이번 연구의 목적은 하이드록시아파타이트를 이용하여 블라스팅 처리한 뒤 양극산화 방법을 이용하여 하이드록시아파타이트와 이산화티탄이 복합된 표면을 만들고, 이에 대해 세포부착양상을 관찰하고 ALP 활성도와 칼슘 침착량을 측정함으로써 세포 분화능을 평가하여 표면의 생체적합성을 평가하는 데 있다. 이를 위해 실험을 진행한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 접촉각 분석 결과, 복합처리된 HA+100과 HA+MAO 150은 유의하게 낮은 접촉각을 나타내었다(p<0.05). 세포부착 관찰 결과 연마 처리한 SM 시편에서는 납작한 모양으로 세포가 붙어있는 모습을 관찰할 수 있었으나, 표면 처리된 실험군에서는 세포의 모양이 시편을 따라 좀 더 길게 뻗어 부착된 모습을 관찰할 수 있었다. ALP 활성도 측정 결과 HA+MAO 150과 HA+MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 높은 ALP 활성도를 나타내었다(p>0.05). 칼슘양 측정 결과 HA+MAO 150 과 HA+MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 많은 칼슘양을 나타내었다(p<0.05). 따라서 하이드록시아파타이트 이산화티탄이 복합 코팅된 표면은 높은 표면에너지를 가지며 우수한 세포활성도를 나타내어 치과용 임플란트 표면으로 유용하게 사용될 수 있을 것이라고 생각된다.
이번 연구의 목적은 하이드록시아파타이트를 이용하여 블라스팅 처리한 뒤 양극산화 방법을 이용하여 하이드록시아파타이트와 이산화티탄이 복합된 표면을 만들고, 이에 대해 세포부착양상을 관찰하고 ALP 활성도와 칼슘 침착량을 측정함으로써 세포 분화능을 평가하여 표면의 생체적합성을 평가하는 데 있다. 이를 위해 실험을 진행한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 접촉각 분석 결과, 복합처리된 HA+100과 HA+MAO 150은 유의하게 낮은 접촉각을 나타내었다(p<0.05). 세포부착 관찰 결과 연마 처리한 SM 시편에서는 납작한 모양으로 세포가 붙어있는 모습을 관찰할 수 있었으나, 표면 처리된 실험군에서는 세포의 모양이 시편을 따라 좀 더 길게 뻗어 부착된 모습을 관찰할 수 있었다. ALP 활성도 측정 결과 HA+MAO 150과 HA+MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 높은 ALP 활성도를 나타내었다(p>0.05). 칼슘양 측정 결과 HA+MAO 150 과 HA+MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 많은 칼슘양을 나타내었다(p<0.05). 따라서 하이드록시아파타이트 이산화티탄이 복합 코팅된 표면은 높은 표면에너지를 가지며 우수한 세포활성도를 나타내어 치과용 임플란트 표면으로 유용하게 사용될 수 있을 것이라고 생각된다.
The objective of this study was to fabricate hydroxyapatite (HA) containing titania layer by HA blasting and anodization method to obtain advantages of both methods and evaluated biocompatibility. To fabricate the HA containing titania layer on titanium, HA blasting treatment was performed followed ...
The objective of this study was to fabricate hydroxyapatite (HA) containing titania layer by HA blasting and anodization method to obtain advantages of both methods and evaluated biocompatibility. To fabricate the HA containing titania layer on titanium, HA blasting treatment was performed followed by microarc oxidation (MAO) using the electrolyte solution of 0.04 M ${\beta}$-glycerol phosphate disodium salt n-hydrate and 0.4 M calcium acetate n-hydrate on the condition of various applied voltages (100, 150, 200, 250 V) for 3 minutes. The experimental group was divided according to the surface treatment procedure: SM (simple machined polishing treatment), HA, MAO, HA+MAO 100, HA+MAO 150, HA+MAO 200, HA+MAO 250. The wettability of surface was observed by contact angle measurement. Biocompatibility was evaluated by cell adhesion, and cell differentiation including alkaline phosphatase activity and calcium concentration with MC3T3-E1 cells. The porous titanium oxide containing HA was formed at 150 and 200 V. These surfaces had a more hydrophilic characteristic. Biocompatibility was demonstrated that HA titania composite layer on titanium showed enhanced cell adhesion, and cell differentiation. Therefore, these results suggested that HA containing titania layer on titanium was improved biological properties that could be applied as material for dental implant system.
