임상적으로 감염 시 치명적인 뇌염이나 유산을 일으키는 병원체인 톡소포자충의 치료제로 주로 사용되고 있는 설파디아진이 사용되고 있으나, 이들 약물들은 부작용과 약물 내성에 의한 치료 실패 사례들이 자주 보고되고 있다. 이러한 이유로 톡소포자충에 대한 새로운 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있으며, 합성 화학약물들에 비교하여 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물들을 원료로 한 톡소포자충의 치료가 모색되고 있다. 본 연구는 약용 작물로서 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 차전초에탄올 추출물을 이용하여 톡소포자충 대한 항원충 효과를 알아보고자 수행 있다. 본 연구 결과, 차전초 에탄올 추출물은 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제 톡소포자충의 치료로 사용되고 있는 설파디아진의 선택성 0.4 보다 차전초 에탄올 추출물의 선택성이 4.5으로 매우 높은 것을 알 수 있다. 본 차전초 에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다. 톡소포자충에 감염된 세포에 차전초 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 감염 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 차전초 에탄올 추출물의 적용 농도가 높아질수록 톡소포자충 감염에 의한 세포의 형태적 변화를 감소시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 차전초는 정상 세포에 독성이 적고 톡소포자충의 억제 능력이 우수하여 항톡소토자충 선택성이 높은 소재임을 알 수 있었다. 향후 차전초 추출물 소재는 현재 톡소포자충 치료에 사용되는 합성 약제의 부작용이 문제를 해결하고 효능과 안전성이 높은 천연물 소재로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.
임상적으로 감염 시 치명적인 뇌염이나 유산을 일으키는 병원체인 톡소포자충의 치료제로 주로 사용되고 있는 설파디아진이 사용되고 있으나, 이들 약물들은 부작용과 약물 내성에 의한 치료 실패 사례들이 자주 보고되고 있다. 이러한 이유로 톡소포자충에 대한 새로운 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있으며, 합성 화학약물들에 비교하여 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물들을 원료로 한 톡소포자충의 치료가 모색되고 있다. 본 연구는 약용 작물로서 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 차전초 에탄올 추출물을 이용하여 톡소포자충 대한 항원충 효과를 알아보고자 수행 있다. 본 연구 결과, 차전초 에탄올 추출물은 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제 톡소포자충의 치료로 사용되고 있는 설파디아진의 선택성 0.4 보다 차전초 에탄올 추출물의 선택성이 4.5으로 매우 높은 것을 알 수 있다. 본 차전초 에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다. 톡소포자충에 감염된 세포에 차전초 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 감염 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 차전초 에탄올 추출물의 적용 농도가 높아질수록 톡소포자충 감염에 의한 세포의 형태적 변화를 감소시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 차전초는 정상 세포에 독성이 적고 톡소포자충의 억제 능력이 우수하여 항톡소토자충 선택성이 높은 소재임을 알 수 있었다. 향후 차전초 추출물 소재는 현재 톡소포자충 치료에 사용되는 합성 약제의 부작용이 문제를 해결하고 효능과 안전성이 높은 천연물 소재로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.
Toxoplasmosis is an important cause of foodborne, inflammatory illnesses, as well as congenital abnormalities. Currently available therapies are ineffective for persistent chronic disease and congenital toxoplasmosis or have severe side effects which may result in life-threatening complications. The...
Toxoplasmosis is an important cause of foodborne, inflammatory illnesses, as well as congenital abnormalities. Currently available therapies are ineffective for persistent chronic disease and congenital toxoplasmosis or have severe side effects which may result in life-threatening complications. There is an urgent need for safe and effective therapies to eliminate or treat this cosmopolitan infectious disease. The aim of this study was to investigate the in vitro anti-Toxoplasma activities of Plantago asiatica L., one of the herbal extracts, using tachyzoit of T. gondii RH strain infected HeLa cells. As the results, the selectivity of Plantago asiatica L. extract was 4.5, which was higher than Sulfadiazine selectivity (0.4). Also, we perfomed the cell proliferation inhibition test and the morphological study to evaluate the anti-T. gondii activity of Plantago asiatica L. extract with HeLa cells. As the results, the inhibition rate of the Plantago asiatica L. extract was high inhibition rate. This indicates that the Plantago asiatica L. extract may be used for new anti-T. gondii agent.
