 100g당 함량으로 전환하였다.
- 07%로 확인되었다. 그 결과, 마조니어관 또는 시험관을 사용한 전처리 방법에 따른 두 지방산의 함량값에는 유의적인 차이가 없었으나 (P>0.05) 상대표준편차가 낮고 보다 간편하고 안전한 시험관을 사용하는 방법을 선정하였다(Table 2). 또한 지방 추출 및 유도체화 과정에서 시약과 가열 여부가 다른 식품공전 시험법과 ISO 시험법을 비교하였다.
- 이때 시험법 적용 판별은 식품공전 식품의 기준 및 규격 중 특수용도 식품(조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식)에 대한 기준·규격이 있는 linoleic acid 및 α-linolenic acid를 함량 및 비율을 기준으로 하였다 (Table 1). 또한 기준 규격의 단위 mg/kcal에 대하여 함량 비교를 위해 조제유류의 100mL당 열량(Kcal)과 조유량(g) 을 고려하여 g/100g의 농도수준으로 환산하였다.
- 81%로 확인되었다. 또한 실험에 소요되는 시간도 식품공전 시험법의 경우 2시간 이내, ISO 시험법은 3시간 이내로보다 효율적인 식품공전 시험법의 가열검화방법을 선정하였다.
- 05) 상대표준편차가 낮고 보다 간편하고 안전한 시험관을 사용하는 방법을 선정하였다(Table 2). 또한 지방 추출 및 유도체화 과정에서 시약과 가열 여부가 다른 식품공전 시험법과 ISO 시험법을 비교하였다. 그 결과, 유도 체화방법에 따른 두 지방산의 함량값에는 유의적인 차이가 없었으나(P>0.
- 이 중 생산이 중단되거나 품목제조보고가 중복된 제품을 시험대상에서 제외하였다. 먼저 제품유형별로 시료를 구분하고, 생산량 통계자료를 활용하여 제조사별 상위제품을 선정하였다. 최종적으로 선정된 시료는 영아용 조제 유, 성장기용 조제유, 영아용 조제식, 성장기용 조제식 각각 3품목으로 총 12품목이었으며, 국내 인터넷 판매 사이트를 통하여 구매하여 실험에 사용하였다(Fig.
- GC분석을 통해 검출된 시험용액 중 각 지방산 메틸 에스테르의 피크는 표준물질과 피크의 retention time을 비교하여 확인하였다. 분석된 데이터는 지방산 메틸에스테르에 대한 결과이므로 탄소계수를 대상으로 각각의 전환계수를 계산하여 지방산 100g당 함량으로 전환하였다.
- 조제유류 중 지방산 함량 분석을 위해 GC를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통 중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다. 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다. Linoleic acid 및 α-linolenic acid의 0.
- 분석법 검증을 통하여 확립된 방법으로 시중에 유통 중인 조제유류 및 조제식 12건에 대한 지방산 함량을 확인하였다. 분석을 통한 linoleic acid 및 α-linolenic acid 함량과 제품의 표시량을 비교하였고 기준·규격에 적합하여 시험법이 유효한지를 판단하였다.
- 시료 적용성 검토를 위해 영아용 조제유, 성장기용 조제 유, 영아용 조제식, 성장기용 조제식 각각 3품목씩 총 12품목에 대해 본 연구를 통해 확립한 지방산 분석법을 적용하여 함량을 확인하였다(Table 9). 영아용 조제유의 경우 linoleic acid 및 α-linolenic acid 분석값은 각각 3.
- 1). 이 중 생산량이 가장 높은 영아용 조제유 1종을 표본으로 하여 시험법 검토 및 유효성 검증을 실험하였으며 이를 포함한 12종에 대해 시험법 적용성 검사를 하였다. 표준인증물질은 NIST 사(Gaithersburg, MD, USA)에서 판매하는 SRM 1849a (Infant formula)를 구매하여 분석에 사용하였다.
