[국내논문]Casein phosphopeptide를 생산하는 김치 유래 유산균의 분리 및 특성 연구 Isolation and Characteristics of Lactic Acid Bacteria Producing Casein Phosphopeptides from Kimchi원문보기
본 연구에서는 전국 가정집에서 제조한 김치로부터 분리한 유산균들 중에서 protease 활성 및 CPP 생산 능력이 가장 높은 균주인 strain 0301을 동정하였고 해당 균주의 특성과 CPP 생산 최적 조건을 조사하였다. 0301은 $0.6-0.8{\mu}m$ 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다. E. faecalis MG-379 균주를 2% fructose를 첨가하고 pH 6.0인 배지에서 37oC에서 36시간 배양하였을 때 CPP 생산 능력이 최대였으며, ICP를 이용하여 측정한 결과 2227.5 mg/kg으로, 비교 균주인 Enterococcus faecalis KCCM 40450에 비해 약 2배 가량 높은 CPP 생산 능력을 갖는 것으로 나타내었다.
본 연구에서는 전국 가정집에서 제조한 김치로부터 분리한 유산균들 중에서 protease 활성 및 CPP 생산 능력이 가장 높은 균주인 strain 0301을 동정하였고 해당 균주의 특성과 CPP 생산 최적 조건을 조사하였다. 0301은 $0.6-0.8{\mu}m$ 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다. E. faecalis MG-379 균주를 2% fructose를 첨가하고 pH 6.0인 배지에서 37oC에서 36시간 배양하였을 때 CPP 생산 능력이 최대였으며, ICP를 이용하여 측정한 결과 2227.5 mg/kg으로, 비교 균주인 Enterococcus faecalis KCCM 40450에 비해 약 2배 가량 높은 CPP 생산 능력을 갖는 것으로 나타내었다.
Lactic acid bacteria showing both protease activity and the capacity to produce casein phosphopeptide (CPP) were isolated from Korean kimchi, a traditional food made from fermented vegetables. Among the 450 strains of isolated lactic acid bacteria, the strain MG-379 showed high protease activity and...
Lactic acid bacteria showing both protease activity and the capacity to produce casein phosphopeptide (CPP) were isolated from Korean kimchi, a traditional food made from fermented vegetables. Among the 450 strains of isolated lactic acid bacteria, the strain MG-379 showed high protease activity and the highest ability to produce CPP. Characterization results showed that MG-379 was gram-positive and measured $0.6-0.8{\mu}m$ in diameter. DNA sequencing of MG-379 and comparison with other sequences using BLAST revealed a 100% identity with the sequence of Enterococcus faecalis. However, MG-379 showed a higher CPP-producing ability than E. faecalis KCCM 40450. Accordingly, MG-379 was newly named as E. faecalis MG-379. Amount of free calcium liberated by CPPs was 2227.5 and 1151.6 mg/kg for E. faecalis MG-379 and E. faecalis KCCM (control), respectively.
Lactic acid bacteria showing both protease activity and the capacity to produce casein phosphopeptide (CPP) were isolated from Korean kimchi, a traditional food made from fermented vegetables. Among the 450 strains of isolated lactic acid bacteria, the strain MG-379 showed high protease activity and the highest ability to produce CPP. Characterization results showed that MG-379 was gram-positive and measured $0.6-0.8{\mu}m$ in diameter. DNA sequencing of MG-379 and comparison with other sequences using BLAST revealed a 100% identity with the sequence of Enterococcus faecalis. However, MG-379 showed a higher CPP-producing ability than E. faecalis KCCM 40450. Accordingly, MG-379 was newly named as E. faecalis MG-379. Amount of free calcium liberated by CPPs was 2227.5 and 1151.6 mg/kg for E. faecalis MG-379 and E. faecalis KCCM (control), respectively.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서는 김치로부터 protease 및 CPP의 생산 능력이 높은 유산균을 분리 동정하였고 CPP의 생산 조건과 특성을 조사하였다.