The objective of this study was to fabricate hydroxyapatite (HA) containing titania layer by HA blasting and anodization method to obtain advantages of both methods and evaluated biocompatibility. To fabricate the HA containing titania layer on titanium, HA blasting treatment was performed followed by microarc oxidation (MAO) using the electrolyte solution of 0.04 M ${\beta}$-glycerol phosphate disodium salt n-hydrate and 0.4 M calcium acetate n-hydrate on the condition of various applied voltages (100, 150, 200, 250 V) for 3 minutes. The experimental group was divided according to the surface treatment procedure: SM (simple machined polishing treatment), HA, MAO, HA+MAO 100, HA+MAO 150, HA+MAO 200, HA+MAO 250. The wettability of surface was observed by contact angle measurement. Biocompatibility was evaluated by cell adhesion, and cell differentiation including alkaline phosphatase activity and calcium concentration with MC3T3-E1 cells. The porous titanium oxide containing HA was formed at 150 and 200 V. These surfaces had a more hydrophilic characteristic. Biocompatibility was demonstrated that HA titania composite layer on titanium showed enhanced cell adhesion, and cell differentiation. Therefore, these results suggested that HA containing titania layer on titanium was improved biological properties that could be applied as material for dental implant system.
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문제 정의
따라서 이번 연구의 목적은 하이드록시아파타이트·이산화티탄 복합표면의 생체적합성을 평가하고자 세포의 부착 양상을 관찰하고 알카린포스파타제(alkaline phosphatase, ALP) 활성도와 칼슘양을 측정하여 세포의 분화능을 평가하는 데 있다.
이번 연구의 목적은 하이드록시아파타이트 블라스팅 처리 후 양극산화 처리하여 이 복합 표면층의 생체적합성을 생체 외(in vitro) 평가하는 데 있다.
이번 연구의 목적은 하이드록시아파타이트를 이용하여 블라스팅 처리한 뒤 양극산화 방법을 이용하여 하이드록시아파타이트와 이산화티탄이 복합된 표면을 만들고, 이에 대해 세포부착양상을 관찰하고 ALP 활성도와 칼슘 침착량을 측정함으로써 세포 분화능을 평가하여 표면의 생체적합성을 평가하는 데 있다. 이를 위해 실험을 진행한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
ALP 활성도(ALP activity)는 1, 2, 3주 동안 Alkaline Phosphate Assay Kit (QuantichromTM Alkaline Phosphate Assay Kit, DALP-250; Bioassay System, Hayward, CA, USA)를 사용하여 평가하였다. MC3T3-E1 세포를 1×104개/ ml의 농도로 희석하여 시편에 1 ml씩 분주하고, 37oC, 5% CO2 배양기(VS-9160C)에서 1주, 2주, 3주간 배양하였다.
Critical point dryer (CPD, HCP-2; Hitachi, Tokyo, Japan)에서 임계점 건조를 한 다음 시료의 전도성을 높이고 2차 전자를 많이 발산할 수 있도록 하기 위해서 Ion coater (Eiko IB-3; Eiko Engineering, Hitachinaka, Japan)를 이용하여 300 Å 두께로 코팅을 하였다.
Louis, MO, USA)용액으로 초음파 처리하여 세포를 분리하고 96-well로 옮겼다. ELISA reader (Benchmark Plus; BiO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도(optical density)를 측정하여 ALP 활성도를 평가하였다(n=15).