- 검출기의 온도는 285 C로 하였다. 이때 시험법 적용 판별은 식품공전 식품의 기준 및 규격 중 특수용도 식품(조제유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식)에 대한 기준·규격이 있는 linoleic acid 및 α-linolenic acid를 함량 및 비율을 기준으로 하였다 (Table 1). 또한 기준 규격의 단위 mg/kcal에 대하여 함량 비교를 위해 조제유류의 100mL당 열량(Kcal)과 조유량(g) 을 고려하여 g/100g의 농도수준으로 환산하였다.
- 구하였다. 이때 식품의 기준 및 규격 중 특수용도 식품(조제 유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식)에 대한 기준 규격이 있는 linoleic acid 및 α-linolenic acid를 기준으로 하였다. 직선성을 확인하기 위하여 5개 농도의 지방산표준용액을 GC로 측정하여 얻은 각각의 피크 면적으로부터 검량선을 작성하였다.
- 15mL 시험관에 에테르 층을 분액한 후 질소를 사용하여 35-40 C 수조에서 에테르를 증발시켰다. 이후 기기분석에 용이하도록 methylation을 진행하였다. 앞에서 추출한 지방에 3mL 클로로포름과 3mL 디에틸에테르를 첨가해 추출한 지방을 녹인 후 40 C 수조에서 질소 농축하고 2mL의 7% 트리플루오로보란메탄올 용액과 1mL의 톨루엔을 첨가하였다.
- 직선성을 확인하기 위하여 5개 농도의 지방산표준용액을 GC로 측정하여 얻은 각각의 피크 면적으로부터 검량선을 작성하였다. 정확성은 표준인증물질인 SRM 1849a (Infant formula)를 이용하여 회수율을 구하여 확인하였고, 정밀성은 시료량을 달리하여 반복성(repeatability) 을 측정하였으며, 실험실간 비교시험을 통한 재현성 (reproducibility)을 relative standard deviation (% RSD)으로나타내었다. GC분석을 통해 검출된 시험용액 중 각 지방산 메틸 에스테르의 피크는 표준물질과 피크의 retention time을 비교하여 확인하였다.
- 정확한 함량정보를 알고 있는 표준인증시료(NIST 1849a) 를 이용하여 정확도를 확인하였으며, 5회씩 반복 측정하(n=5) 였다. 그 결과, linoleic acid 및 α-linolenic acid의 회수율은 각각100.
- 수행하였다. 조제유류 중 지방산 함량 분석을 위해 GC를 이용한 분석법을 확립하고 시중에 유통 중인 제품을 대상으로 적용성을 검토하였다. 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다.
- 지방 추출시 사용되는 시험기구를 마조니어관 과 시험으로 하여 비교실험하였다. 표본시료에 대해 균질화관된 검체를 약 50-100mg의 지방을 포함하는 양으로 칭량하여 마조니어관에 넣고 약 50mg의 피로갈롤을 첨가한 후, 1mL의 내부표준용액을 첨가하였다.
- 이때 식품의 기준 및 규격 중 특수용도 식품(조제 유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식)에 대한 기준 규격이 있는 linoleic acid 및 α-linolenic acid를 기준으로 하였다. 직선성을 확인하기 위하여 5개 농도의 지방산표준용액을 GC로 측정하여 얻은 각각의 피크 면적으로부터 검량선을 작성하였다. 정확성은 표준인증물질인 SRM 1849a (Infant formula)를 이용하여 회수율을 구하여 확인하였고, 정밀성은 시료량을 달리하여 반복성(repeatability) 을 측정하였으며, 실험실간 비교시험을 통한 재현성 (reproducibility)을 relative standard deviation (% RSD)으로나타내었다.
- 표본시료를 이용하여 검체량에 따른 반복성과 실험실간재현성으로 정밀성을 확인하였다. 반복성은 검체량을 달리 취하여 각각 5회 반복한 분석 결과에서 측정값에 대한상대 표준편차(%RSD)를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 내부표준물질인 triundecanoin (C11:0) 은 Nu-Check prep사(Elysian, MN, USA)의 것을 사용하였다. 피로갈롤, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 무수황산나트륨, 14% BF3-MeOH, 디에틸에티르, 무수 석유에테르, 에탄올, 클로로포름, 톨루엔, 헥산, 펜탄은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 조제유류 및 조제식 총 12종은 식품의약품안전처에 신고된 품목제조보고서(2018)를 확인하여 선정하였다. 이 중 생산이 중단되거나 품목제조보고가 중복된 제품을 시험대상에서 제외하였다.