본 연구에서는 전국 가정집에서 제조한 김치로부터 분리한 유산균들 중에서 protease 활성 및 CPP 생산 능력이 가장 높은 균주인 strain 0301을 동정하였고 해당 균주의 특성과 CPP 생산 최적 조건을 조사하였다. 0301은 0.
제안 방법
여과된 용액을 60−80oC로 가열하여 0.02 N 과망간산칼륨 용액으로 색이 무색에서 적색이 될 때까지 적정하였다.
1차 선별 균주에 대해서 2.0% skim milk가 첨가된 MRS 배지에서 protease 활성을 지녀 clear zone을 형성하는 균주를 2차로 선별한 후, azocasein(Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)을 사용하여 단백질 분해 효소 활성을 측정하였다[2]. 2차 선별 균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 48시간 정치 배양한 다음 원심 분리하여 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
, Tokyo, Japan)하에서 형태학적 특성을 관찰하였다. 또한 Gram 염색, 3% KOH 실험, catalase 실험 및 API CHL 50 kit와 API 20 strep kit(bioMerieux Ltd, France)를 이용하여 균주의 생화학적 특성을 분석하였다.
16S rDNA 유전자 염기서열 분석
분리 균주의 분자생물학적인 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 균주의 염색체 DNA를 추출한 후 7F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'- GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다[18].
균주의 염색체 DNA를 추출한 후 7F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'- GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다[18]. 증폭된 DNA 염기서열은 DNA Analyzer(ABI PRISM 3730, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 분석하였다. 분석한 염기서열은 BLAST 프로그램을 통해서 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였다[26].
또한 탄소원 및 질소원 종류에 따른 CPP 생산 최적 조건을 확인하였다. 탄소원으로는 maltose, lactose, sucrose, fructose, xylose, galactose를 각각 2% 첨가하였으며, 질소원으로는 proteose peptone, beef extract, yeast extract를 각각 2% 첨가하였다.
고주파 유도 결함 플라스마(Inductively Coupled Plasma, ICP)를 이용한 발광 분석법을 이용해 동결 건조된 CPP의 칼슘 유리화 능력을 확인하였다.
CPP와 칼슘의 결합 능력을 통해 칼슘 함량을 측정하여 CPP 함량을 간접적으로 보았으며, 과망간산칼륨을 이용한 적정법과 ICP를 사용한 분석법을 통해 이를 확인하였다. Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다.
CPP와 칼슘의 결합 능력을 통해 칼슘 함량을 측정하여 CPP 함량을 간접적으로 보았으며, 과망간산칼륨을 이용한 적정법과 ICP를 사용한 분석법을 통해 이를 확인하였다. Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다. 과망간산칼륨을 통한 적정법을 이용하여 유리 칼슘 함량을 측정한 결과, Fig.
CPP 생산 활성 테스트를 통해 0301 균주가 다른 균주들과 비교하여 CPP의 생산 능력이 뛰어난 것을 확인할 수 있 었다. 따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 0301 균주는 Gram 양성 세균이며, KOH와 catalase test에서 각각 음성을 나타내었다.
최종적으로 선별된 Enterococcus faecails MG-379 균주의 CPP 생산 최적 조건을 설정하기 위해 배양 시간 및 온도, 배양 배지의 초기 pH, 탄소원 및 질소원 종류에 따른 균주의 생육도와 그에 따른 CPP 생산 능력을 알아보았다.
주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) [S-4300, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)하에서 형태학적 특성을 관찰하였다. 또한 Gram 염색, 3% KOH 실험, catalase 실험 및 API CHL 50 kit와 API 20 strep kit(bioMerieux Ltd, France)를 이용하여 균주의 생화학적 특성을 분석하였다.
데이터처리
증폭된 DNA 염기서열은 DNA Analyzer(ABI PRISM 3730, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 분석하였다. 분석한 염기서열은 BLAST 프로그램을 통해서 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였다[26].
