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문제 정의
- Zebrafish 도 인간과 마찬가지로 1차적 스트레스 호르몬으로 cortisol을사용한다[6]. 그렇기 때문에 본 연구에서도 DTP 노출에 의해서 나타난 행동의 변화가 스트레스 호르몬에 의한 것인지를확인하기 위하여 whole-body cortisol를 측정하였다. 그러나 control 그룹과 비교하여 저농도인 2.
- 따라서 본 연구에서는 제주도 골프장에서 잔디관리 목적을 위해 주로 사용되는 농약 중독성연구가 거의 없는 DTP를 시험물질로 사용하였고, DTP에 실험동물인 zebrafish를 노출시켰을 때, zebrafish의 행동에 미치는 영향을 연구하고 급성독성 시험을 평가하고자 하였다.
- 본 연구에서는 제주도 골프장에서 주로 사용되는 농약 중독성연구가 거의 이루어 지지 않은 DTP를 시험물질로 사용하였고, DTP에 zebrafish를 노출시켰을 때, 행동에 미치는 영향을 연구하고 급성 독성시험을 평가하였다.
제안 방법
- 이때, 사육수의 수온은 26±1℃로 유지시켰고, 산소 공급을 위해 aeration을 해주었다. 48시간 동안 반지 수식 시험으로 진행되었으며, 24시간마다 시험 용액을 새로 교환하였고, 시험기간 동안 먹이는 공급하지 않았다. DTP 농도 별로 24시간 후 사망률을 조사하고, 용액 교환 24시간 후 사망률을 조사하여 총 48시간 동안 실험어의 50%가 사망한농도(LC50)를 조사하였다.
- 6분 동안 0.9% 생리식염수나 OF70E에 약욕시킨 zebrafish에게 즉시 NHS를 가한 후, 체액을 얻기 위해 150mg/l 농도의 tricaine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로처리하여 안락사를 유도하였다. 안락사 유도 후 zebrafish에서물기를 제거한 뒤 액체 질소에 급속 냉동시키고 준비해놓은 cryo tube에 1× phosphate buffer saline (PBS) 2 ml 넣고 물고기를 분쇄하였다.
- 7 ml tube에 옮긴 후 cortisol 측정 시까지 -20℃에서 보관하였다. Cortisol 농도는 cortisol assay kit (R&D system, Minneapolis, Minnesota, USA)를 이용하여 측정하였다. ELISA plate를 분석하기 위해서 microplate reader (Molecular Device, USA)로파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이렇게 얻은 흡광도값은 4-parameter sigmoid minus curve를 기초하여 cortisol 농도값으로 환산되었다.
- 48시간 동안 반지 수식 시험으로 진행되었으며, 24시간마다 시험 용액을 새로 교환하였고, 시험기간 동안 먹이는 공급하지 않았다. DTP 농도 별로 24시간 후 사망률을 조사하고, 용액 교환 24시간 후 사망률을 조사하여 총 48시간 동안 실험어의 50%가 사망한농도(LC50)를 조사하였다. 행동실험에서의 실험농도 결정은 반수 치사 농도실험에서 사망이 관찰되지 않은 최고 농도를 기준으로 반수 희석하여 사용하였다.
- 48시간 동안 반지 수식 시험으로 진행되었으며, 24시간마다 시험 용액을 새로 교환하였고, 시험기간 동안 먹이는 공급하지 않았다. DTP 농도 별로 24시간 후 사망률을 조사하고, 용액 교환 24시간 후 사망률을 조사하여 총 48시간 동안 실험어의 50%가 사망한농도(LC50)를 조사하였다. 행동실험에서의 실험농도 결정은 반수 치사 농도실험에서 사망이 관찰되지 않은 최고 농도를 기준으로 반수 희석하여 사용하였다.
- 5 l의 사다리꼴 모양으로 top half과 bottom half으로 나누어 물을 가득 채운 뒤 사용하였다. Tank 정면에 camera를 설치하여 6분간 zebrafish의 유영을 관찰을 하였으며, Ethovision XT 8.5 (Noldus, Wageningen, The Netherlands) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
- 상대적으로 포유류보다 어류에서 높은 독성을 보이고 있지만 DTP에 의한 어류독성에 대해서는 많이 연구된 바가 없다. 그래서 본 실험은 zebrafish를 이용하여 DTP가 어류에 미치는 독성 반응을 연구하고자 LC50를 측정하였고, 더불어 행동약리학적 방법을 이용하여 유영패턴을 분석하였다.
