[논문]해양성 Marinomonas sp. SH-2 균주가 생성하는 agarase의 분리 및 특성조사

조정권; 이솔지; 이동근; 이상현

doi:10.5352/jls.2016.26.2.198

해양성 Marinomonas sp. SH-2 균주가 생성하는 agarase의 분리 및 특성조사
Characterization of Agarase Produced from the Isolated Marine Bacterium Marinomonas sp. SH-2 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.26 no.2 = no.190, 2016년, pp.198 - 203

조정권 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 이솔지 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 이동근 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 이상현 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 많은 생리활성 기능을 갖는 한천올리고당과 네오한천올리고당을 생산할 수 있는 agarase를 생성하는 신규 해양성 세균을 분리하고, 이 균주가 생성하는 한천분해효소의 특성을 조사하였다. 한천분해활성을 가진 신규의 SH-2 균주는 경상남도 남해군 연안에서 채취한 해수에서 분리하였으며, 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Marinomonas 속 세균과 약 99% 유사하여 Marinomonas sp. SH-2로 명명하였다. Agarase는 Marinomonas sp. SH-2 균주의 배양액으로부터 추출하였으며, 한천분해활성을 측정한 결과, pH 6.0의 20 mM Tris-HCl buffer를 사용할 경우 30℃에서 최고 활성(170.2 units/l)이 나타났다. 하지만, 40℃ 이상의 온도에서 0.5시간 이상 처리할 경우 효소의 잔존활성이 40% 이하로 감소하는 것으로 보아 이 효소는 내열성을 가지지 않는다고 판단되었다. 효소의 가수분해산물을 TLC로 분석한 결과, Marinomonas sp. SH-2으로부터 생성되는 효소는 아가로스를 분해하여 neoagarohexaose와 neoagarotetraose를 생성하여 β-agarase로 확인되었다. 따라서 Marinomonas sp. SH-2와 이 균주의 한천분해효소는 식품, 화장품, 의약품 연구 등에 실용적으로 적용할 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study aimed to isolate a novel agarase-producing marine bacterium and characterize its agarase, as agarases are known to produce biofunctional agarooligosaccharides or neo-agarooligosaccharides. A novel agar-degrading bacterium, SH-2, was isolated from the seawater of Namhae in Gyeongnam Province, Korea, and cultured in Marine agar 2216 medium. The 16S rRNA gene sequence represented 99% identity with that of the members of the Marinomonas genus; hence, the isolated bacterium was named Marinomonas sp. SH-2. The crude agarase was prepared from a culture medium of Marinomonas. sp SH-2, and exhibited maximum agarase activity at 170.2 units/l. The optimum conditions were pH 6.0 and 30℃ in 20 mM Tris-HCl buffer. The agarase activity of the bacterium was highly elevated from 20℃(42% relative activity) to 30℃(100%), and 82% activity was shown at 40℃. Its relative activities were less than 40% at over 40℃ after a 0.5 hr exposure. Relative activity was 100% at pH 6.0, while it was 72% and 48% at pH 5.0 and pH 7.0, respectively. The enzyme from Marinomonas sp. SH-2 degraded agarose to neoagarohexaose and neoagarotetraose, indicating that the enzyme is β-agarase. Thus, Marinomonas sp. SH-2 and its enzyme could be practical for applications in food, cosmetic, and medical research.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