이론/모형
동결건조 된 CPP의 칼슘 유리화 능력 확인을 위해 식품공전[17]에 준하는 과망간산칼륨(potassium permanganate, KMnO4) 적정법을 통해 칼슘 함량을 측정하였다. 증류수 25 ml에 동결건조된 CPP를 녹인 후 10 mM calcium chloride solution 25 ml와 20 mM sodium-phosphate buffer(pH 7.
성능/효과
여러 배양조건을 달리하여 CPP 생산의 최적 조건을 확인하였다. 시간은 0−60시간, 온도는 25−50℃, 초기 pH는 3.
0에서 배양 조건을 확인하였다. 또한 탄소원 및 질소원 종류에 따른 CPP 생산 최적 조건을 확인하였다. 탄소원으로는 maltose, lactose, sucrose, fructose, xylose, galactose를 각각 2% 첨가하였으며, 질소원으로는 proteose peptone, beef extract, yeast extract를 각각 2% 첨가하였다.
분리된 균주들을 2% skim milk가 첨가된 MRS 배지에서 배양한 결과 250주의 colony 주변에서 clear zone을 나타내었다. Clear zone을 형성한 균주들을 각각 배양하여 그 상등액의 protease 활성을 측정한 결과, 활성이 상대적으로 높은 9 균주를 선별할 수 있었다.
Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다. 과망간산칼륨을 통한 적정법을 이용하여 유리 칼슘 함량을 측정한 결과, Fig. 1에서 보이는 것처럼 다른 균주들과 비교하였을 때 0301 균주가 유리 칼슘 함량이 약 2배 가량 높은 것으로 확인되었다. 또한 ICP를 이용해서 칼슘 함량을 비교한 결과, 대조군인 KCCM 40450 균주의 경우 칼슘 함량이 1151.
1에서 보이는 것처럼 다른 균주들과 비교하였을 때 0301 균주가 유리 칼슘 함량이 약 2배 가량 높은 것으로 확인되었다. 또한 ICP를 이용해서 칼슘 함량을 비교한 결과, 대조군인 KCCM 40450 균주의 경우 칼슘 함량이 1151.6 mg/kg 인 것에 비해 0301 균주의 경우는 2227.5 mg/kg으로 측정된 것을 Fig. 2를 통해 확인할 수 있다.
주사전자현미경(SEM)을 이용해 세포를 관찰한 결과, 구균의 형태를 나타내며 크기는 0.6−0.8 μm로 측정되었다(Fig. 3).
배양 배지의 초기 pH에 따른 영향을 확인한 결과, pH 5.0−9.0까지 pH가 높아짐에 따라 균체의 생육이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, CPP의 생산은 pH 6.0에서 가장 높은 것으로 나타내었다.
균체의 생육은 배양한 지 24시간이 지났을 때 최대 생육을 띄었으며, 배양 온도에 따른 생육 정도를 확인한 결과 25−40oC 사이에서는 차이가 나타나지 않았으나 40℃ 이상의 온도에서는 생육이 급격히 감소하기 시작하였다.
CPP 생산 활성 테스트를 통해 0301 균주가 다른 균주들과 비교하여 CPP의 생산 능력이 뛰어난 것을 확인할 수 있 었다. 따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다.
따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 0301 균주는 Gram 양성 세균이며, KOH와 catalase test에서 각각 음성을 나타내었다. 주사전자현미경(SEM)을 이용해 세포를 관찰한 결과, 구균의 형태를 나타내며 크기는 0.
3). API kit를 통해 당 이용성을 분석한 결과, CHL 50 kit에서는 glycerol, ribose, galactose, glucose, mannose 등의 당을 이용하는 것으로 확인되었다. 또한 20 strep kit 로 분석한 결과, sodium pyrubate, esculin ferric citrate, pyroglutamic acid β-naphtlylamide 등에 양성 반응을 나타냄으로써 Enterococcus sp.
로 동정되었다. 보다 정확한 동정을 위해 16S rDNA sequence로 분석한 결과, Enterococcus faecails이 가장 유사성이 높은 것으로 확인되었다(Fig. 4). 따라서 분석 결과를 토대로 0301 균주를 Enterococcus faecails MG-379로 동정 명명하였다.