MC3T3-E1 (Mouse osteoblastic cell; ATCC, Manassas, VA, USA) 세포를 10% fetal bovin serum (Gibco, Calsbad, CA, USA)를 함유한 α-MEM 배지(Gibco)에 5×104개/ml의 농도로 희석하고, 시편이 담긴 well에 1 ml씩 분주하고 37oC, 5% CO2 배양기(VS-9160C; Vison Scientific, Daejeon, Korea)에서 4시간 동안 배양하였다.
하이드록시아파타이트 분말의 평균입도는 45∼180 μm (MCD Powder; Himed, New York, NY, USA)을 사용하였다. 균일한 분사를 위하여 시편에서부터 tip 사이의 거리를 10 mm로 유지한 후 4 bar의 압력으로 시편당 30초씩 전체적으로 고르게 입자분사 처리를 하였다. 입자분사 처리한 시편의 표면은 증류수에 5분간 초음파 세척하고 air-spray로 표면에 물기를 제거한 다음, 상온의 건조기에서 24시간 이상 건조시켰다.
개/ml의 농도로 희석하여 시편 위에 1 ml씩 분주하고 1, 2, 3주간 배양하였다. 배양이 끝나는 시점에서 세포를 분리하여 Calcium Assay Kit (QuantichromTM Calcium Assay Kit DICA-500, Bioassay System)를 사용하여 612 nm 파장에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다(n=15).
생체적합성을 평가하기에 앞서 접촉각 평가를 시행하였다. 접촉각은 표면의 에너지를 의미하며 세포의 부착 및 활동에 있어 매우 밀접한 관련이 있다12).
세포의 분화능을 평가하기 위해 ALP 활성도를 측정하였다. ALP는 세포막에 붙어있는 효소로 골모세포의 분화능을 평가하기 위해 많은 연구에서 ALP 활성도를 측정하였다17-21).
연마 또는 연마 후 블라스팅 처리한 시편을 각각 100∼250 V 전압 하에서 직류 전원 공급장치(Genesys 600-2.6; Densei-Lambda, Tokyo, Japan)를 이용하여 3분간 양극산화 처리하였다.
이 시편들 15 cm 위에 2차 증류수 100 μl를 떨어뜨리고 1분 후, 시편과 증류수 간에 형성된 좌, 우의 접촉각의 평균값을 접촉각 측정기(DSA10; Kerus, Hamburg, Germany)를 사용하여 접촉각으로 측정하였다(n=15)
따라서 ALP 활성도는 세포분화도 초기 단계에 있어 중요한 지표가 된다. 이어 세포 분화도를 측정하기 위해 칼슘양을 측정하였다. 그 결과 HA＋MAO 150과 HA＋MAO 200에서 모든 기간 동안 높은 칼슘양을 나타내었다.
입자분사기(Dust INN 2000; Deldent, Windsor, CT, USA)를 이용하여 티타늄 표면에 하이드록시아파타이트 블라스팅 처리하였다. 하이드록시아파타이트 분말의 평균입도는 45∼180 μm (MCD Powder; Himed, New York, NY, USA)을 사용하였다.
5% CaCl2)에 12시간 동안 담가 부착된 세포를 고정하고, 여분의 1차 고정액을 PBS로 수세하였다. 지질의 성분을 보호해 주면서 시료를 안정화시키기 위하여 1% OsO4 (osmium tetroxide)로 1시간 동안 고정하고, OsO4와 알코올이 직접 만나면 시료내외에 검은 염색성이 나타나는 것을 방지하고자 다시 PBS로 10분간 수세하였다. 수세과정 후 저 농도 알코올부터 무수 알코올 순서로 세포를 탈수시켰다.
