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문제 정의
- 대부분 산업적으로 이용되고 있는 probiotics는 인간의 장관이나 유제품 등에서 분리한 동물유래 유산균이었으나, 최근 Pediococcus, Leuconostoc 속 등 식물유래 유산균이 probiotic 기능이 있다고 밝혀지고 있다(16). 본 연구는 위에서 언급한 다양한 기능성을 갖춘 미역과 다시마를 이용한 probiotic 식품을 개발하고자 우리나라 전통식품에서 probiotic 유산균을 분리하여 미역과 다시마에서 발효가능성을 검토하였다.
제안 방법
- NaCl 내성은 0.2% potassium phosphate(Duksan Pure Chemicals Co., Ansan, Korea) 용액에 NaCl을 0, 2, 4, 8, 16, 32%(w/v)의 농도로 첨가한 후 멸균하여 MRS broth (Difco Co.)에서 24시간 배양한 공시균주를 접종하고 37°C에서 4시간 배양한 다음 상기와 같은 방법으로 생균수를 측정하였다.
- Plate assay를 통하여 분해환이 큰 균주를 선별하고 modifyed-MRS broth[CMC or alginate 10 g, peptone 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 10 g, Tween 601 g, K2HP4 2 g, MgSO4･7H2O 0.2 g, MnSO4･4H2O 0.05 g, CH3COONa 5 g, (NH4)3C6H5O7 2 g/L]에 접종한 후 24시간 동안 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 성장을 비교하였다.
- pH는 pH meter(ORION 410A, Orion Research Inc., Boston, MA, USA)를 이용하여 측정하였고, 생균수는 발효 중 일정 시간별로 시료를 무균적으로 취한 후 0.1% peptone 수로 적정 희석하여 MRS agar에 접종하고 37°C에서 24시간 배양한 후 나타나는 colony 수로 나타내었다.
- 건조 미역(sea mustard) 및 다시마(sea tangle) 분말(40 mesh)을 1%가 되도록 증류수에 넣은 다음 121°C에서 15분간 멸균하여 식힌 후 alginate와 cellulose 분해능이 있고 probiotics의 기능을 나타내는 4균주를 각각 0.2% 농도로 접종한 후 37°C에서 72시간 배양하면서 발효특성 및 항산화 활성을 비교 측정하였다.
- 미역 분말과 증류수 혼합물(SME), 다시마 분말과 증류수 혼합물(STE)을 이용하여 선발 유산균 4균주를 각각 0.2% 접종하여 37°C에서 72시간 배양하면서 pH(Fig. 1)와 유산균수의 변화(Fig. 2), 환원당(Fig. 3)을 비교 검토하였다.
- 발효 중 일정 시간별로 시료를 취하여 pH와 생균수를 측정하였다. pH는 pH meter(ORION 410A, Orion Research Inc.
- 발효액 50 μL에 ABTS 용액 950 μL를 첨가하여 암소에서 10분간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하여 계산식 ABTS radical scavenging activity (%)＝100－[(OD of sample/ OD of control)×100]에 의하여 산출하였다.
- 분리균주의 인공담즙액 내성은 Lee와 No(20)의 방법으로 MRS broth(Difco Co.)에 pancreatin (Kanto Chemical, Tokyo, Japan) 1%를 첨가하여 멸균시킨 다음 멸균된 10% Oxgall(Difco Co.) 용액 1%를 첨가한 배지를 사용하였으며, 인공위액에서 3시간 배양한 후 원심 분리 하여 상등액을 제거한 균체를 접종하고 37°C에서 24시간 배양한 다음 생균수를 측정하였다.
- 407(OD600)로 가장 우수하였다(Table 1). 선발된 6균주는 해조 구성 다당인 cellulose와 alginate를 이용하여 성장할 수 있으므로 미역과 다시마를 이용한 발효에 스타터로 사용 가능할 것으로 판단되며, probiotic 기능을 검토하고자 항균 활성 및 생리적 특성을 측정하였다.
- 선발된 균주에 대한 항균 활성은 Listeria monocytogenes ATCC 19115, Staphylococcus aureus ATCC 2937, Bacillus cereus ATCC 14581, Pseudomonas fluorescens ATCC 21541, Salmonella enteritidis KCTC 12400, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802에 대해 paper disc method로 생육 억제환 생성 여부를 비교하여 측정하였다.
- 순수 분리한 유산균을 24시간 배양한 후 분리 유산균의 cellulose 분해능은 CMC 배지(CMC 10 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L), alginate 분해능은 alginate 배지(CMC 10 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L)에 점적하여 37°C에서 2~3일간 배양하였다(17,18).