제안 방법

5 ml을 첨가하여 30분간 반응시키고, 효소반응액 1 ml에 DNS용액 3 ml를 첨가한 후 중탕으로 10분 동안 끓여서 반응시켰으며, 흐르는 물에 식힌 후에 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1분당 1 μmole의 galactose를 생산하는 효소의 양을 1 unit로 정의하였으며, galactose를 이용하여 표준검정선을 작성하였다.
250 ml 삼각플라스크에 0.2% agar (LPS solution, Daejeon, KOREA)가 포함된 Marine broth 2216 media를 준비한 후 SH-2를 접종하여 30℃, 250 rpm으로 진탕배양하면서 12시간간격으로 일부배양액을 채취하여 균주의 생장양상과 한천분해효소의 활성을 측정하였다.
5일간 30℃, 250 rpm에서 배양하였다. 4.5일간 배양된 배양액을 원심분리(3,000× g, 4℃, 15분)하여획득한 상층액을 반투과성막(SnakeSkin Dialysis Tube, Thermo Scientific, USA)에 옮겨 담은 후 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) 완충액에 넣고 4℃에서 투석을 실시하였다. 투석은 20 mM Tris-HCl (pH 7.
배양시간에 따른 세균 생장의 결과를 살펴 보면 접종한 후 1일까지 흡광도 변화가 크게 나타났으며, 4일까지 개체군의 생장률이 점차 증가하였고, 그 이후 감소되었다. Agarase 활성은 개체군의 생장률이 가장 높은 4.5일에 높게 나타나 이후 연구에서는 4.5일 배양한 배양액을 이용하여 agarase 활성을 측정하였다.
분리된 Genomic DNA는 PCR을 하기 위한 주형으로 사용하였고, PCR primer는 1492R (5'-TAC GGH TACCT GTT ACG ACT T-3')과 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')를 이용했으며, PCR반응산물은 PCR/Gel Combo Kit (NulcleoGen, Siheung, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열분석은 Cosmogentech (Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 알려진 균주와 비교하였으며 윈도우 버전의 Clustal 프로그램(ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1, 000) 로분석하여 계통분류학적인 위치를 파악하였다.
배양된 한천 분해균 주를 동정하기 위하여 16S rDNA 염기서열분석을 실시하였다. Genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 분리하였다. 분리된 Genomic DNA는 PCR을 하기 위한 주형으로 사용하였고, PCR primer는 1492R (5'-TAC GGH TACCT GTT ACG ACT T-3')과 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')를 이용했으며, PCR반응산물은 PCR/Gel Combo Kit (NulcleoGen, Siheung, Korea)로 정제하였다.
Marinomonas sp. SH-2가 생성하는 한천분해효소의 열 안정성은 0.5, 1, 1.5, 2시간 동안 각각의 온도(20, 30, 40, 50, 60, 70℃)에서 반응시킨 후 효소의 활성을 측정하였다(Fig. 4). 0.
sp. SH-2를 분리·동정하였고, 균주가 생산하는한천분해효소의 특성을 규명하여 산업적 사용 가능성을 분석하였다.
5 ml을 혼합하여 30℃에서 0, 1, 24시간 동안 반응시켜 제조하였고, Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석하였다. TLC 분석은 n-butanol/acetic acid/ H₂O (2:1:1, by volume)를 사용하여 전개하였고, 10%(v/v) H₂SO₄를 이용하여 발색시켰다. 표준물질로는 D-galactose (Sigma, St.
선별한 SH-2 균주는 Marine broth 2216 media (Difco, Detroit, USA) 에 접종하여 1일간 진탕배양(30℃, 250 rpm)하였다. 배양된 한천 분해균 주를 동정하기 위하여 16S rDNA 염기서열분석을 실시하였다. Genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 분리하였다.
Genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 분리하였다. 분리된 Genomic DNA는 PCR을 하기 위한 주형으로 사용하였고, PCR primer는 1492R (5'-TAC GGH TACCT GTT ACG ACT T-3')과 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')를 이용했으며, PCR반응산물은 PCR/Gel Combo Kit (NulcleoGen, Siheung, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열분석은 Cosmogentech (Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행하였다.
chromatography (TLC)로 분석하였다. 분해산물은 agarose 0.2% (w/v)가 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충액 1 ml에조효소액 0.5 ml을 혼합하여 30℃에서 0, 1, 24시간 동안 반응시켜 제조하였고, Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석하였다. TLC 분석은 n-butanol/acetic acid/ H₂O (2:1:1, by volume)를 사용하여 전개하였고, 10%(v/v) H₂SO₄를 이용하여 발색시켰다.
조효소액 0.5 ml을 20, 30, 40, 50, 60, 70℃ 등 각 온도별로 각각 0.5, 1, 1.5, 2시간 열처리한 후 효소 활성을 측정하였다.
중탕가열한 표준기질용액을 20, 30, 40, 50, 60, 70℃ 등의각 온도별로 냉각한 후 각 온도에서 효소 활성을 측정하였다.
효소액을 이용하여 생산된 agarose의 분해산물을 thin-lay- er chromatography (TLC)로 분석하였다. 분해산물은 agarose 0.