- 피로갈롤, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 무수황산나트륨, 14% BF3-MeOH, 디에틸에티르, 무수 석유에테르, 에탄올, 클로로포름, 톨루엔, 헥산, 펜탄은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 분석에 사용되는 증류수는 3차 증류수로 18.0MΩ 이상인 것을 사용하였다.
- 분석칼럼으로는 SP2560 (100m×0.25mm, 0.2μm Film thickness, Supelco, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 주입량은 1μL로 주입구의 온도는 225 C로 하였고 split mode로써 split ratio는 200:1로 하였다.
- 지방산의 표준물질 중 fatty acid methyl ester (FAME, 37 Component FAME MIX, CRM47885) 혼합 표준품은 Supelco사(St. Louis, MO, USA), linoleic acid (C18:2), α- linolenic acid (C18:3)의 표준물질은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 내부표준물질인 triundecanoin (C11:0) 은 Nu-Check prep사(Elysian, MN, USA)의 것을 사용하였다.
- 먼저 제품유형별로 시료를 구분하고, 생산량 통계자료를 활용하여 제조사별 상위제품을 선정하였다. 최종적으로 선정된 시료는 영아용 조제 유, 성장기용 조제유, 영아용 조제식, 성장기용 조제식 각각 3품목으로 총 12품목이었으며, 국내 인터넷 판매 사이트를 통하여 구매하여 실험에 사용하였다(Fig. 1). 이 중 생산량이 가장 높은 영아용 조제유 1종을 표본으로 하여 시험법 검토 및 유효성 검증을 실험하였으며 이를 포함한 12종에 대해 시험법 적용성 검사를 하였다.
- 이 중 생산량이 가장 높은 영아용 조제유 1종을 표본으로 하여 시험법 검토 및 유효성 검증을 실험하였으며 이를 포함한 12종에 대해 시험법 적용성 검사를 하였다. 표준인증물질은 NIST 사(Gaithersburg, MD, USA)에서 판매하는 SRM 1849a (Infant formula)를 구매하여 분석에 사용하였다.
- 내부표준물질인 triundecanoin (C11:0) 은 Nu-Check prep사(Elysian, MN, USA)의 것을 사용하였다. 피로갈롤, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 무수황산나트륨, 14% BF3-MeOH, 디에틸에티르, 무수 석유에테르, 에탄올, 클로로포름, 톨루엔, 헥산, 펜탄은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 분석에 사용되는 증류수는 3차 증류수로 18.
- 혼합 지방산 메틸 에스테르(FAME mixture 37종)는 용액 제조과정 없이 그대로 사용하였다. Linoleic acid (C18:2), α-linolenic acid (C18:3)의 경우 각각 0.
데이터처리
- 정밀성을 확인하였다. 반복성은 검체량을 달리 취하여 각각 5회 반복한 분석 결과에서 측정값에 대한상대 표준편차(%RSD)를 이용하여 확인하였다. 표본시료 0.
- 분석 결과는 3회 반복하여 얻었으며 평균값과 표준편차,상대표준편차를 계산하였다. 통계처리는 SPSS 를 통해 시험법 비교를 통한 linoleic acid 및 α-linolenic acid 함량에 대해 t-test를 P<0.
- 분석 결과는 3회 반복하여 얻었으며 평균값과 표준편차,상대표준편차를 계산하였다. 통계처리는 SPSS 를 통해 시험법 비교를 통한 linoleic acid 및 α-linolenic acid 함량에 대해 t-test를 P<0.05 수준에서 수행하였다.
