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문제 정의
- 하지만 전처리과정에 많은 시간이 필요하고 고가의 시약 및 장비를 필요로 하는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 넙치(Paralichthysolivaceus)를 대상으로 OTC의 약욕과 경구투여에 따른 피부, 근육, 간의 잔류특성을 미생물학적 간이검사법과 HPLC 정량분석법으로 조사함으로써, 올바른 수산용 항생제 사용지도에 기초자료로 활용될 것이며 나아가 안전한 양식 수산물 생산에 기여하고자 본 연구를 실시하였다.
제안 방법
- OTC를 물 1톤당 25 g 농도로 넙치에 1시간 약욕한 약욕처리구와 OTC를 어체 중 kg당 62.5 mg의 양을 사료에 혼합시켜 7일간 경구 투여한 경구투여구로 구분하여 실험하였다. 그리고 미생물학적 간이검사법을 이용하여 넙치 피부, 근육에 대한 잔류특성을 분석하였고 HPLC 정량분석법을 이용하여 넙치 피부, 근육, 간의 잔류특성을 분석하였다.
- 결과 판정은 시험평판의 주변 억제대 폭으로써 결과를 판정하였다. 시험평판의 주변 억제대 폭이 1.
- 그 이후는 6일간격으로 총 54일까지 3마리씩 시료를 채취하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 경구투여구는 Oxytetracyclin-HCl 표준품(Sigma)으로 OTC의 투여농도를 어체중 kg 당 62.5 mg의 양을 사료에 혼합시켜 7일간 경구투여 하였다. 시료채취는 경구투여 후 1일부터 7일까지는 매일 하였으며, 그 이후는 7일간격으로 총 77일까지 3마리씩 시료를 채취하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
- 약욕처리구는 Oxytetracycline-HCl 표준품(Sigma)으로 1톤당 25 g의 농도로 1시간 1회실시 하였고, 시료채취는 약욕 직후부터 약욕 후 6일까지는 매일 하였다. 그 이후는 6일간격으로 총 54일까지 3마리씩 시료를 채취하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 경구투여구는 Oxytetracyclin-HCl 표준품(Sigma)으로 OTC의 투여농도를 어체중 kg 당 62.
- 5 mg의 양을 사료에 혼합시켜 7일간 경구 투여한 경구투여구로 구분하여 실험하였다. 그리고 미생물학적 간이검사법을 이용하여 넙치 피부, 근육에 대한 잔류특성을 분석하였고 HPLC 정량분석법을 이용하여 넙치 피부, 근육, 간의 잔류특성을 분석하였다. 미생물학적 간이검사에 의한 분석결과는 약욕처리구의 피부에서는 약욕 직후에서만 B.
- 검사용 평판에 놓았다. 근육은 시료 3마리의 근육을 15 g씩 동량 채취하여 호모기나이저로 균질화한 후 사방 1 cm 정도의 모양으로 검사용 평판에 놓았다. 이것을 약 1시간 냉장으로 방치한 후 페트리접시를 도치하지 않고 B.
- 넙치(Paralichthlys olivaceus)는 항생제 투여치료를 받은 경력이 없는 건강한 어체를 고르게 선별하여 약욕처리구, 경구투여구 각각 45마리, 51마리를 두 개의 유수식 수조에서 3주간 순치시켰으며, 평균 체중은 112±17 g이었고 실험 기간 동안의 수온은 21±0.5℃이었으며, 매일 1회 평균 체중의 1%씩 사료를 급이 하였다.
- 0 ppm 농도로 spiking하여 시료의 OTC 추출방법에 따라 추출 및 정제한 후, HPLC에 주입하여 표준곡선과 Retention time을 비교하여 정성 확인한 후, 해당 peak의 면적 값을 표준용액의 직선회귀방정식에 대입하여 농도를 구한 후, 시료에 첨가 된 OTC의 농도와 회수 된 OTC의 농도로 나누고 100을 곱하여 회수율을 구하였다. 또한 시료에서의 잔류농도계산은 시료를 정제하고 HPLC에 주입하여 표준용액과 동일한 Retention time에 있는 peak의 면적 값을 표준물질의 회귀방정식에 대입하여 농도를 구한 다음 시료량으로 나눠주고 회수율을 보정하여 잔류농도를 구하였다.