4). 따라서 분석 결과를 토대로 0301 균주를 Enterococcus faecails MG-379로 동정 명명하였다.
0에서 가장 높은 것으로 나타내었다. 탄소원으로 maltose를 첨가하였을때 생육이 가장 높은 것으로 보였으며 lacose나 xylose를 첨가하였을 때는 생육이 낮은 것으로 확인되었다. CPP 생산능력은 탄소원으로 fructose를 이용하였을 대 최대를 나타내었다(Fig.
5). 질소원에 따른 영향을 확인한 결과 beef extract 를 첨가하였을 때 가장 높은 생육과 CPP 생산 능력을 나타내었다(Fig. 6).
0301은 0.6−0.8 μm 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다.
이상의 결과로부터 Enterococcus faecails MG-379를 탄소원으로 2% fructose를 첨가한 배양 배지의 pH를 6.0으로 하여 37℃에서 36시간 동안 균주를 배양하였을 때 CPP 생산에 최적인 조건이 되는 것으로 확립하였다.
8 μm 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다. E. faecalis MG-379 균주를 2% fructose를 첨가하고 pH 6.0인 배지에서 37℃에서 36시간 배양하였을 때 CPP 생산 능력이 최대였으며, ICP를 이용하여 측정한 결과 2227.5 mg/kg으로, 비교 균주인 Enterococcus faecalis KCCM 40450에 비해 약 2배 가량 높은 CPP 생산 능력을 갖는 것으로 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Casein phosphopeptide는 어떤 특징을 갖는가?
칼슘 섭취량을 높이기 위해서는 많은 양을 먹는 것보다 칼슘의 체내 이용도가 높아야 한다[9]. Casein phosphopeptide (CPP)는 칼슘 흡수를 촉진하는 물질로서 칼슘의 체내 이용률을 높인다고 알려져 있다[22]. Casein의 가수분해 반응에 의해 생성된 CPP는 체내 소화 효소 등에 의해 쉽게 반응하지 않는다고 알려져 있으며[24], 칼슘 이온이 침전되기 전에 이와 결합하여 가용화 상태를 유지시켜 칼슘이 소장에서 체내로 흡수되는 것을 촉진시킨다.
칼슘 부족은 어떤 질병의 원인인가?
칼슘 부족은 뼈 성장 부진, 골절, 골다공증[13], 고 콜레스테롤증, 동맥경화, 고혈압, 고지혈증[29] 등 다양한 질병의 원인이지만 2012년도 국민 건강조사에 따르면 한국인들의 칼슘 섭취량은 평균의 70.1%로 매우 낮은 것으로 조사되었다[3].
0301 균주의 당 이용성을 분석한 결과는 어떠한가?
3). API kit를 통해 당 이용성을 분석한 결과, CHL 50 kit에서는 glycerol, ribose, galactose, glucose, mannose 등의 당을 이용하는 것으로 확인되었다. 또한 20 strep kit 로 분석한 결과, sodium pyrubate, esculin ferric citrate, pyroglutamic acid β-naphtlylamide 등에 양성 반응을 나타냄으로써 Enterococcus sp.
참고문헌 (29)
Bae JW, Rhee SK, Park JR, Chung WH, Nam YD, Lee I, et al. 2005. Development and evaluation of genomeprobing microarrays for monitoring lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol. 71: 8825?8835.
Beynon RJ, Bond JS. 1989. Proteolytic enzymes: A practical approach : Edited by Beynon RJ and Bond JS. Oxford University Press. 259.
Chae OH, Shin KS, Chung HW, Choe TB. 1998. Immunostimulation effects of mice fed with cell lysate of Lactobacillus plantarum isolaed fron kimchi. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 13: 424−430.
Cheigh HS, Park KY. 1994. Biochemical, microbiological, and nutritional aspects of kimchi [Korean fermented vegetable product). Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 34: 175−203.