Toxoplasmosis is an important cause of foodborne, inflammatory illnesses, as well as congenital abnormalities. Currently available therapies are ineffective for persistent chronic disease and congenital toxoplasmosis or have severe side effects which may result in life-threatening complications. There is an urgent need for safe and effective therapies to eliminate or treat this cosmopolitan infectious disease. The aim of this study was to investigate the in vitro anti-Toxoplasma activities of Plantago asiatica L., one of the herbal extracts, using tachyzoit of T. gondii RH strain infected HeLa cells. As the results, the selectivity of Plantago asiatica L. extract was 4.5, which was higher than Sulfadiazine selectivity (0.4). Also, we perfomed the cell proliferation inhibition test and the morphological study to evaluate the anti-T. gondii activity of Plantago asiatica L. extract with HeLa cells. As the results, the inhibition rate of the Plantago asiatica L. extract was high inhibition rate. This indicates that the Plantago asiatica L. extract may be used for new anti-T. gondii agent.
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문제 정의
이러한 이유로 톡소포자충에 대한 새로운 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있으며, 합성 화학약물들에 비교하여 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물들을 원료로 한 톡소포자충의 치료가 모색되고 있다. 본 연구는 약용 작물로서 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 차전초 에탄올 추출물을 이용하여 톡소포자충 대한 항원충 효과를 알아보고자 수행 있다. 본 연구 결과, 차전초 에탄올 추출물은 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제 톡소포자충의 치료로사용되고 있는 설파디아진의 선택성 0.
, 2006). 본 연구에서는 약용 작물로써 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 차전초 추출물을 이용하여 톡소포자충 원충에 대한 항원충 효과를 알아보고자 한다.
제안 방법
이때 대조군으로서 설파디아진(Sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany) 을 사용하였다. 24시간 뒤 세포증식분석으로 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab. Co., Korea)를 실시하고, 30분 후, 흡광광도계로 450 ㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하여, 톡소포자충의 증식을 억제하는 유효농도 EC50 (50% 세포증식억제농도)를 산출하였고, 항톡소포자충증 효과에 대한 약효판정은 Park et al. (2003)의 방법에 따라서 선택성(selectivity)을 구하여 보다 높은 선택성을 가진 물질이 항톡소포자충증 효과가 있는 것으로판정하였다. 선택성을 구하는 식은 다음과 같았다.
농도로 처리하였다. 24시간 후, 세포증식분석으로 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab.Co., Korea)를 실시하고, 15분 후, 흡광광도계로 450 ㎚에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 세포의 증식률(proliferation rate: PR)은 다음과 같은 공식을 이용하여 구하였다.
24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 well을 대조군으로 설정하고 나머지 well에는 각각 차전초 추출물을 4, 20, 100, 200, 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 후, 세포증식분석으로 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab.
24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 well을 대조군으로 설정하고 나머지 well에는 각각 차전초 추출물을 4, 20, 100, 200, 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 후, 세포증식분석으로 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab.
24시간 후, 어떤 처리도 하지 않은 well 을 대조군으로 설정하고 나머지 well에는 각각 차전초 추출물을 4, 20, 100, 200, 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 24시간 후,Nikon Eclipse E200 (Nikon, Japan) 현미경과 image analyzer (Focus Technology, Germany)를 이용하여 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다.
배양기에서 배양하였다. 6시간 후, 2%의 FBS가 함유된배지로 교환 및 톡소포자충 영양형을 HeLa 세포주의 5배 되게처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다.
HeLa 세포에 차전초 에탄올 추출물과 설파디아진을 농도별로 처리했을 때 세포와 톡소포자충에서의 EC50 값을 산출하였다. 차전초 에탄올 추출물을 처리하였을 때 HeLa 세포에서의 EC50 값은 4023.
6시간 후, 2%의 FBS가 함유된배지로 교환 및 톡소포자충 영양형을 HeLa 세포주의 5배 되게처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다. 이때 대조군으로서 설파디아진(Sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany) 을 사용하였다.
5 × 105개의 톡소포자충의 영양 형을 8주령 ICR mouse 수컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 하였다. 그리고 DPBS media (GIBCO, Lot No. 1664542, USA) 5 ㎖을 복강에 주입하고 1분 동안 가볍게 마사지 해주었다. 다시 복수액을 5 ㎖짜리 주사기로 톡소포자충의 영양형을 뽑아내어 실험 직전까지 4℃에 보관하여 사용하였다.