- 시료 3마리의 각각 피부에 점액질을 완전히 제거한 후 채취하여 3 g씩 동량혼합 가능한 무균적으로 사방 1 cm 정도로 잘라 검사용 평판에 놓았다. 근육은 시료 3마리의 근육을 15 g씩 동량 채취하여 호모기나이저로 균질화한 후 사방 1 cm 정도의 모양으로 검사용 평판에 놓았다.
- 시료 3마리의 피부와 간은 각각 1 g씩 정확히 달아 호모기나이저로 균질화 한 후 혼합하여 총 3 g을 실험에 사용하였고, 근육은 시료 3마리 각각 15 g씩 정확히 달아 호모기나이저로균질화 한 후 총 10 g을 사용하였다. 피부, 간, 근육의 시료들을 각각 50 ml Conical tube에 취해 1% EDTA용액 10 ml, 10% Trichlroroaceticacid (TCA)용액 10 ml를 가하여 균질기로 2분간 균질화 하였다.
- 0 ppm의 농도로 하여 농도 대 peak 면적비를 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 시료에 대한 회수율은 근육에 1.0 ppm 농도로 spiking하여 시료의 OTC 추출방법에 따라 추출 및 정제한 후, HPLC에 주입하여 표준곡선과 Retention time을 비교하여 정성 확인한 후, 해당 peak의 면적 값을 표준용액의 직선회귀방정식에 대입하여 농도를 구한 후, 시료에 첨가 된 OTC의 농도와 회수 된 OTC의 농도로 나누고 100을 곱하여 회수율을 구하였다. 또한 시료에서의 잔류농도계산은 시료를 정제하고 HPLC에 주입하여 표준용액과 동일한 Retention time에 있는 peak의 면적 값을 표준물질의 회귀방정식에 대입하여 농도를 구한 다음 시료량으로 나눠주고 회수율을 보정하여 잔류농도를 구하였다.
- 5 mg의 양을 사료에 혼합시켜 7일간 경구투여 하였다. 시료채취는 경구투여 후 1일부터 7일까지는 매일 하였으며, 그 이후는 7일간격으로 총 77일까지 3마리씩 시료를 채취하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 실험기간 동안 폐사한 실험어는 출현되지 않았다.
- 카트리지에 흡착된 성분은 메탄올 40 ml를 흘려 용출시키고, 용출액은 다시 감압 하에서 농축기로 건조시켰다. 시험액이 건조된 수기에 이동상(0.01 M Oxalic acid : Acetonitrille : Methanol = 9:2:1) 2 ml를 가하여 초음파세척기로 녹이고 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 후 HPLC로 분석하였다. 시료의 전처리 과정에 대한 요약은 Fig.
- 시험할 때마다 스트렙토마이신 감수성 디스크(10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인하였다. 즉, B.
- 약욕처리구는 Oxytetracycline-HCl 표준품(Sigma)으로 1톤당 25 g의 농도로 1시간 1회실시 하였고, 시료채취는 약욕 직후부터 약욕 후 6일까지는 매일 하였다. 그 이후는 6일간격으로 총 54일까지 3마리씩 시료를 채취하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
- 약제 투여방법에 따른 넙치 피부, 근육, 간의 잔류 분석을 위하여 약욕처리구와 경구처리구로 구분하였다. 약욕처리구는 Oxytetracycline-HCl 표준품(Sigma)으로 1톤당 25 g의 농도로 1시간 1회실시 하였고, 시료채취는 약욕 직후부터 약욕 후 6일까지는 매일 하였다.
- 표준용액은 OTC-HCl (Sigma)를 정확히 달아 메탄올로 용해시켜 100 ppm의 표준 원액을 조제하였고 이 용액을 이동상으로 희석하여 0.1, 1.0 ppm의 농도로 하여 농도 대 peak 면적비를 이용하여 표준곡선을 작성하였다. 시료에 대한 회수율은 근육에 1.