대상 데이터

경남 남해군 연안 해수를 채취한 후 한천분해 활성에 의해배지를 함몰시키는 균주를 선발하였다. 선발된 균주를 Marine broth 2216 media에 접종하여 5일간 진탕배양(30℃, 250 rpm) 하였다.
경상남도 남해군의 해안에서 시료를 채취하여 연속적으로 희석한 후 원액과 희석수를 100 μl씩 Marine agar 2216 media (Difco, Detroit, USA)에 도말하였다. 시료액이 도말된 Marine agar 2216 media는 30℃에서 배양하였으며 평판배지를 함몰시키는 한천분해활성이 있는 SH-2 균주를 선별하였다.
Detroit, USA)에 도말하였다. 시료액이 도말된 Marine agar 2216 media는 30℃에서 배양하였으며 평판배지를 함몰시키는 한천분해활성이 있는 SH-2 균주를 선별하였다. 선별한 SH-2 균주는 Marine broth 2216 media (Difco, Detroit, USA) 에 접종하여 1일간 진탕배양(30℃, 250 rpm)하였다.
TLC 분석은 n-butanol/acetic acid/ H₂O (2:1:1, by volume)를 사용하여 전개하였고, 10%(v/v) H₂SO₄를 이용하여 발색시켰다. 표준물질로는 D-galactose (Sigma, St. Louis, USA) 및 neoagarooligosaccharides [6] 를사용하였다.
한천분해효소의 반응온도와 열안전성 측정에는 0.2% (w/v)의 agarose (Promega, Wisconsin, USA)를 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충액을 표준기질용액으로 사용하였다. 표준기질용액 1.

데이터처리

DNA 염기서열분석은 Cosmogentech (Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 알려진 균주와 비교하였으며 윈도우 버전의 Clustal 프로그램(ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1, 000) 로분석하여 계통분류학적인 위치를 파악하였다.

이론/모형

SH-2로 명명하였다. 본 연구와 Genbank에서 획득한 16S rDNA 염기서열을 Neighbor-join- ing method와 Bootstrap method (n=1,000)로 분석한 계통분류학적인 위치를 Fig. 1에 나타냈다.
한천분해효소의 반응산물의 환원당은 DNS (3, 5-dinitrosa- licylic acid)법을 이용하여 측정하였다[9]. DNS용액은 NaOH 13.

성능/효과

4). 0.5 시간 열처리한 조효소의 활성은 20℃에서는 56%, 30℃에서는 94%, 40℃에서는 40%로 활성이 유지되는 것으로 보였지만, 0.5시간 이후에 40℃ 이상의 온도에서는 활성이 50%이하로감소하였다. 따라서 본 효소는 열안정성을 가지지 않는 것으로 판단되었다.
Marinomo- nas sp. SH-2 균주가 생산하는 한천분해 효소의 분해산물을 TLC로 분석한 결과, 반응시간 24시간 이하에서는 spot이 뚜렷하게 나타나지 않는 것으로 보아 agarose가 완전히 분해되지 않았다고 판단되었다. Spot이 뚜렷하게 나타난 24시간에는 neoagarotetraose와 neoagarohexaose가 생성되는 것으로 확인되었으며, 전체분해산물의 46.
SH-2 균주가 생산하는 한천분해 효소의 분해산물을 TLC로 분석한 결과, 반응시간 24시간 이하에서는 spot이 뚜렷하게 나타나지 않는 것으로 보아 agarose가 완전히 분해되지 않았다고 판단되었다. Spot이 뚜렷하게 나타난 24시간에는 neoagarotetraose와 neoagarohexaose가 생성되는 것으로 확인되었으며, 전체분해산물의 46.1%가 neoagarohexaose이고, 36.2%가 neoagarotetraose인 것으로 확인되었다. 주요 분해 산물이 네오한천올리고당인 것으로 보아 Marinomonas sp.
5시간 이후에 40℃ 이상의 온도에서는 활성이 50%이하로감소하였다. 따라서 본 효소는 열안정성을 가지지 않는 것으로 판단되었다. 반면 Thalassomonas sp.
2에 나타냈다. 배양시간에 따른 세균 생장의 결과를 살펴 보면 접종한 후 1일까지 흡광도 변화가 크게 나타났으며, 4일까지 개체군의 생장률이 점차 증가하였고, 그 이후 감소되었다. Agarase 활성은 개체군의 생장률이 가장 높은 4.
3에 나타냈다. 한천분해활성은 30℃에서 가장 높게 나타났으며, 30℃ 의 반응온도에서 나타난 활성을 100%로 하였을 경우, 40℃의반응온도에서는 82%, 50℃의 반응온도에서는 47%, 60℃의 반응온도에서는 18%, 70℃의 반응온도에서 8%의 상대활성을 나타냈다. 균주에 따른 최적 온도는 Agarivorans albus QM38 [16], Cellvibrio sp.

후속연구

본연구결과를 바탕으로 Marinomonas sp. SH-2의 배양조건 최적화 및 DNA cloning을 시도하여 β-agarase를 대량생산하고, 아가로스나 한천을 분해하여 고기능성 네오한천올리고당을대량생산하면 화장품, 식품 및 의약품 산업 등의 다양한 분야에서 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

참고문헌 (17)

Cha, J. A., Kim, Y. J., Seo, Y. B. and Yoon, M. H. 2009. Isolation of an agarolytic bacteria, Cellvibrio mixtus SC-22 and the enzymatic properties. J. Appl. Biol. Chem. 52, 157-162.