Critical point dryer (CPD, HCP-2; Hitachi, Tokyo, Japan)에서 임계점 건조를 한 다음 시료의 전도성을 높이고 2차 전자를 많이 발산할 수 있도록 하기 위해서 Ion coater (Eiko IB-3; Eiko Engineering, Hitachinaka, Japan)를 이용하여 300 Å 두께로 코팅을 하였다. 코팅이 끝난 후 시편 위에 부착된 세포를 주사 전자현미경(FE-SEM, S-800; Hitachi)으로 관찰하였다.
표면 처리된 시편들의 젖음성을 관찰하기 위하여 각 군당 시편을 준비하여 50oC 온도의 건조기에서 24시간 동안 건조시켰다. 이 시편들 15 cm 위에 2차 증류수 100 μl를 떨어뜨리고 1분 후, 시편과 증류수 간에 형성된 좌, 우의 접촉각의 평균값을 접촉각 측정기(DSA10; Kerus, Hamburg, Germany)를 사용하여 접촉각으로 측정하였다(n=15)
대상 데이터
이 실험에서는 시편으로 상용티타늄(Grade 2; Hyundai Titanium, Incheon, Korea)을 사용하였으며, 실험을 위해서 절단기를 이용하여 10×10×1 mm3의 크기로 시편을 절단하였다.
6; Densei-Lambda, Tokyo, Japan)를 이용하여 3분간 양극산화 처리하였다. 전해액은 0.4 M의 칼슘아세테이트(calcium acetate)와 0.04 M의 베타글리세롤 포스페이트 다이소디움 솔트 엔 하이드레이트(beta-glycerol phosphate disodium salt n-hydrate)를 혼합하여 사용하였다.
제작된 상용 티타늄을 #100∼#1200의 SiC 연마지를 이용하여 순차적으로 연마하였다.
데이터처리
접촉각 측정, ALP 활성도 평가, 칼슘양 평가 결과는 그룹별 유의성을 검증하기 위해 one-way ANOVA로 통계 처리 하였다. 통계 처리는 SPSS software ver.
성능/효과
세포 부착 관찰 결과 연마 처리한 SM 시편에서는 납작한 모양으로 세포가 붙어있는 모습을 관찰할 수 있었으나, 표면 처리된 실험군에서는 세포의 모양이 시편을 따라 좀 더 길게 뻗어 부착된 모습을 관찰할 수 있었다. ALP 활성도 측정 결과 HA＋MAO 150과 HA＋MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 높은 ALP 활성도를 나타내었다(p＞0.05). 칼슘양 측정 결과 HA＋MAO 150 과 HA ＋MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 많은 칼슘양을 나타내었다(p＜0.
93 mg/dL). HA, HA＋MAO 150, 그리고 HA＋MAO 200은 SM보다 유의하게 높은 칼슘양을 나타내었다(p＜0.05). 그러나 세 그룹 간에는 유의한 차이가 없었으며(p＞0.
05). HA＋MAO 150 과 HA＋ MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에 있어 가장 높은 ALP 활성도를 나타내었다.
이어 세포 분화도를 측정하기 위해 칼슘양을 측정하였다. 그 결과 HA＋MAO 150과 HA＋MAO 200에서 모든 기간 동안 높은 칼슘양을 나타내었다. 칼슘의 침착량은 골모세포의 분화 순서에서 따라 최종적인 석회화 단계를 대표할 수 있다25,26).
그 결과, SM (60.6o±2.1o), HA (30.1o±1.7o), MAO (16.9o±4.0o), HA＋MAO 100 (8.6o±3.0o), HA＋MAO 150 (7.5o±2.5o), HA＋MAO 200 (11.9o±3.3o), HA＋MAO 250 (19.6o±3.8o)이었다.
한편 선행 연구에서는 블라스팅 방법과 양극산화 방법의 단점을 보완하고 각각의 장점을 얻고자 블라스팅 후 양극산화 처리를 시행하여 하이드록시아파타이트·이산화티탄 복합표면을 형성하였다. 그리고 복합표면의 기계적, 물리적 성질을 평가한 결과 블라스팅이나 양극산화 중 한 방법으로만 표면처리된 시편보다 더 높은 표면 거칠기를 나타냈으며, 티타늄 표면과 코팅층 간의 결합강도가 향상된 것으로 나타났다. 또한 낮은 전류 밀도값을 가지며 높은 부식저항성을 나타내었다11).