- 5, 5 or 10 μM). 원통형 모양의 백색 plastic cylinder (24 cm height × 21 cm diameter)에 물을 반 채워진행하였으며, 원통형 상단에 camera를 설치하여 Ethovision XT 8.5 (Noldus, Wageningen, The Netherlands)을 이용하여 6분간 zebrafish의 행동변화를 측정하였다.
대상 데이터
- 5, 5 or 10 μM). Tank (15 cm height × 28 cm top × 23 cm bottom × 7 cm width)는 1.5 l의 사다리꼴 모양으로 top half과 bottom half으로 나누어 물을 가득 채운 뒤 사용하였다. Tank 정면에 camera를 설치하여 6분간 zebrafish의 유영을 관찰을 하였으며, Ethovision XT 8.
- 본 연구를 위한 실험동물은 수조 내에서 2주 동안 적응시킨 48마리의 wild-type의 zebrafish (Danio rerio) 성어를 사용하였다. 실험동물은 60 l 사육수조에서 순환 여과 시스템을 이용하여 사육되었다.
- 본 연구에서 사용된 DTP는 Dow Chemical Company (Hong Kong, China)로부터 구입하여 하였으며, whole-body cortisol 정량을 위하여 cortisol assay kit (R&D system, Minneapolis, Minnesota, USA)를 사용하였다. 그 외의 시약은시중에 유통되는 최고 등급의 것을 구입하여 사용하였다.
- 실험동물은 60 l 사육수조에서 순환 여과 시스템을 이용하여 사육되었다. 수온은 26-28℃로 조절하였고, 적응기간 동안 사료는 실험동물에게 1일 2회 공급되었다.
- 실험에 사용된 zebrafish는 총 48마리(group당 n=12)로, 0.9% NaCl solution 또는 DTP 용액 1 l 비커에 각각 6분간 약욕시켰다(2.5, 5 or 10 μM). Tank (15 cm height × 28 cm top × 23 cm bottom × 7 cm width)는 1.
데이터처리
- of 10-12 animals. P values for the group comparisons were obtained by one way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (*p<0.05 vs. control).
- 모든 데이터는 mean±S.E.M.으로 표현하였으며, 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 한 후 p<0.05 수준에서 Student-Newman-Keuls test를 이용하여 각 실험군 평균치간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- Barcellos 등의 방법을 이용하여 whole-body cortisol를 측정하였다[18]. 6분 동안 0.
- DTP 노출이 스트레스행동에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Robinson 등의 실험방법에 따라 novel tank test를 실시하였다[23]. 실험에 사용된 zebrafish는 총 48마리(group당 n=12)로, 0.
- DTP 노출이 행동 변화 및 자발 운동량에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 Cachat 등의 방법을 이용하여 open field test를 실시하였다[25]. Zebrafish는 총 48마리(group당 n=12)로, 0.
- 행동실험에서의 실험농도 결정은 반수 치사 농도실험에서 사망이 관찰되지 않은 최고 농도를 기준으로 반수 희석하여 사용하였다. LC50는 Finney의 probit 분석법을 이용하여 결과 값을 산출하였다[4].
- 본 실험은 DTP의 농도를 10-20 μM로 조절한 2l 비커에 zebrafish를 10마리씩 넣어 OECD 급성 독성시험 가이드라인 203을 따라 진행하였다[27]. 사육수는 각 비커 별로 1 l씩 주입하였다.
성능/효과
- 3초로 확인되었다. 2.5 μM 농도에서는 71.7±24.2초 에서는 증가 현상은 확인되었으나 통계적인 유의성은 확인되지 않았고, 5 μM 농도에서는 179.9±11.5초, 10 μM 농도에서는 223.9±11.1초로 통계적으로 유의성 있는 증가 현상이 확인되었다(p<0.05; Fig. 4B). 평균 유영속도에서는 control 그룹 8.
- 3 ng/g으로 관찰되었다. DTP 처리군에서의 wholebody cortisol의 변화를 측정한 결과, 2.5 μM 농도의 그룹에서 각각 2.8±0.7 ng/g로 나타나 control 그룹과 비교하여 통계적으로 유의성 있는 증가가 관찰되었으나(p<0.05), 5와10 μ M에서는 유의성 있는 차이가 관찰되지 않아 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5).
