[논문]Agarase를 생산하는 Pseudoalteromonas sp. JH-1의 분리·동정 및 agarase의 특성 연구

이동근; 김주희; 이상현

doi:10.5352/jls.2021.31.5.496

Agarase를 생산하는 Pseudoalteromonas sp. JH-1의 분리·동정 및 agarase의 특성 연구
Isolation of a Pseudoalteromonas sp. JH-1 Producing Agarase and Characterization of its Agarase 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.5, 2021년, pp.496 - 501

이동근 (신라대학교 제약공학과) , 김주희 (신라대학교 일반대학원 그린화학융합공학과) , 이상현 (신라대학교 제약공학과)

초록
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본 연구에서는 해양 한천 분해 세균인 Pseudoalteromonas sp. JH-1을 분리하여 그 성장과 agarase 특성을 조사하였다. 부산 기장군 용궁사 앞바다에서 해수를 채취하여 Marine agar media로 한천 분해 세균을 분리하여 배양하였다. 순수하게 분리된 박테리아는 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통해 Pseudoalteromonas sp. JH-1로 명명하였다. 세포외 분비 효소를 Pseudoalteromonas sp. JH-1의 배양 배지에서 얻었으며 agarase의 특성 파악에 사용하였다. Agarase는 50℃와 pH 6.0의 20 mM Tris-HCl 완충액에서 116.6 U/l의 최대 활성을 보였다. 20, 30, 40, 50, 60, 70℃에서 상대활성은 각각 31, 60, 94, 100, 45 및 31%였다. pH 4, 5, 6, 7, 8, 9에서 상대활성은 각각 49, 85, 100, 87, 81 및 67%였다. Agarase는 20, 30, 40℃에서 2시간 동안 열처리 후 85% 이상의 잔류 활성을 보였고, 50℃에서 2시간 동안 노출 후에도 82% 이상의 잔류 활성을 보였다. Zymogram 분석으로 Pseudoalteromonas sp. JH-1이 55 및 97 kDa의 agarase를 생성하는 것을 확인하였다. Agarase는 두 가지 종류가 있고 한천을 기질로 α-agarase 또는 β-agarase가 작용하여 만들어지는 한천올리고당과 네오한천올리고당은 항산화, 항종양, 피부 미백, 대식세포 활성화 및 prebiotics 효과가 있으므로 Pseudoalteromonas sp. JH-1와 그의 agarase에 대한 연구는 의미가 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the marine agar-degrading bacterium Pseudoalteromonas sp. JH-1 was isolated, and its growth and agarase properties were investigated. Seawater was collected from the offshore of the Yonggung Temple in Busan, and agar-degrading bacteria were isolated and cultured with marine agar medium. The bacterium Pseudoalteromonas sp. JH-1 was isolated through 16S rRNA gene sequencing. The extracellularly secreted enzyme was obtained from the culture broth of Pseudoalteromonas sp. JH-1 and was used to characterize its agarase. The extracellular agarase exhibited a maximum activity of 116.6 U/l at 50℃ and pH 6.0 of 20 mM Tris-HCl buffer. Relative activities were 31, 59, 94, 100, 45, and 31% at 20, 30, 40, 50, 60, and 70℃, respectively. Relative activities were 49, 85, 100, 86, 81, and 67% at pH 4, 5, 6, 7, 8, and 9, respectively. Residual activity was more than 85% after exposure at 20, 30, and 40℃ for 2 hr, and more than 82% after exposure at 50℃ for 2 hr. Zymogram analysis confirmed that Pseudoalteromonas sp. JH-1 produced at least two agarases of 55 and 97 kDa. As the products of α-agarase and β-agarase have antioxidation, antitumor, skin-whitening, macrophage activation, and prebiotic effects, further studies are needed on the agarase of Pseudoalteromonas sp. JH-1.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. Phylogenetic position of Pseudoalteromonas sp. JH-1 based on almost complete 16S rDNA sequence. The number of branch nodes is a percentage of the bootstrap value, and the number after the strain name is the NCBI's registration number.
그림 Fig. 2. Cell growths and agarase activities of Pseudoalteromonas sp. JH-1. (◯ cell growth [OD₆₀₀], ● agarase activity [unit/l]).
그림 Fig. 3. Effect of reaction temperature on agarase activity. The reaction was performed at 20, 30, 40, 50, 60, and 70℃ for 30 minutes with 1 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 6.0, 0.2% (w/v) agarose) and 0.5 ml of the raw enzyme solution.
그림 Fig. 4. Effects of pH on the agarase activities. Sodium acetate buffers (20 mM pH 4.0-5.0, ▲), Tris-HCl buffer (20 mM pH 5.0-8.0, ◯) and GTA buffer (pH 8.0-9.0, ●) were used. Each buffer contained 0.2% (w/v) agarose. The reaction was carried out in 1 ml of buffer and 0.5 ml of raw enzyme solution for 30 minutes at 50℃.
그림 Fig. 5. Remaining activity of agarase after heat treatment. The live enzyme solution was pre-incubated at 20 (◯), 30 (□), 40 (△), 50 (●), 60 (■) and 70℃ (▲) for 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 hr. The reaction was carried out at 50℃ for 30 minutes in 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% (w/v) agarose and 0.5 ml of heat-treated raw enzyme solution.
그림 Fig. 6. Zymogram analysis of agarases. The molecular weights of the enzymes are estimated 97.0 and 55.0 kDa (size marker: lane M, agarases: lane E).

