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문제 정의
- 따라서 본 연구는 BALB/c 마우스를 대상으로 TMA에 의해 유도된 귀의 부종, 귀 조직의 백혈구 침윤, 혈청내 IgE와 PGE2 생산량 및 비장세포의 Th1와 Th2 사이토카인 생산 등 CHS 반응에 미치는 補中益氣湯의 효과를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 한편 각종 화학물질의 접촉으로 면역기능의 이상 반응을 초래함으로써, 유발되는 여러 종류의 알러지성 질환은 증가추세에 있으나 이에 대한 補中益氣湯의 실험적 연구는 아직 시도해본 바가 없는 실정이다. 이에 TMA(trimellitic anhydride)로 유도된 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity response, CHS)에 관한 補中益氣湯의 免疫調節機能을 연구하였다.
제안 방법
- BTE와 TMA 마지막 공격 후 72시간에 귀 조직 표본을 제작하여 만들어 Wright Giemsa와 Congo red 염색을 하여 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocytes, PMNLs)와 호산구(eosinophils, Eos)의 침윤에 미치는 BTE투여 효과를 조사하였다. 그 결과 BTE와 TMA가 처리되지 않은 음성 대조군은 귀조직의 진피(dermis)층에 혈관이 확장되었고, 표피층(epidermis)에 다형핵백혈구와 호산구가 ㎟당 각각 537.
- 스트레스가 해소된 8주령의 BALB/c계 마우스를 5마리씩 구분하여 TMA로 감작하기 30분 전부터 대조군과 실험군은 각각 생리식염수와 약물(25-200 ㎎/㎏체중)을 하루에 1회씩 경구투여 하였다.
- 黃芪, 人蔘, 白朮, 甘草, 當歸, 陳皮, 升麻, 柴胡로 배오된 補中益氣湯은 傳統的으로 중기하함(中氣下陷)의 병리 및 면역기능저하에 광범위하게 활용되어 왔으나, 접촉성 면역반응에 대한 구체적인 연구가 없는 실정이다. 이에 補中益氣湯 추출물(BTE)의 효과를 검증하기 위하여 본 연구는 TMA로 유도된 마우스의 귀 부종, 혈청내 IgE, IgG1, IgG2a와 IgG2b와 TMA-BSA유도 NO와 PGE2의 생산량, 그리고 ConA로 자극된 비장세포의 Th2 사이토카인 생산량 및 조직내 백혈구 침윤에 대해 조사하였다.
대상 데이터
- 96 well immunoplate는 Nunc사(Denmark)로부터 구입하였고, Rat anti-mouse IgE mAb, biotinconjugated monoclonal rat anti-mouse IgE mAb, rat anti-mouse IgG mAb는 PharMingen사(San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다.
- Trimellitic anhydride (TMA), ConA, aluminium hydroxide, NH4Cl는 Sigma-Ardrich사(St Louis, MO)로부터 구입하였다. RPMI 1640, streptomycin/penicillin, glutamine, 우태아혈청(FBS)는 Gibco/BRL사(Grand Island, NY.
- 무균환경에서 사육된 7주령의 암컷 BALB/c 마우스는 중앙동물실험실(서울)사로부터 구입하였다. 마우스는 스트레스를 해소하기 위해 1주일간 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균 물을 공급하면서 사육한 후 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 黃耆는 3년根으로 충북 제천, 人蔘은 4년根으로 충남 금산, 白朮은 경북 울진, 甘草는 중국 양외1호, 當歸는 강원 진부, 陳皮는 제주, 升麻는 중국, 柴胡는 경북 영천으로 모두 영천의 나눔제약(주)에서 구입하였으며, 약물의 제조는 黃耆 1錢半(5.61g), 人蔘, 白朮, 甘草 각 1錢(3.75g), 當歸, 陳皮 각 5分(1.87g), 升麻, 柴胡 각 3分(1.12g)씩 정량하여 補中益氣湯(22.85g/한첩) 약물조제를 하고 총20첩(457g)을 한약추출기(미강약탕기, ME-727)에 투입하였고, 정수기(하나로, U-2000)에서 정수된 물 5000㎖를 첨가하여 100℃에서 2시간 30분 동안 전탕하였다
이론/모형
- IgE, IgG1 및 IgG2의 측정은 R&D사가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 측정하였다.
- PGE2의 측정방법은 R&D사(Minneapolis, U.S.A.)가 제시한 방법에 준하여 ELISA법으로 정량하였다.