이론/모형
- 조제유류 중 지방산 분석법에 대한 유효성을 검증하기 위하여 AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시하는 방에 따라 표본시료를 사용하여 특이성(specificity), 직법선성(linearity), 검출한계(limit of detection)와 정량한계 (limit of quantification), 정확성(accuracy), 정밀성(precision) 을 구하였다. 이때 식품의 기준 및 규격 중 특수용도 식품(조제 유류, 영아용 조제식, 성장기용 조제식)에 대한 기준 규격이 있는 linoleic acid 및 α-linolenic acid를 기준으로 하였다.
- 지방산 분석에는 Flame Ionization detector (FID)가 장착된 가스크로마토그래프(Gas chromatograph) (7890B Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 분석칼럼으로는 SP2560 (100m×0.
- 지방산 조성 분석은 FID (Flame Ionization detector) 가장착된 가스크로마토그래프(Gas chromatograph)를 사용하며, 기기 조건(Table 4)에 따라 진행한다.
성능/효과
- 분석법 검증은 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성에 대해 수행되었다. Linoleic acid 및 α-linolenic acid의 0.1-5mg/2mL 농도범위에서 R =0.999 이상의 우수한 직선성을 확인할 수 있었다. Linoleic acid 및 α-linolenic acid의 LOD는 각각 0.
- 확인하였다. 검토한 결과 표준용액과 시험용액에서 동일한 시간대에 피크가 형성됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
- 7%로 나타났다(Table 7). 결과적으로 각각의 시료량에 대해 상대표준 편차 5% 이내에서 범위가 나타나 정밀성은 유효한 것으로 확인할 수 있었다.
- 그 결과, linoleic acid 및 α-linolenic acid의 회수율은 각각100.8%와 101.1%였고, 이때의 RSD값은 각각 0.6% 와 0.7%로 확인되었다(Table 6).
- 또한 지방 추출 및 유도체화 과정에서 시약과 가열 여부가 다른 식품공전 시험법과 ISO 시험법을 비교하였다. 그 결과, 유도 체화방법에 따른 두 지방산의 함량값에는 유의적인 차이가 없었으나(P>0.05) 가열 유도체화하는 식품공전 시험법의 경우 시료 중 함량에 대한 상대표준편차가 linoleic acid와 α-linolenic acid 각각 0.87%, 0.47%로 나타났으며 상온 유도체화하는 ISO시험법은 linoleic acid와 α-linolenic acid 각각 8.43%, 7.81%로 확인되었다. 또한 실험에 소요되는 시간도 식품공전 시험법의 경우 2시간 이내, ISO 시험법은 3시간 이내로보다 효율적인 식품공전 시험법의 가열검화방법을 선정하였다.
- 08%로 확인되었다. 또한 α- linolenic acid의 표시량 대비 함량은 각각 119.0%, 119.8%이었으며 상대표준편차(RSD%)는 2.85%, 1.07%로 확인되었다. 그 결과, 마조니어관 또는 시험관을 사용한 전처리 방법에 따른 두 지방산의 함량값에는 유의적인 차이가 없었으나 (P>0.
- 식품공전에 따르면 지방을 추출할 때 마조니어관을 사용하는 방법이 제시되어 있으나 가열 과정 중 안전상의 문제나 결과의 재현성에 다소 미흡한 점이 있어 지방 추출에 사용되는 시험기구의 변경의 필요성이 대두되어 시험관을 사용하는 시험법과 비교 실험하여 그 결과를 Table 3에 제시하였다. 마조니어관 또는 시험관을 사용한 경우, 검체 중 linoleic acid의 표시량 대비 함량은 각각 Ⅲ.3%, 113.8%이었으며 상대표준 편차(%RSD)는 2.90%, 1.08%로 확인되었다. 또한 α- linolenic acid의 표시량 대비 함량은 각각 119.
- 5%임을 확인하였다. 본 연구에서 확립된 분석법을 적용하여 국내 유통 중인 조제유류 및 조제식 제품 12건에 대해 적용성 검토를 실시한 결과 전체 시료에서 분석이 용이하였으며, 모두 기준·규격에 적합함을 확인하였다. 본 결과로부터 확립된 GC를 이용한 분석법은 조제유류 중 지방산 함량을 확인하기에 적합함을 확인하였으며 국내 식품 영양성분의 관리 기반을 강화하는데 기여할 것으로 사료된다.