2와 같았다. 차전초 추출물이 세포의 형태학적 변화에도 효과가 있는지 관찰하기 위해 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포 에 차전초 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 뒤, 광학 현미경 을 이용하여 관찰하였다. 각 실험군들은 차전초 추출물 처리 농 도에 따라서 A （0 ㎍/㎖）, B： （4 ㎍/㎖）, C （20 ㎍/㎖）, D （100 ml）, E （20 ㎍/㎖）, F （500 ㎍/㎖）의6개 군으로 분류하였다 관찰 결과, 톡소포자충에 감염된 세포는 정상 세포모양에 비해 일정 하지 않고 불규칙해 형태학적 변화가 생긴 것을 관찰할 수 있었 다 차전초 에탄올 추출물을 적용한 실험군인 A군에서 F 군으로 갈수록, 즉 차전초 추출물의 처리 농도가 높아질 수록 톡소포자충에 감염된 세포의 형태 변화가 관찰되지 않았으며, 감염 세포 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
차전초 추출물이 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에 형태학적으로 어떤 효과가 있는지 관찰해 보기 위해, 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에 차전초 추출물을 처리하고 광학 현미경으로 관찰하였다. 96 well 에 HeLa 세포를 4×104 cell/well 농도로 접종하고, 24시간 후 각각의 well에 4×105 cell/well의 비율로 톡소포자충을 감염시켰다.
)는 2012년 9 월 경북 영천에서 채집된 차전초 뿌리를 전북 익산 대한한약국에서 구입하여 사용하였다. 차전초를 잘게 세절하여, 건조된 차전초 100 g에 50% 에탄올 수용액 600 ㎖ 가하여 80℃에서 3시간동안 가열 환류추출하고 거름종이를 이용하여 3번 거른 후 여과한 후, 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하여 15.55 g을 수득하였다. 추출물은 실험 직전까지 4℃에 보관하여 사용하였다.
대상 데이터
(2004)의 방법에 따라서 ICR mouse 수컷 마우스(female mouse) 의 복강내 배양 방법을 실시하였다. 5 × 105개의 톡소포자충의 영양 형을 8주령 ICR mouse 수컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 하였다. 그리고 DPBS media (GIBCO, Lot No.
HeLa 세포(한국세포주은행, 1002)는 96 well에 9 × 103/㎖ 되게 접종하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 6시간 후, 2%의 FBS가 함유된배지로 교환 및 톡소포자충 영양형을 HeLa 세포주의 5배 되게처리하였다.
본 실험에 사용한 차전초(Plantago asiatica L.)는 2012년 9 월 경북 영천에서 채집된 차전초 뿌리를 전북 익산 대한한약국에서 구입하여 사용하였다. 차전초를 잘게 세절하여, 건조된 차전초 100 g에 50% 에탄올 수용액 600 ㎖ 가하여 80℃에서 3시간동안 가열 환류추출하고 거름종이를 이용하여 3번 거른 후 여과한 후, 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하여 15.
이론/모형
HeLa 세포에서 수행된 톡소포자충 감염과 차전초 추출물의항톡소포자충증 효과에 대난 판정은 Park et al. (2003)의 방법에 따라서 EZ-Cytox Kit (Daeil Lab.Co., Korea)를 이용하여세포증식분석을 실시하여 선택성을 산출하여 수행되었다.
본 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii, ATCC, No.50174)의 영양형(tachyzoite)의 배양은 Song et al. (2004)의 방법에 따라서 ICR mouse 수컷 마우스(female mouse) 의 복강내 배양 방법을 실시하였다. 5 × 105개의 톡소포자충의 영양 형을 8주령 ICR mouse 수컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 하였다.
성능/효과
차전초 추출물이 세포의 형태학적 변화에도 효과가 있는지 관찰하기 위해 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포 에 차전초 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 뒤, 광학 현미경 을 이용하여 관찰하였다. 각 실험군들은 차전초 추출물 처리 농 도에 따라서 A （0 ㎍/㎖）, B： （4 ㎍/㎖）, C （20 ㎍/㎖）, D （100 ml）, E （20 ㎍/㎖）, F （500 ㎍/㎖）의6개 군으로 분류하였다 관찰 결과, 톡소포자충에 감염된 세포는 정상 세포모양에 비해 일정 하지 않고 불규칙해 형태학적 변화가 생긴 것을 관찰할 수 있었 다 차전초 에탄올 추출물을 적용한 실험군인 A군에서 F 군으로 갈수록, 즉 차전초 추출물의 처리 농도가 높아질 수록 톡소포자충에 감염된 세포의 형태 변화가 관찰되지 않았으며, 감염 세포 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). Lee etal.
2). 반면에 차전초 추출물을 적용한 세포들에서는 톡소포자충에 감염된 세포들에서 관찰되는 비정형적인 모습이 억제된 것을 확인할 수 있었다 이러한 결과를 통하여 차전초 추 출물이 톡소포자충 감염된 세포에서의 증식을 억제하고 결과적 으로 세포의 손상을 경감시킬 수 있는 것으로 판단되었다.