AI 본문요약
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문제 정의

또한 분리한 Pseudoalteromonas sp. JH-1의 생육특성과 균주가 생산하는 agarase의 특성을 밝히고자 하였다.
본 연구에서는 새로운 한천 분해효소 개발을 위하여 부산광역시 기장군 기장읍 해동용궁사 해안의 해수를 채취하고, 한천분해 세균을 채취한 시료에서 분리하고 동정하였다. 또한 분리한 Pseudoalteromonas sp.

제안 방법

반응온도에 따른 agarase의 활성을 측정하기 위하여 조 효소액 0.5 ml에 표준기질용액 1 ml를 혼합하여 20, 30, 40, 50, 60, 70℃의 각각의 온도에서 효소활성을 측정하였다.
분리된 균주 JH-1의 분류학적 위치를 동정하기 위하여 16S rRNA의 유전자 단편을 PCR으로 증폭하였으며 1.4 kb의 염기서열을 분석하였다. 이후 BLAST를 이용하여 Pseudoalteromonas sp.
2% (w/v)가 첨가된 Marine 액체배지 50 ml을 가진 삼각플라스크에 4 ml를 접종하고, 진탕배양기(250 rpm, 30℃)에서 5일간 배양하였다. 진탕배양 기간 중 매 24시간 마다 배양액의 일부를 채취하여 배양시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 한천분해 효소활성을 측정하였다. 균주의 생육은 분광광도계로 600 nm에서 측정하였다.
효소의 열안정성을 측정하기 위해 20, 30, 40, 50, 60, 70℃에 2시간 동안 노출시키면서 0.5, 1.0, 1.5, 2.0시간이 되었을 때 각각 효소의 활성을 측정하였다. 각 온도에 노출된 조 효소액의 활성은 열처리하지 않은 조효소액의 활성과 비교하였다.

대상 데이터

배양한 후에 한천 고체배지를 함몰시키는 균주들을 선택하여 각각의 Marine agar 배지에 재배양한 후 함몰 상태가 깊게 활성을 나타내는 균주 2종을 선발하였다. Wizard Genomic DNA isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 순수분리된 균체로부터 genomic DNA를 획득하고, PCR로 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하였다.
부산광역시 기장군 기장읍 해동용궁사 연안의 해수를 채취하여 Marine 한천배지에 도말 후 한천배지에 함몰을 나타내는 균을 선별하였다.
부산광역시 기장군 기장읍 해동용궁사의 해수를 시료로 채취하였으며, 채취한 시료액을 멸균 증류수로 희석한 후 Marine broth (Conda S.A., Madrid, Spain)에 한천을 첨가한 고체 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다.

이론/모형

분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST로 타 균주들과의 유사도를 검토하여 균주 동정에 이용하였다. Clustal (ClustalW2) 프로그램을 통하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행하고 MEGA 프로그램의 Neighbor-joining method와 bootstrap method (n=1,000)로 계통분류학적 위치를 파악하였다.

성능/효과

60과 70℃에서는 30분간 노출된 이후에는 한천분해활성이 사라지는 것으로 관찰되었다. 따라서 본 연구의 한천분해효소는 50℃ 이하의 온도에서는 열 안정성을 어느 정도 가지는 것으로 판단되었다.
동일한 pH에서 높은 상대활성을 나타내는 것을 기준으로 하여 pH 4, 5, 6, 7, 8 및 9에서의 상대활성은 각각 49, 85, 100, 87, 81, 67%였다. 최고 활성을 나타낸 pH 6에서의 활성을 100%로 하면 pH 5.0 및 7.0에서는 85% 이상의 높은 활성을 보였다. 20 mM Tris- HCl 완충용액을 사용하면 pH 5.

후속연구

0에서는 85% 이상의 높은 활성을 보였다. 20 mM Tris- HCl 완충용액을 사용하면 pH 5.0~8.0 범위에서 80% 이상의 상대 활성을 보여 향후의 응용과정에서 pH에 의해 효소 활성의 변화가 크지 않을 것으로 생각되었다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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