- 9 μM과 비교하여 약 27배정도 낮은 값이었다[20]. DTP가 NTT에서 zebrafish에 미치는영향이 불안 반응 및 스트레스 반응을 나타냄을 확인하였다. NTT 결과, 부동 시간과 속도에서는 5 μM 농도에서 zebrafish 에 가장 높은 효과를 나타내었다.
- DTP를 2.5, 5 그리고 10 μM 의 농도로 6분 동안 약욕 후 novel tank test를 실시한 결과, 하층부의 머무는 시간의 경우 control 그룹에서 129.5±20.6초로 나왔고, DTP 처리한 그룹에서는 2.5 μM 농도에서는 173.4±12.9초, 5 μM 농도에서는 246.1±23.1초, 10 μM 농도에서는 274.6±31.6초로 통계적으로 유의성 있는 농도 의존적으로 증가하였다(p<0.05; Fig. 3A). 상층부에 머무른 횟수는 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였고, 통계적으로 유의성이 확인되었다(p<0.
- DTP를 2.5, 5 그리고 10 μM의 농도로 6분 동안 약욕 후 open field test를 실시한 결과, 총 이동 거리는 control그룹에서 3106.5±192.2 cm였고, 2.5 μM 농도의 DTP처리 그룹에서 2255.3±312.3 cm, 5 μM 농도의 DTP 처리 그룹에서 918.5±100.8 cm, 10 μM 농도의 DTP 처리 그룹에서는 790.3±54.5 cm로 control 그룹과 비교하여 통계적으로 유의성이 있는 감소현상이 확인되었다(p<0.05; Fig. 4A). 부동 시간에서는 control 그룹의 결과 값은 32.
- DTP가 NTT에서 zebrafish에 미치는영향이 불안 반응 및 스트레스 반응을 나타냄을 확인하였다. NTT 결과, 부동 시간과 속도에서는 5 μM 농도에서 zebrafish 에 가장 높은 효과를 나타내었다. 또한 control 그룹과 비교하였을 때 이동거리, 상층부에 머무른 횟수는 유의성 있는 감소를 나타내었고, 회전각, 하층부에 머무는 시간은 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였다.
- NTT에서는 하층부에 머무는 시간 및 최초로 상층부에 들어간 시간, 회전각의 유의성 있는 증가 현상(Fig. 3A 및 3C, 3D, 3G)과 총 이동 거리 및 평균 유영속도, 상층부 진입 회수에서 통계적으로 유의성 있는 감소 현상(Fig. 3B 및 3E, 3F) 이확인되었다. 이러한 현상은 Kist 등이 zebrafish를 100 μg/l 농도의 microcystins에 노출 시킨 후, NTT 실시 결과와 매우 유사하였다[22].
- 그리고 DTP가 OFT에서 zebrafish에 미치는 영향이 유영과 관련이 있다는 사실을 알게되었다. OFT 결과, DTP에 노출시켰을 때 이동거리와 평균 유영속도는 control 그룹과 비교하였을 때 유의성 있게 감소하였다. 부동시간, 회전각 및 굴곡유영에서는 DTP에 노출 시켰을때 농도 의존적으로 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었다.
- 4D). Zebrafish의 유영을 확인하는 굴곡유영에서는 control 그룹에서 500.5±122.2 deg/cm의 수치가 확인이 되었고, 2.5 μM 농도에서는 1012.7±442.3 deg/cm, 5 μM 농도에서는 4580.3±620.0 deg/cm 그리고 10 μM 농도에서는 5462.5±477.7 deg/cm로통계적인 유의성 있는 증가 현상을 확인하였다(p<0.05; Fig. 4E).
- 두 가지 행동실험의 결과 DTP가 zebrafish한테 불안감 또는스트레스 반응을 야기하는 것을 알 수 있었다. 그러나 wholebody cortisol level를 측정한 결과, 흥미롭게도 농도의존적으로 감소하는 경향을 관찰할 수 있었다.
- 또한 control 그룹과 비교하였을 때 이동거리, 상층부에 머무른 횟수는 유의성 있는 감소를 나타내었고, 회전각, 하층부에 머무는 시간은 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였다. 그리고 DTP가 OFT에서 zebrafish에 미치는 영향이 유영과 관련이 있다는 사실을 알게되었다. OFT 결과, DTP에 노출시켰을 때 이동거리와 평균 유영속도는 control 그룹과 비교하였을 때 유의성 있게 감소하였다.