본 연구는 약용 작물로서 보존 활용가치가 높을 것으로 예상되는 차전초 에탄올 추출물을 이용하여 톡소포자충 대한 항원충 효과를 알아보고자 수행 있다. 본 연구 결과, 차전초 에탄올 추출물은 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제 톡소포자충의 치료로사용되고 있는 설파디아진의 선택성 0.4 보다 차전초 에탄올 추출물의 선택성이 4.5으로 매우 높은 것을 알 수 있다. 본 차전초에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다.
5으로 매우 높은 것을 알 수 있다. 본 차전초에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다. 톡소포자충에 감염된세포에 차전초 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 감염 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 차전초 에탄올 추출물의 적용 농도가 높아질수록 톡소포자충 감염에 의한 세포의 형태적변화를 감소시키는 것을 알 수 있다.
5이었다. 설파다이아진 처리시 HeLa 세포에서의 EC50 값은 636.3 ㎍/㎖, 톡소포자충에서의 EC50 값은 1553.1 ㎍/㎖로 선택성은 0.4을 나타내었다(Table 1). 이러한 결과로부터 차전초 에탄올 추출물은 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에서 항톡소포자충증 약물인 설파디아진 보다 11.
4을 나타내었다(Table 1). 이러한 결과로부터 차전초 에탄올 추출물은 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에서 항톡소포자충증 약물인 설파디아진 보다 11.25배 높은 선택성을 보여 톡소포자충의 증식을 효과적으로 억제하는효과가 있다는 결론을 도출할 수 있었다.
, 2008). 이러한 결과로부터 차전초 에탄올 추출물은톡소포자충의 치료제로서 효능과 안전성이 우수한 것을 알 수 있었다.
(2008) 연구에서 또한 천연물이 적용된 세포의 생존도에는 유의한 감소가 없었으나 톡소포자충에 감염된 세포수를 유의하게 감소시키는 것을확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 차전초 에탄올 추출물이용량 의존적으로 톡소포자충의 증식을 억제할 수 있는 것으로 판단되었다.
톡소포자충에 감염된세포에 차전초 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 감염 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 차전초 에탄올 추출물의 적용 농도가 높아질수록 톡소포자충 감염에 의한 세포의 형태적변화를 감소시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 차전초는 정상 세포에 독성이 적고 톡소포자충의 억제 능력이 우수하여 항톡소토자충 선택성이 높은 소재임을 알 수 있었다. 향후 차전초 추출물 소재는 현재 톡소포자충 치료에 사용되는 합성 약제의 부작용이 문제를 해결하고 효능과 안전성이 높은 천연물소재로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.
2). 반면에 차전초 추출물을 적용한 세포들에서는 톡소포자충에 감염된 세포들에서 관찰되는 비정형적인 모습이 억제된 것을 확인할 수 있었다 이러한 결과를 통하여 차전초 추 출물이 톡소포자충 감염된 세포에서의 증식을 억제하고 결과적 으로 세포의 손상을 경감시킬 수 있는 것으로 판단되었다.
1과 같다. 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포에 차전초 에탄올 추출물을 0, 4, 20, 100, 200, 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 결과, 톡소포자충 감염 세포는 용량과 시간에 의존적으로 현저하게 감소하였다(Fig. 1).
본 차전초에탄올 추출물이 용량 의존적으로 톡소포자충에 감염된 HeLa 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다. 톡소포자충에 감염된세포에 차전초 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 감염 세포들의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 차전초 에탄올 추출물의 적용 농도가 높아질수록 톡소포자충 감염에 의한 세포의 형태적변화를 감소시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 차전초는 정상 세포에 독성이 적고 톡소포자충의 억제 능력이 우수하여 항톡소토자충 선택성이 높은 소재임을 알 수 있었다.
후속연구
판단되었다. 이러한 결과로, 차전초는 향후 톡소포자충 치료에 사용되는 합성 화합물 약제를 대체할 수 있는 정도의 효과와 높은 안전성을 가진 천연물 추출물로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.
이러한 결과로부터 차전초는 정상 세포에 독성이 적고 톡소포자충의 억제 능력이 우수하여 항톡소토자충 선택성이 높은 소재임을 알 수 있었다. 향후 차전초 추출물 소재는 현재 톡소포자충 치료에 사용되는 합성 약제의 부작용이 문제를 해결하고 효능과 안전성이 높은 천연물소재로 개발될 수 있을 것으로 판단되었다.
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