- 분석을 통한 linoleic acid 및 α-linolenic acid 함량과 제품의 표시량을 비교하였고 기준·규격에 적합하여 시험법이 유효한지를 판단하였다.
- 53g/100g의 함량범위를 나타내었다. 실제 전체 분석 결과는 함량에 비해 linoleic acid는 91-150%, α- linolenic acid는 96-146%가 함유되어 있으며, 이는「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전처 고시 제2018-98 호) 중 조제유류에 대한 기준·규격(Table 1)의 범위를 모두 충족시키는 값이었다. 이상의 결과로 확립된 지방산분석법으로 직선성, 정확성, 정밀성, 실험실간 교차검증의 값을 검토하였고, 이 결과는 AOAC에서 제시하는 시험법 검증 가이드라인을 만족시켜 실험법으로 사용가능함을 확인하였다.
- 실제 전체 분석 결과는 함량에 비해 linoleic acid는 91-150%, α- linolenic acid는 96-146%가 함유되어 있으며, 이는「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전처 고시 제2018-98 호) 중 조제유류에 대한 기준·규격(Table 1)의 범위를 모두 충족시키는 값이었다. 이상의 결과로 확립된 지방산분석법으로 직선성, 정확성, 정밀성, 실험실간 교차검증의 값을 검토하였고, 이 결과는 AOAC에서 제시하는 시험법 검증 가이드라인을 만족시켜 실험법으로 사용가능함을 확인하였다.
- 재현성은 실험실간 교차검증을 통해 확인하였으며, 표본 시료 1개를 선정하여 5회 반복 측정한 결과 실험실간 교차 검증에 따른 두 지방산의 함량값에는 유의적인 차이는없었으며(P>0.05) 상대표준편차(%RSD)를 확인한 결과 linoleic acid는 2.8%, α-linolenic acid는 1.5%로 나타났다 (Table 8).
- 1%로 확인하였다. 정밀성을 검토한 결과 시료 채취량에 따른 반복성은 linoleic acid 1.4-2.9%, α- linolenic acid 1.1-2.7%이었고, 실험실간 재현성은 각각 2.8%, 1.5%임을 확인하였다. 본 연구에서 확립된 분석법을 적용하여 국내 유통 중인 조제유류 및 조제식 제품 12건에 대해 적용성 검토를 실시한 결과 전체 시료에서 분석이 용이하였으며, 모두 기준·규격에 적합함을 확인하였다.
- 반복성은 검체량을 달리 취하여 각각 5회 반복한 분석 결과에서 측정값에 대한상대 표준편차(%RSD)를 이용하여 확인하였다. 표본시료 0.5g, 1.0g, 1.5g에 해당하는 검체를 취하여 5회 반복 측정한 결과 결과값의 상대표준편차(%RSD)가 linoleic acid 는 각각 0.8-2.9%, α-linolenic acid는 각각 1.1-2.7%로 나타났다(Table 7). 결과적으로 각각의 시료량에 대해 상대표준 편차 5% 이내에서 범위가 나타나 정밀성은 유효한 것으로 확인할 수 있었다.
- 03mg/mL였다. 표준인증물질 분석을 통해 정확성을 검토하였으며, linoleic acid 및 α-linolenic acid의 회수율은 각각 100.8%와 101.1%로 확인하였다. 정밀성을 검토한 결과 시료 채취량에 따른 반복성은 linoleic acid 1.
후속연구
- 본 연구에서 확립된 분석법을 적용하여 국내 유통 중인 조제유류 및 조제식 제품 12건에 대해 적용성 검토를 실시한 결과 전체 시료에서 분석이 용이하였으며, 모두 기준·규격에 적합함을 확인하였다. 본 결과로부터 확립된 GC를 이용한 분석법은 조제유류 중 지방산 함량을 확인하기에 적합함을 확인하였으며 국내 식품 영양성분의 관리 기반을 강화하는데 기여할 것으로 사료된다.
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