- 인공위액 내성은 Kobayashi 등(19)의 방법에 따라 1 N HCl을 사용하여 pH 2.5로 조정한 nutrient broth(Difco Co.)에 pepsin 1%를 첨가하여 조제한 인공 위액에 선발 균주을 접종하여 37°C에서 3시간 배양한 다음, 0.1% peptone 수로 적정 희석하여 MRS agar(Difco Co.)에 접종하고 37°C에서 24시간 배양한 후 나타난 colony 수를 계측하여 생균수를 측정하였다.
- 최종 선별된 균주를 Gram 염색, spore 염색, catalase test, API 50 CHL kit(bioMérieux Co., Marcy L'Etoile, France)을 이용하여 간이 동정하였다.
- 해조류의 발효가 가능하고 probiotic 특성이 우수한 유산균을 분리 선발한 후 이들의 미역과 다시마 발효능을 검토하였다. 미역 및 다시마 발효가 가능한 균주를 김치 젓갈, 된장으로부터 331 균주를 순수 분리하여 해조류 구성 다당(alginate, cellulose) 분해능, 균의 생육, 항균 활성 등을 비교 검토한 결과 4균주(stain No.
- 효소 활성과 항균 활성이 뛰어난 균주를 동정하기 위해 Zhang 등(21)의 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1429R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 이용하여 RNA 를 증폭한 후 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하여(Solgent Co., Daejeon, Korea) 확인하였다.
대상 데이터
- 균주의 분리원은 대구 경북지역 각기 다른 가정에서 수집한 김치, 대구 근교 대형 마트에서 구입한 시판 젓갈, 대구지역의 시판 막걸리를 사용하였으며, 각 샘플을 직접 또는 적정 희석하여 0.02% sodium azide가 포함된 MRS Agar (Difco Co., Detroit, MI, USA)에 도말하고, 37°C에서 24시간 배양 후 나타난 특징적인 colony를 취하여 순수 분리하였다.
- 순수 분리한 유산균을 24시간 배양한 후 분리 유산균의 cellulose 분해능은 CMC 배지(CMC 10 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L), alginate 분해능은 alginate 배지(CMC 10 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L)에 점적하여 37°C에서 2~3일간 배양하였다(17,18). 배양된 균주는 0.1% Congo red 염색을 통한 plate assay를 거쳐 cellulase와 alginate lyase 활성 균주를 선발하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복으로 시행하였으며, 유의성 검증은 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package(version 19.0)를 이용, P<0.05 수준으로 Duncan's multiple range test에 의하여 검증하였다.
이론/모형
- ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid) diammonium salt; A9941, Sigma-Aldrich Co.] 라디칼 소거능은 ABTS radical cation decolorization assay(24)를 이용하여 측정하였다.
- 총폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법(23)에 따라 측정하였다. 즉 시료 1 mL에 0.
- 환원당 함량은 dinitrosalicylic acid(DNS)에 의한 비색법(22)으로 측정하였다. 각각의 추출물 1 mL에 DNS 시약 3 mL를 가하여 잘 교반한 후 끓는 물에서 5분간 반응시키고 냉각시켜 발색된 용액을 550 nm에서 흡광도를 측정하여 glucose를 표준물질로 한 표준곡선에 의하여 산출하였다.
성능/효과
- 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 미생물 동정 결과 (Table 5) No. 162, 192는 Gram positive, cocci, catalase negative였으며, 각각 Pediococcus pentosaceus(No. 162), Enterococcus faecium(No. 192)으로 동정되었다. No.
- 85μg/mL 증가하였다. ABTS 라디칼 소거능은 모든 공시균주로 발효한 후 SME와 STE에서 모두 증가하였다. SME의 경우 초기 25.
- 구강을 통하여 섭취되는 균은 강산성의 위산과 담즙산에서 살아남아 위액과 담즙을 분비하는 췌장 및 십이지장을 통과하여 최종 목적 부위인 장에 도달하여야 정장의 효과를 발휘하게 된다(26,27). Alginate와 cellulose 분해능이 있고 성장이 우수하며, 그람양성균과 그람음성균에 대한 항균활성을 나타낸 No. 162, 164, 192, 196 균주에 대해 인공위액과 인공담즙산염 내성을 측정한 결과(Table 3) 선발 균주 모두 인공위액에서 3시간 경과 후 7.85~8.58 log CFU/mL 범위를 나타내었으며, 인공 담즙에서 24시간 경과 후 6.58~7.81 log CFU/mL를 나타내어 생존율이 높았으며, 특히 No. 192 균주는 인공위액에서 3시간 경과 후 8.58 log CFU/ mL, 인공 담즙액에서 24시간 경과 후 7.81 log CFU/mL를 각각 나타내어 미역 및 다시마 발효용 스타터로 사용 가능할 것으로 판단되었다.