- 한 후 총 10 g을 사용하였다. 피부, 간, 근육의 시료들을 각각 50 ml Conical tube에 취해 1% EDTA용액 10 ml, 10% Trichlroroaceticacid (TCA)용액 10 ml를 가하여 균질기로 2분간 균질화 하였다. 이 액을 4, 000 rpm으로 3분간 원심분리 후상 등 액을 다른 50 ml Conical tube에 취하고 다시 1% EDTA 용액 10 ml, 10% TCA용액 10 ml를 가하여 균질기로 2분간 균질화 한 후 4, 500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 전에 추출된 상등액이 들어있는 50 ml Conical tube에 합하여 다시 4, 500 rpm으로 15분간 원심 분리하여 다른 50 ml Conical tube 에 취하였다.
대상 데이터
- OTC의 잔류에 대한 정량의 분석을 위해 HPLC (SHISEIDO, Japan)를 사용하였으며 실험에서 사용된 항생제 표준품은 Oxytetracycline-HCl (Sigma)제품을 사용하였으며 시료중의 항생제 추출에는 acetonitrille, methanol (Merck), Oxalic acid, EDTA, Trichloroacetic acid (Sigma) 등을 사용하였고 이외의 시험 용액 및 시약 등도 이들과 동등한 규격품을 사용하였다.
- TMP (Trimethoprim) 용액은 TMP 10 mg을 용량 플라스크에 달아 메탄올 10 ml에 녹이고 멸균증류수를 넣어 100 ml로 한 후 15 μg/ml 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제 시 사용하였다.
- 이들과 동등한 규격품을 사용하였다. 배지는 계대 및 증균용으로 nutrient agar, 아포제조용으로 A-K #2 sporulating, 시험용 배지로는 Mueller-Hinton agar, Antibiotic medium #2, Antibiotic medium #5, Antibiotic medium #8를 사용하였다. 시험용 균주는 Bacillus megaterium KCTC 2178, Bacillus subtillis KCTC 1022, Bacillus cereus KCTC 1012, Bacillus sterar- othermophilus KCTC 3067을 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양 받았다.
- 배지는 계대 및 증균용으로 nutrient agar, 아포제조용으로 A-K #2 sporulating, 시험용 배지로는 Mueller-Hinton agar, Antibiotic medium #2, Antibiotic medium #5, Antibiotic medium #8를 사용하였다. 시험용 균주는 Bacillus megaterium KCTC 2178, Bacillus subtillis KCTC 1022, Bacillus cereus KCTC 1012, Bacillus sterar- othermophilus KCTC 3067을 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양 받았다.
- 각 시험용 평판의 감도를 확인하였다. 즉, B. mega-terium, B. cereus, B. subtilis 및 B. stearothermophilus 평판에서 스트렙토마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각 20 mm 이상 되는 평판을 사용하였다.
- 항생제 표준품 OTC-HCl을 사용하였으며, Trimethoprim (TMP)은 Fluka 제품을 사용하였고, 이외의 시험 용액 및 시약등도 이들과 동등한 규격품을 사용하였다. 배지는 계대 및 증균용으로 nutrient agar, 아포제조용으로 A-K #2 sporulating, 시험용 배지로는 Mueller-Hinton agar, Antibiotic medium #2, Antibiotic medium #5, Antibiotic medium #8를 사용하였다.
성능/효과
- OTC 표준용액을 0.1, 1.0 mg/l의 농도로 희석하여 HPLC로 분석하였는데 Retention time은 5.08 분으로 조사되었고 농도에 따른 peak 면적 비를 이용하여 표준곡선을 작성한 결과 OTC의 r2은 0.999으로 양호한 직선성(r2>0.995)을 나타내었다.