그리고 표면을 평가한 결과 블라스팅 처리로 인해 표면은 약 1 μm의 높은 거칠기를 가지면서 코팅층과 티타늄은 높은 결합력을 보였다.
Park 등15)의 연구에서도 표면에 칼슘과 인을 함유하면서 마이크로 단위 표면을 갖는 실험군에서 대조군에 비해 접촉각이 작게 관찰되었다. 따라서 이번 연구에서도 복합표면 처리된 실험군의 접촉각을 감소시키는 데 성분과 구조가 모두 영향을 미쳤을 것이라 생각된다. 임플란트 표면의 친수성 성질은 세포의 증식에 영향을 미칠 뿐만 아니라 프로트롬빈과 같은 혈액 성분 흡착에 도움을 주어 초기 골융합에 있어 중요한 영향을 미치게 된다16).
05). 세포 부착 관찰 결과 연마 처리한 SM 시편에서는 납작한 모양으로 세포가 붙어있는 모습을 관찰할 수 있었으나, 표면 처리된 실험군에서는 세포의 모양이 시편을 따라 좀 더 길게 뻗어 부착된 모습을 관찰할 수 있었다. ALP 활성도 측정 결과 HA＋MAO 150과 HA＋MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 높은 ALP 활성도를 나타내었다(p＞0.
시편에 부착한 세포의 양상을 주사전자현미경으로 관찰한 결과(Fig. 1), 연마 처리만 한 SM 시편을 제외한 모든 실험군 위에서의 세포의 모습은 시편을 따라 길게 뻗은 모습을 관찰할 수 있었다. 즉, SM 시편에서보다 표면을 변형시킨 시편에서 세포에서 더 많은 filopodia가 관찰되며 더욱 활발한 세포의 움직임을 추측할 수 있었다.
이번 실험에서는 임플란트 표면 처리로 블라스팅 처리 후 양극산화 복합 처리를 통해 표면에너지가 높고 세포활성도가 우수한 표면을 제작할 수 있었다. 그러나 임플란트 재료로서 효과와 안정성을 입증하기 위해서는 세포독성 및 생체적합성에 대한 추가적인 생체(in vivo) 실험도 추가적으로 수행되어야 할 것이다.
그 중 Boyan 등20)은 표면의 거칠기가 증가할수록 높은 ALP 활성도를 나타내었다고 보고하였다. 이번 연구에서도 선행연구에서 표면 거칠기가 가장 컸던 HA＋MAO 150과 HA ＋MAO 200에서 가장 높은 ALP 활성도를 나타내었지만 유의한 차이가 없었다(p＞0.05). 활성도는 1주에서 2주 사이는 증가하였지만, 2주에서 3주 사이는 증가하지 않는 것으로 나타났다.
접촉각 분석 결과, 복합처리된 HA＋100과 HA＋MAO 150은 유의하게 낮은 접촉각을 나타내었다(p＜0.05). 세포 부착 관찰 결과 연마 처리한 SM 시편에서는 납작한 모양으로 세포가 붙어있는 모습을 관찰할 수 있었으나, 표면 처리된 실험군에서는 세포의 모양이 시편을 따라 좀 더 길게 뻗어 부착된 모습을 관찰할 수 있었다.
접촉각은 표면의 에너지를 의미하며 세포의 부착 및 활동에 있어 매우 밀접한 관련이 있다12). 접촉각 측정 결과에서는(Table 2), HA＋MAO 100과 HA＋MAO 150에서 다른 실험군과 비교하여 접촉각이 유의하게 낮아(p＜0.05), 친수성을 가졌다. 표면의 접촉각은 표면의 화학적 성분뿐만 아니라 마이크로 단위의 표면 구조 등 표면의 형상 역시 영향을 미치게 된다.