- 3B). 그리고 최초로 상층부에 들어간 시간은 control 그룹과 비교 하였을 때 5 μM 및 10 μM에서 통계적으로 유의성이 있는 증가가 관찰되었고, 특히 5 μM에서 최초로 상층부에 들어간 시간이 가장 길게 나타났다(p<0.05; Fig. 3C). 회전각의 경우, control 그룹과 비교 하였을 때 통계적으로 유의성이 있는 농도 의존적으로 증가하였다(p<0.
- 급성 독성시험을 통해서 zebrafish에서의 DTP의 LC50값이 14.49 μM 이라는 것을 확인하였고, 이는 bluegill과 rainbow trout의 LC50값 보다 약 100배 정도 낮은 값이며[2], 빈용되는제초제인 paraquat의 LC50값 388.9 μM과 비교하여 약 27배정도 낮은 값이었다[20]. DTP가 NTT에서 zebrafish에 미치는영향이 불안 반응 및 스트레스 반응을 나타냄을 확인하였다.
- 기존 보고에 따르면 OFT에서는 zebrafish에게 lysergic acid diethylamide를 250 μg/l 농도로 20분간 노출시켰을 때 총 이동거리와 평균 유영속도가 감소하고 부동 시간이 증가하는 경향이 확인되었고[19], 본 연구에서도 총 이동 거리와 평균 유영속도가 농도의존적으로 통계적으로 유의성 있게 감소되고 부동 시간이 농도의존적으로 통계적으로 유의성 있게 증가되는 현상을 확인하였다. 기존 연구 결과와 비교하였을 때 DTP에 노출되는 것은 zebrafish에게 화학적 스트레스로 작용을 하여 이동거리 감소 및 유영속도, 움직이는 시간 등에 영향을 준 것으로 사료된다. 또한 스트레스 하의 zebrafish는 정상적인 직선 유영을 적게 하고 좌우로 몸을 흔드는 비정상적인 유영을 많이 하게 된다.
- 부동시간, 회전각 및 굴곡유영에서는 DTP에 노출 시켰을때 농도 의존적으로 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었다. 두 가지 행동실험의 결과 DTP가 zebrafish한테 불안감 또는스트레스 반응을 야기하는 것을 알 수 있었다. 그러나 wholebody cortisol level를 측정한 결과, 흥미롭게도 농도의존적으로 감소하는 경향을 관찰할 수 있었다.
- NTT 결과, 부동 시간과 속도에서는 5 μM 농도에서 zebrafish 에 가장 높은 효과를 나타내었다. 또한 control 그룹과 비교하였을 때 이동거리, 상층부에 머무른 횟수는 유의성 있는 감소를 나타내었고, 회전각, 하층부에 머무는 시간은 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였다. 그리고 DTP가 OFT에서 zebrafish에 미치는 영향이 유영과 관련이 있다는 사실을 알게되었다.
- )를 조사하였다. 반수치사농도 실험 결과 zebrafish에서의 DTP의 LC50 값은 14.49 μM 로 관찰되었다(Fig. 2).
- [9]. 본 연구에서는 시간 당 유영 방향의 변화를 통하여 굴곡 유영을 측정한 결과, control 그룹과 비교하여 DTP에 노출된 실험군에서 굴곡 유영 및 회전각이 유의성 있게 증가하였고 이는 DTP에 노출되는 것이 zebrafish에 화학적 스트레스로 작용을 하여 불안 및 스트레스 반응을 유도한 것으로 사료된다.
- 3F). 부동 시간 측정 결과, control 그룹에서 36.7±4.9초로 나왔으며, 약물을 처리하였을 때 2.5 μM 농도에서는 72.4±9.7초, 5 μM 농도에서는 175.9±17.9초 그리고 10 μM 농도에서는 165.5±25.7초의 결과값으로 통계적인 유의성 있는 증가 현상이 확인되었다(p<0.05; Fig. 3G).
- OFT 결과, DTP에 노출시켰을 때 이동거리와 평균 유영속도는 control 그룹과 비교하였을 때 유의성 있게 감소하였다. 부동시간, 회전각 및 굴곡유영에서는 DTP에 노출 시켰을때 농도 의존적으로 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었다. 두 가지 행동실험의 결과 DTP가 zebrafish한테 불안감 또는스트레스 반응을 야기하는 것을 알 수 있었다.