- 근육에서는 약욕 직후부터 검출한계농도 이하로 관찰되었다. 간에서는 약욕직후 0.09 mg/kg의 농도를 보인 후 지속적으로 증가경향을 보이다가 4일째에 최고농도인 0.25 mg/kg까지 보이다가 점차 감소하여 5일째부터는 0.18 mg/kg으로 어류에서의 OTC 잔류허용기준 이하로 측정되었으며, 약욕 후 19일째부터는 농도가 검출한계농도 이하로 관찰되었다.
- 42 mg/kg이었다. 경구투여구 근육시료에서는 B. stearothermophillus 평판에서 경구투여 후 6일째까지 양성반응을 보였는데 이때의 정량분석결과는 0.304 mg/ kg, B. mega- terium 평판과 B. subtilis 평판에서는 경구투여 후 4일째까지 양성반응을 보였는데 이때의 정량분석결과는 0.73 mg/kg, B. cereus 평판에서는 경구투여 후 14일째까지 양성반응을 보였는데 이때의 정량분석결과는 0.13 mg/kg이었다. 피부보다 근육에서 낮은 농도에서 양성을 보였는데 이는 피부와 근육을 같은 크기로 평판에 올려 놓았지만 피부와 근육의 조직량이 다르기 때문에 이러한 결과를 나았다고 생각되나 피부에서의 잔류농도가 높기 때문에 미생물학적 간이 시험법으로 항생제 잔류검사를 해야 할 때는 피부와 근육을 같이 병행실험을 해야 될 것이라고 사료된다.
- 25 mg/kg으로 측정된 후 점차 감소하기 시작하여 약욕 후 5일째에 OTC의 잔류허용기준치 이하도 측정되었으며 약욕 후 13일째가 되어서 검출한계농도 이하로 측정되었다. 경구투여구에서 피부에서의 OTC 의 잔류경향은 경구 투여 후 1일째부터 3.28 mg/kg의 높은 농도로 측정되었으며 점차 감소하기 시작하여 미생물학적 간이검사에서는 양성반응이 나타났던 시험종료일인 경구 투여 후 77일째도 1.07 mg/kg의 농도로 측정되었다. 근육에서는 경구 투여 후 1일째에 0.
- stearothermophillus 평판에서 양성을 보였고 근육에서는 모든 균주의 평판에서 음성으로 조사되었다. 경구투여구피부에서는 B. stearothermophillus 평판에서 경구 투여 후 77일째, B. megaterium 평판과 B. subtilis 평판에서 경구 투여 후 7일째, B.cereus 평판에서 경구 투여 후 28일째까지 양성을 보였다. 근육에서는 B.
- 07 mg/kg의 농도로 측정되었다. 근육에서는 경구 투여 후 1일째에 0.83 mg/kg의 농도를 보인 후 점차 감소하기 시작하여 경구 투여 후 14일째에 OTC의 잔류허용기준치 이하인 0.13 mg/kg의 농도가 측정되었으며 경구 투여 후 42일째에 검출한계농도 이하로 측정되었고, 간에서는 경구 투여 후 1일째의 농도가 1.91 mg/kg로 측정된 후 점차 감소하기 시작하여 경구 투여 후 21일째에 OTC의 잔류허용기준치 이하인 0.17 mg/kg의 농도가 측정되었으며 시험종료일인 경구 투여 후 77일째에도 0.06 mg/kg의 농도가 측정되었다. 미생물학적 간이검사법과 HPLC를 이용한 정량분석법간의 결과를 비교해 볼 때 약욕처리구의 피부시료인 경우 약욕직후 B.
- 06 mg/kg의 농도가 측정되었다. 미생물학적 간이검사법과 HPLC를 이용한 정량분석법간의 결과를 비교해 볼 때 약욕처리구의 피부시료인 경우 약욕직후 B. stear- othermophillus 평판에서만 양성을 보였는데 이때의 정량분석 결과는 0.51 mg/kg이었고, 경구투여구 피부시료인 경우 B. stearothermophillus 평판에서 경구투여 후 77일째까지 양성을 보였는데 이때의 정량분석결과는 1.07 mg/kg, B. megaterium 평판과 B. subtilis 평판에서는 경구투여 후 7일째까지 양성을 보였는데 이때의 정량분석결과는 2.54 mg/kg, B. cereus 평판에서는 경구투여 후 28일째까지 양성을 보였는데 이때의 정량분석 결과는 2.42 mg/kg이었다. 경구투여구 근육시료에서는 B.