1), 연마 처리만 한 SM 시편을 제외한 모든 실험군 위에서의 세포의 모습은 시편을 따라 길게 뻗은 모습을 관찰할 수 있었다. 즉, SM 시편에서보다 표면을 변형시킨 시편에서 세포에서 더 많은 filopodia가 관찰되며 더욱 활발한 세포의 움직임을 추측할 수 있었다. 이러한 세포 부착 양상은 표면의 성분, 거칠기, 젖음성과 같은 표면의 물리화학적 성질이 영향을 미쳤을 것이라고 생각된다.
05). 칼슘양 측정 결과 HA＋MAO 150 과 HA ＋MAO 200은 1, 2, 3주 모든 기간에서 가장 많은 칼슘양을 나타내었다(p＜0.05).
후속연구
이번 실험에서는 임플란트 표면 처리로 블라스팅 처리 후 양극산화 복합 처리를 통해 표면에너지가 높고 세포활성도가 우수한 표면을 제작할 수 있었다. 그러나 임플란트 재료로서 효과와 안정성을 입증하기 위해서는 세포독성 및 생체적합성에 대한 추가적인 생체(in vivo) 실험도 추가적으로 수행되어야 할 것이다.
따라서 하이드록시아파타이트·이산화티탄이 복합 코팅된 표면은 높은 표면에너지를 가지며 우수한 세포활성도를 나타내어 치과용 임플란트 표면으로 유용하게 사용될 수 있을 것이라고 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
임플란트 치료법의 성공에 영향을 미치는 것은?
오늘날 평균 수명이 늘어나면서 치아상실 인구가 많아지고 있고 이를 수복하기 위해 임플란트 치료의 요구와 기대도가 증가하고 있다1). 임플란트 치료법의 성공을 좌우하는 것은 골과 임플란트의 직접적인 결합상태인 골융합으로 우수한 골융합은 임플란트 표면의 모양, 표면에너지, 화학적 성분 등이 영향을 미치게 된다2). 따라서 표면의 거칠기를 증대시키고 표면 에너지를 향상시키며 칼슘포스페이트 등의 골전도성 물질을 코팅하여 임플란트의 성공률을 높이고자 많은 표면처리 방법들이 개발되고 있다3).
임플란트 치료법의 표면처리 방법 중 플라즈마 스프레이법의 장단점은 무엇인가?
칼슘포스페이트 코팅을 위한 플라즈마 스프레이법은 수 마이크로미터 단위에서 밀리미터 단위까지 원하는 두께의 코팅층을 얻을 수 있다는 장점이 있으나 티타늄 표면과 코팅층의 결합력이 약하다는 단점이 있다. 또한 실온에서 공정할 수 있는 졸겔 코팅 방법은 용매로 사용되는 알코올 등이 생체적합성에 문제를 일으킬 수 있으며 이 역시 코팅층과의 낮은 결합력 때문에 쉽게 코팅층이 박리될 수 있는 한계점이 있다3,4). 한편, 블라스팅 방법은 표면에 하이드록시아파타이트 등의 세라믹 입자를 압축 공기를 이용, 노즐을 통해 분사시켜 표면 거칠기를 증대시키는 방법 중 하나로 사용되고 있다5,6).
임플란트 치료의 요구와 기대도가 증가하는 이유는?
오늘날 평균 수명이 늘어나면서 치아상실 인구가 많아지고 있고 이를 수복하기 위해 임플란트 치료의 요구와 기대도가 증가하고 있다1). 임플란트 치료법의 성공을 좌우하는 것은 골과 임플란트의 직접적인 결합상태인 골융합으로 우수한 골융합은 임플란트 표면의 모양, 표면에너지, 화학적 성분 등이 영향을 미치게 된다2).
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