Cho YH, Oh SJ. 2010. Casein Phosphopeptide (CPP)-producing activity and proteolytic ability by some lactic acid bacteria. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 30: 443−448.
Codex. 2001. Codex : alimentarius Commission Codex standard for kimchi. Codex stan 223.
Han JS, Suh BS. 1989. The effect of capsaicin on the components and sensory properties of kimchi during fermentation. Resour. Res. 8: 131−141.
Jang SY, Jeong YJ. 2013. Calcium ionization characteristics and in vitro bioavailability derived from natural calcium sources. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 42: 497?504.
Kim HS, Ham JS. 2003. Antioxidative ability of lactic acid bacteria. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 23: 186−192.
Kim JH, Oh MK, Rhee YH, Choi KC, Lee YK, Shin SY. 1999. Selection and physico-chemical characteristics of lactic acid bacteria which had cholesterol lowering activites. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 42: 83−90.
Kwon JY, Cheigh HS, Song YO. 2004. Weight reduction and lipid lowering effects of kimchi lactic acid powder in rats fed high fat diets. Korean J. Food Sci. Technol. 36: 1014−1019.
Lawrence GR, Smith JA. 1989. Pathogenesis, prevention and treatment of osteoporosis. Ann. Rev. Med. 40: 251−267.
Lee KE, Choi UH, Ji GE. 1996. Effect of kimchi intake on the composition of human large intestinal bacteria. Korean J. Food Sci. Technol. 28: 981−986.
Lee KS, Shin JY, Jang YH, Hweon DH, Park KM, Jin YS. 2008. Production of casein phosphopeptides using streptococcus faecalis var. liquefaciens cell immobilization. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 23: 59−64.
Lee SW, Hwangbo S, Yang HJ, Nam MS, Yu JH, Chung CI. 2002. Studies on the calcium phosphopeptide in milk casein. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 22: 55−58.
MFDS (Ministry of Food and Drug Safety). 2002. Korean Food Standards Codes(supplement). 304?306.
MFW. 1999. Ministry of Health and Welfare. 98 National Nutrition Survey Report.
Min SG, Kim JH, Kim TW, Kim KN. 2003. Isolation and identification of protease producing bacteria in kimchi. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 666−670.
Moon YJ, Baek KA, Sung CK. 2001. Characterization of biological from over ripened kimchi. Korean J. Food Nure. 14: 512−520.
Naito H. 1986. The mechanism of enhancement in intestinal calcium absorption with phosphopeptides derived during casein digestion. J. Jpn. Soc. Nutr. Food Sci. 39: 433−439.
Natio H, Kawakami A, Imamta T. 1972. In vivo formation of phosphopeptide with Ca-binding property in the small intestinal tract of the rat fed on casein. Agricult. Biological Chem. 36: 409−415.
Ryu JY, Lee HS, Rhee HS. 1984. Changes of organic acids and volatile flavor compounds in kimchi fermented with different ingredients. Korean J. Food Sci. Technol. 16: 16−174.
Shin KS, Chae OH, Park IC, Hong SI, Choe TB. 1998. Antitumor effects of mice fed with cell lysates of Lactobacillus plantarum isolated from kimchi. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 13: 357−363.
Shin DH, Kim MS, Han JS, Lim DK, Bak WS. 1996. Changes of chemical composition and microflora in commercial kimchi. Korean J. Food Sci. Technol. 28: 137−145.
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalies and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673−4680.
USA. 2008. Health magazine. Feb. 1.
Yoo HS, Park JK, Jung BJ, Noh SC, Choi IH, Jung HJ, et al. 2013. Potential risk assessment of cardiovascular disease in low calcium-score. J. Korean Soc. Radiol. 7: 369?376.
Yoon JH, Lee ST, Park YH. 1996. Inter-and intraspecific phylogenetic analysis of the genus Nocardioides and related taxa based on 16S rDNA sequences. Int. J. Syst. Bacteril. 48: 187−194.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.