원문보기 상세보기
Jang, H. J., Lee, D. G., Lee, S. W., Jeon, M. J., Chun, W. J., Kwon, K. K., Lee, H. S. and Lee, S. H. 2011. Isolation of a marine-derived Flammeovirga sp. mbrc-1 strain and characterization of its agarase. Kor. Soc. Biotechnol. Bioeng. J. 26, 552-556.
Jeon, M. J., Kim, A. R., Lee, D. G. and Lee, S. H. 2012. Cloning, expression, and characterization of a novel GH-16 β-agarase from Agarivorans sp. JA-1. J. Life Sci. 22, 1545-1551.

원문보기 상세보기
Jung, I. S. 2007. Purification and characterization of agarase produced from marine bacterium, Sphingomonas paucimobilis AS-1 and Aligibacter lectus AS-3. M.S. dissertation. Silla University, Busan, Korea.
Kim, Y. J. 2010. Properties of the agarase and its gene isolated from a marine bacterium, Tamlana agarivorans. Chungnam National Univ. Taejon, Korea.
Lee, D. G., Jang, M. K., Lee, O. H., Kim, N. Y., Ju, S. A. and Lee, S. H. 2008. Over-production of a glycoside hydrolase family 50 β-agarase from Agarivorans sp. JA-1 in Bacillus subtilis and the whitening effect of its product. Biotechnol. Lett. 30, 911-918.

상세보기
Lee, D. G., Kim, N. Y., Jang, M. K., Lee, O. H. and Lee, S. H. 2007. Isolation and characterization of a marine bacterium Thalassomonas sp. SL-5 producing β-agarase. J. Life Sci. 17, 70-75.

원문보기 상세보기
Lee, D. G., Lee, O. H., Jang, H. J., Jang, M. K., Yoo, K. H. and Lee, S. H. 2008. Isolation and characterization of a marine derived bacterium Glaciecola sp. SL-12 producing β-agarase. J. Life Sci. 18, 58-62.

원문보기 상세보기
Lee, J. H. and Lee, S. Y. 2014. Isolation and characterization of marine bacterial strain SH-1 producing agar-degrading enzymes. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 42, 324-330.

원문보기 상세보기
Lee, S. A., Kim, J. U., Jung, J. G., Kim, I. H., Lee, S. H., Kim, S. J. and Lee, J. H. 2006. Production of β-agarase in batch and fed-batch culture by Agarivorans sp. JA-1. Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 21, 389-393.
Lee, Y. D., Oh, C. H., Zoysa, M. D., Kim, H. W., Wickramaarachchi, W. D. N., Whang, I. S., Kang, D. H. and Lee, J. H. 2013. Molecular cloning, overexpression, and enzymatic characterization of glycosyl hydrolase family 16 β-agarase from marine bacterium Saccharophagus sp. AG21 in Escherichia coli. J. Microbiol. Biotechnol. 23, 913-922.

원문보기 상세보기
Lim, D. J., Kim, B. J., Bae, S. K., Kim, J. D. and Kong, J. Y. 1999. Immobilization of agarase for the agarooligosaccharide production. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 27, 208-214.
Nikapitiya, C., Oh, C. H., Lee, Y. D., Lee, S. K., Whang, I. S. and Lee, J. H. 2010. Characterization of a glycoside hydrolase family 50 thermostable β-agarase AgrA from marine bacteria Agarivorans sp. AG17. Fish. Aq. Sci. 13, 36-48.
Oh, Y. H., Jung, C. and Lee, J. 2011. Isolation and characterization of a novel agarase-producing Pseudoalteromonas spp. Bacterium from the guts of spiny turban shells. J. Microbiol. Biotechnol. 21, 818-821.

원문보기 상세보기
Rhee, Y. J., Han, C. R., Kim, W. C., Jun, D. Y., Rhee, I. K. and Kim, Y. H. 2010. Isolation of a novel freshwater agarolytic Cellvibrio sp. KY-YJ-3 and characterization of its extracellular beta-agarase. J. Microbiol. Biotechnol. 20, 1378-1385.

원문보기 상세보기
Xie, H., Han, B., Dong, W., Yang, Y., Chang, J., Peng, Y. and Liu, W. 2009. Isolation and characterization of a marine agarase. Wei. Sheng. Wu. Xue. Bao. 49, 896-901.

상세보기
Yoon, J. H., Kang, S. J. and Oh, T. K. 2005. Marinomonas dokdonensis sp. Nov., isolated from sea water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 2303-2307.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증