- 그리고 미생물학적 간이검사법을 이용하여 넙치 피부, 근육에 대한 잔류특성을 분석하였고 HPLC 정량분석법을 이용하여 넙치 피부, 근육, 간의 잔류특성을 분석하였다. 미생물학적 간이검사에 의한 분석결과는 약욕처리구의 피부에서는 약욕 직후에서만 B. stearothermophillus 평판에서 양성을 보였고 근육에서는 모든 균주의 평판에서 음성으로 조사되었다. 경구투여구피부에서는 B.
- 시료에 대한 회수율은 OTC의 표준용액을 넙치의 근육에 1.0 mg/kg의 농도로 spiking하여 앞서 기술한 방법에 따라 전처리한 후, HPLC로 측정한 결과이며 Table 5에서와 같이 약욕처리구는 평균 80.43%, 경구투여구는 평균 76.71%의 회수율을 보였다.
- 3에 나타내었다. 피부에서는 약욕직후 0.51 mg/kg의 농도를 보인 후 지속적으로 감소경향을 보이며 약욕후 24일째부터는 0.16 mg/kg으로 어류에서의 OTC 잔류허용기준(0.2 mg/kg) 이하로 측정되었으며 약욕후 48일째부터는 농도가 검출한계농도이하(0.05 mg/kg)로 관찰되었다. 근육에서는 약욕 직후부터 검출한계농도 이하로 관찰되었다.
후속연구
- 것에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다. 본 연구를 통하여 OTC의 투여경로별 어체의 조직별 잔류특성을 조사함으로써 향후, 양식어류에 사용 되고 있는 다양한 항생제들에 대해 조직 내 잔류분포 연구를 촉진하고 항생제의 효율적인 사용을 통한 잔류 및 내성균의 출현을 방지하는데 기초 자료로 활용될 것을 기대한다.
- 본 연구에서 다소 미흡한 점은 경구투여구에서 OTC의 휴약기간이 40일이라 거기에 준하여 실험어를 준비하였더니 근육 부위를 제외한 피부와 간에서 OTC가 77일 이상 오래도록 잔류함으로써 실험어가 부족하여 OTC의 소멸시점을 알아내지 못하였는데 차후 추가실험을 하여 알아 내고자 하고 피부인 경우 다른 부위 보다 월등히 높은 OTC 농도를 보였는데 이 것에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다. 본 연구를 통하여 OTC의 투여경로별 어체의 조직별 잔류특성을 조사함으로써 향후, 양식어류에 사용 되고 있는 다양한 항생제들에 대해 조직 내 잔류분포 연구를 촉진하고 항생제의 효율적인 사용을 통한 잔류 및 내성균의 출현을 방지하는데 기초 자료로 활용될 것을 기대한다.
- 13 mg/kg이었다. 피부보다 근육에서 낮은 농도에서 양성을 보였는데 이는 피부와 근육을 같은 크기로 평판에 올려 놓았지만 피부와 근육의 조직량이 다르기 때문에 이러한 결과를 나았다고 생각되나 피부에서의 잔류농도가 높기 때문에 미생물학적 간이 시험법으로 항생제 잔류검사를 해야 할 때는 피부와 근육을 같이 병행실험을 해야 될 것이라고 사료된다. 그리고 시판 중인 육류중의 항생물질 잔류량과 가열에 의한 분해[1]에 관한 연구와 시판 중인 뱀장어 중의 oxolinic acid 잔류량과 가열에 의한 변화[6]에 보고 된바, 활넙치 근육 및 부산물에 잔류하는 OTC의 잔류량도 조리 온도에 따라 감소할 것으로 추측 된다.
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