- 과다한 소금(NaCl) 섭취는 고혈압을 일으키는 중요한 위험인자로 지적되고 있으며(28), 고염섭취에 노출된 현대인의 식생활 환경에서 생균제로서의 기능을 발휘하기 위해서는 고농도의 염에 대한 내성이 있어야 한다. No. 162, 164, 192, 196 균주에 대해 NaCl 내성을 측정한 결과(Table 4) No. 192 균주는 32% NaCl을 포함한 용액에서도 배양 4시간 후 7.60 log CFU/mL의 우수한 생존율을 나타내어 고염 섭취에 노출된 현대인들의 장내 환경에서도 생존이 가능할 것으로 판단되었다.
- 갈조류 세포벽 구성다당류인 알긴산은 D-mannuronic acid와 L-guluronic acid가 여러 가지 비율로 β-1,4 결합한 polyuronide(25)로 다양한 생리활성을 나타낸다. 김치, 젓갈, 막걸리 등 한국 전통식품으로부터 분리한 유산균 331균주 중 alginate lyase와 cellulase 활성을 동시에 나타내는 균주는 31개 균주였으며, 이중 비교적 활성이 우수한 6균주에 대해 modified-MRS 배지를 이용하여 성장을 확인한 결과(No. 161, 162, 164, 192, 196) 5균주 모두 성장이 양호하였으며, No. 192 균주가 alginate-MRS 배지에서 1.160 (OD600), CMC-MRS 배지에서 1.407(OD600)로 가장 우수하였다(Table 1). 선발된 6균주는 해조 구성 다당인 cellulose와 alginate를 이용하여 성장할 수 있으므로 미역과 다시마를 이용한 발효에 스타터로 사용 가능할 것으로 판단되며, probiotic 기능을 검토하고자 항균 활성 및 생리적 특성을 측정하였다.
- 192 균주는 배양 초기부터 서서히 성장하여 배양 48시간째에 8 log CFU/mL 를 나타내어 스타터로 활용이 가능할 것으로 판단되었다. 다시마를 기질로 한 배양액(STE)에서 No. 162(P. pentosaceus)는 배양 초기부터 서서히 감소하여 배양 60시간 이후 6 log CFU/mL 이하를 나타내어 다시마를 기질로 한 배양액에서는 성장이 불가능한 것으로 판단되었다. 반면 No.
- plantarum) 균주는 서서히 성장하여 배양 24시간 이후 7 log CFU/mL 이상의 생균수를 나타내어 다시마를 기질로 한 배양액에서 스타터로 사용이 가능할 것으로 판단되었다. 또한, 발효과정중 환원당 함량을 측정한 결과 미역과 다시마는 초기 약 0.12 mg/mL에서 발효기간 경과에 따른 모든 실험구에서 환원당 함량이 증가하여 선발균주들은 미역과 다시마의 탄소원을 이용하여 성장하는 것으로 판단되었다. Gupta 등 (29)은 갈조류 발효 24시간 이후 L.
- 3)을 비교 검토하였다. 모든 공시균주는 미역과 다시마에서 배양 시간이 경과할수록 pH는 서서히 감소하였으며, 미역의 경우 No. 192 균주로 발효한 실험구에서 24시간 이후 pH 5.5 범위를 나타내었다. 발효균주와 해조류에 종류에 따라 pH 감소 정도는 달랐으나 모두 미역과 다시마 조성물에서 pH가 감소하는 것으로 보아 유산균의 성장에 기인한 것으로 판단되었다.
- 해조류의 발효가 가능하고 probiotic 특성이 우수한 유산균을 분리 선발한 후 이들의 미역과 다시마 발효능을 검토하였다. 미역 및 다시마 발효가 가능한 균주를 김치 젓갈, 된장으로부터 331 균주를 순수 분리하여 해조류 구성 다당(alginate, cellulose) 분해능, 균의 생육, 항균 활성 등을 비교 검토한 결과 4균주(stain No. 162, 164, 192, 196)가 우수하였다. 선발 균주 모두 인공위액, 인공담즙액, NaCl에 높은 생존율을 나타내었고 이들 4균주 중 No.
- 미역과 다시마 기질로 한 배양액에서 선발 유산균의 성장은 미역에서 발효 전 6 log CFU/mL에서 배양이 진행됨에 따라 증가하였다가 서서히 감소하는 경향을 나타내었다. 미역을 기질로 한 배양액(SME)에서는 배양 72시간 동안 No.
- 192가 가장 우수하였으며 Enterococcus faecium으로 동정되었다. 미역과 다시마를 이용하여 선발 유산균을 배양한 결과 No. 192 균주가 발효특성이 가장 양호하였으며, No. 162, 164, 196 균주도 양호하였다. 선발 유산균을 이용한 미역과 다시마에서 성장이 가능하였으며 발효 후 미역과 다시마 발효물의 항산화 활성이 증진되었다.