- 저자는 총 이동거리가 감소하고, 부동 시간이 증가하는데, 이는 microcystins가 zebrafish에게 화학적 스트레스 요인으로 작용하여 zebrafish의 행동에 영향을 미친다고 보고한 바 있다[22]. 새로운 환경에 노출된 zebrafish는 바닥에서 유영하는 강력한 불안 반응을 나타내는 것으로 알려져 있고[8], 본 연구에서 DTP에 노출에 의해서 하층부의 머무는 시간이 증가하게 되는데, 이러한 결과는 microcystins에 zebrafish를 노출시켰을 때 하층부의 머무는 시간이 증가하는 것과 유사하며 DTP 또한 zebrafish에 화학적 스트레스로 작용을 하여 불안 및 스트레스 반응을 유도한 것으로 사료된다.
- 예비실험을 통하여 LC50의 범위가 10-20 μM의 범위임을 확인하였다. 본 실험은 DTP의 농도를 10-20 μM로 조절한 2l 비커에 zebrafish를 10마리씩 넣어 OECD 급성 독성시험 가이드라인 203을 따라 진행하였다[27].
- 자발운동량 및 유영 패턴을 분석하기 위하여 OFT를 실시한 결과, 총 이동 거리와 평균 유영속도에서 통계적으로 유의성 있는 감소 현상이 확인 되었고(Fig. 4A 및 4C), 부동 시간 및 회전각, 굴곡유영에서 통계적으로 유의성 있는 증가현상이 관찰되었다(Fig. 4B 및 4D, 4E). 기존 보고에 따르면 OFT에서는 zebrafish에게 lysergic acid diethylamide를 250 μg/l 농도로 20분간 노출시켰을 때 총 이동거리와 평균 유영속도가 감소하고 부동 시간이 증가하는 경향이 확인되었고[19], 본 연구에서도 총 이동 거리와 평균 유영속도가 농도의존적으로 통계적으로 유의성 있게 감소되고 부동 시간이 농도의존적으로 통계적으로 유의성 있게 증가되는 현상을 확인하였다.
- 사용되는 제조제이다. 제초제 사용은 상품 작물을 보호하고 상품의 가치를 증가시키며 경제적으로 손해를 줄일 수있는 방법으로 농업 환경에서 중요한 수단이지만, 제초제의과도한 사용은 어체에게 스트레스 인자로 작용할 수 있음을본 연구를 통해 확인할 수 있었다. 본 연구는 제초제 사용으로인한 환경 영향 및 어류의 스트레스 반응에 대해서 학문적으로 기여할 것으로 사료된다.
- 3D). 평균 유영속도는 control 값이 5.7±0.2 cm/s 였으며, DTP 2.5 μM, 5 μM 그리고 10 μM를처리 하였을 때 4.5±0.3 cm/s, 2.6±0.2 cm/s 그리고 2.9±0.3 cm/s로 유의성 있는 감소가 나타났다. 특히 5 μM 농도에서 평균 유영속도가 가장 느린 값이 나왔다(p<0.
- 4B). 평균 유영속도에서는 control 그룹 8.3±0.5 cm/s과 비교하였을 때 2.5 μM 농도에서는 6.2±0.8 cm/s, 5 μM 농도에서는 2.7±0.2 cm/s 그리고 10 μM 농도에서는 2.1±0.1 cm/s로 농도 의존적으로 통계적으로 유의성 있는 감소 현상이 확인되었다(p<0.05; Fig. 4C). 회전각의경우, control 그룹에서는 24.
후속연구
- 본 연구는 제초제 사용으로인한 환경 영향 및 어류의 스트레스 반응에 대해서 학문적으로 기여할 것으로 사료된다. 또한 차후 추가 연구를 통하여 DTP의 내분비계 교란 작용기전을 명확하게 밝혀야 할 것이다.
- 제초제 사용은 상품 작물을 보호하고 상품의 가치를 증가시키며 경제적으로 손해를 줄일 수있는 방법으로 농업 환경에서 중요한 수단이지만, 제초제의과도한 사용은 어체에게 스트레스 인자로 작용할 수 있음을본 연구를 통해 확인할 수 있었다. 본 연구는 제초제 사용으로인한 환경 영향 및 어류의 스트레스 반응에 대해서 학문적으로 기여할 것으로 사료된다. 또한 차후 추가 연구를 통하여 DTP의 내분비계 교란 작용기전을 명확하게 밝혀야 할 것이다.
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