- 미역과 다시마 기질로 한 배양액에서 선발 유산균의 성장은 미역에서 발효 전 6 log CFU/mL에서 배양이 진행됨에 따라 증가하였다가 서서히 감소하는 경향을 나타내었다. 미역을 기질로 한 배양액(SME)에서는 배양 72시간 동안 No. 192(E. faecium)를 제외한 공시균주는 배양 초기의 6~7 log CFU/mL의 범위를 나타내었으나, No. 192 균주는 배양 초기부터 서서히 성장하여 배양 48시간째에 8 log CFU/mL 를 나타내어 스타터로 활용이 가능할 것으로 판단되었다. 다시마를 기질로 한 배양액(STE)에서 No.
- 5 범위를 나타내었다. 발효균주와 해조류에 종류에 따라 pH 감소 정도는 달랐으나 모두 미역과 다시마 조성물에서 pH가 감소하는 것으로 보아 유산균의 성장에 기인한 것으로 판단되었다.
- plantarum의 생균수가 감소하며, 이는 초기 당류의 양이 유산균의 성장에 중요하기 때문이라고 보고하였다. 본 연구에서도 이와 유사하게 미역과 다시마 단독 배양액에서 유산균의 왕성한 성장은 관찰되지 않았으나, 발효 3일 동안 초기 균수 이상의 성장 및 생존을 나타내어 분리 균주는 미역과 다시마를 이용한 유산 발효물 제조에 스타터로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 162, 164, 192, 196)가 우수하였다. 선발 균주 모두 인공위액, 인공담즙액, NaCl에 높은 생존율을 나타내었고 이들 4균주 중 No. 192가 가장 우수하였으며 Enterococcus faecium으로 동정되었다. 미역과 다시마를 이용하여 선발 유산균을 배양한 결과 No.
- 162, 164, 196 균주도 양호하였다. 선발 유산균을 이용한 미역과 다시마에서 성장이 가능하였으며 발효 후 미역과 다시마 발효물의 항산화 활성이 증진되었다.
후속연구
- faecium)은 병원성균에 대한 항균력, 위액과 담즙에 대한 내성 등의 특성뿐만 아니라 특히 미역과 다시마를 발효 시킬 수 있는 특성을 보유하고 있어 이를 이용한 기능성 식품 및 유산균제제의 소재로 활용이 가능할 것으로 판단된다. 미역 및 다시마 발효기질에 분리 유산균의 성장을 증진할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류를 보충한 최적의 발효조건에서는 더욱 왕성한 성장과 미역 및 다시마의 분해가 증가하여 생리활성이 증가할 수 있을 것으로 판단되므로 생균제로서 기능을 가진 이들 유산균의 대량생산을 위한 최적 배지 조성에 관한 연구가 보다 심도 있게 진행되어야 할 것이다.
- 녹조류와 홍조류보다 높은 생리활성을 나타내고 있는 갈조류(5)에는 alginic acid, fucoidan 및 laminaran 등의 다당류가 함유되어 있어 혈중 콜레스테롤 저하 효과(6), 항암 효과(7), 항혈액응고 효과(8) 및 혈압 강하 효과(9) 등이 있는 것으로 보고되었으며, 특히 갈조류의 주요 다당류 성분인 alginic acid는 장내 유해 미생물을 억제시키고 Bifidobacterium과 Lactobacillus의 증식을 촉진한다(10). 이러한 기능성을 함유한 갈조류 즉 미역과 다시마는 대부분 건조 등 단순 가공형태로 유통되어 그 활용성이 매우 낮은 실정이므로, 발효기법을 이용한 기능성 소재화를 통해 식품에 응용할 수 있다면 다양한 형태의 기능성 제품이 개발될 수 있을 것이다. 해조류의 가공에서 가장 문제가 되는 단단한 조체와 세포벽 충진 물질인 세포 간 유용성분을 추출하기 어려운 가공 문제(11)를 안고 있다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 분리 유산균(L. plantarum 및 E. faecium)은 병원성균에 대한 항균력, 위액과 담즙에 대한 내성 등의 특성뿐만 아니라 특히 미역과 다시마를 발효 시킬 수 있는 특성을 보유하고 있어 이를 이용한 기능성 식품 및 유산균제제의 소재로 활용이 가능할 것으로 판단된다. 미역 및 다시마 발효기질에 분리 유산균의 성장을 증진할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류를 보충한 최적의 발효조건에서는 더욱 왕성한 성장과 미역 및 다시마의 분해가 증가하여 생리활성이 증가할 수 있을 것으로 판단되므로 생균제로서 기능을 가진 이들 유산균의 대량생산을 위한 최적 배지 조성에 관한 연구가 보다 심도 있게 진행되어야 할 것이다.
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