- TMA 화학 항원의 감작과 공격된 마우스의 복강대식세포의 PGE2생산에 미치는 BTE의 효능을 알아 보기 위하여 복강 대식세포(5×105/㎖)를 접종하고 3시간 후에 BTE을 25-200 ㎍/㎖의 농도로 2시간 동안 전 처리한 다음 3 mg/㎖의 TMA-BSA로 자극하여 24시간 배양하여 상층액을 취하고 축적된 PGE2을 ELISA법으로 측정하였다.
- TMA 화학 항원의 감작과 공격에 의한 IgE, IgG1, IgG2a와 IgG2b생산에 BTE의 효능을 조사하기 위하여 귀 부종 실험과 같이 BTE가 처리된 마우스의 귀 두께를 측정한 후 심장으로부터 혈액을 얻어 4℃ 냉장상태에서 충분히 응고시킨 후 원심분리하여 혈청을 얻고 IgE, IgG1, IgG2a와 IgG2b 생산에 미치는 BTE의 효과를 ELISA방법으로 조사하였다.
- TMA-BSA의 결합정도는 Sashidhar 등34)의 방법에 따라 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid로 반응시켜 잔여 유리 아미노 그룹에 의해 결정했다.
- 마우스 등쪽 털을 안과용 가위로 주의 깊게 자르고 제모크림을 바르고 25℃ 물을 이용하여 털을 제거한 후 아세톤과 올리브 오일 용액(4:1, A/O)에 TMA를 섞어 500 ㎎/㎖ TMA용액을 제조하고 감작일에 Lauerma 등33)의 방법에 따라 Fig. 1과 같은 프로그램에 의하여 등쪽에 25 ㎕ TMA(500 ㎎/㎖)를 바르고 7일 후에 25 ㎕ TMA(250 ㎎/㎖)를 2차 감작시켰다.
- 상층액으로부터 IL-4, IL-5 및 IL-13의 immunoassay는 R&D사가 제시한 ELISA 방법에 의하여 측정하였다.
- 혈청내 IgE, IgG1 및 IgG2의 정량은 ELISA법으로 측정하였다. 요약하면, anti-mouse IgE, anti-IgG1과 anti-IgG2는 코팅완충액(0.
성능/효과
- 그 결과 귀의 부종뿐만 아니라 혈청 IgE와 조직내 백혈구 침윤을 농도의존적으로 억제하였다. 또한 TMA-BSA로 자극된 복강 대식세포의 NO와 PGE2의 생산에 있어서도 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있었다.
- 또한 TMA-BSA로 자극된 복강 대식세포의 NO와 PGE2의 생산에 있어서도 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있었다. 더욱이 ConA로 자극하여 활성화된 마우스 비장세포의 Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 사이토카인의 생산을 억제시키는 효과도 있었다.
- 그 결과 귀의 부종뿐만 아니라 혈청 IgE와 조직내 백혈구 침윤을 농도의존적으로 억제하였다. 또한 TMA-BSA로 자극된 복강 대식세포의 NO와 PGE2의 생산에 있어서도 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있었다. 더욱이 ConA로 자극하여 활성화된 마우스 비장세포의 Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 사이토카인의 생산을 억제시키는 효과도 있었다.
- 본 연구에서는 TMA에 노출된 마우스의 혈청이 아닌 비장세포를 ConA로 자극하여 Th2 사이토카인에 속하는 IL-4, IL-5와 IL-13의 생산량을 조사해본 결과 TMA로 감작과 공격된 마우스의 비장세포에서는 IL-4, IL-5와 IL-13 등 Th2 사이토카인을 모두 증가시켰다. 그러나 BTE가 처리된 마우스의 비장세포는 이들 사이토카인을 농도의존적으로 현저한 억제효과를 나타냈다(Fig.
- 본 연구에서도 Valstar 등37)의 방법에 준하여 TMA와 BSA를 결합시켜 TMA로 감작된 마우스 대식세포를 TMA-BSA로 자극한 결과 NO와 PGE2의 생산에 현저히 증가되었으나, BTE을 전 처리할 경우 증가된 NO와 PGE2가 BTE의 농도에 의존적으로 현저히 억제하는 효과가 있었다(Fig. 9와 10).
- 본 연구의 결과 BTE을 처리할 경우 혈청내 IgE을 효과적으로 억제(Fig. 4)한 반면, 면역능 향상에 도움을 주는 IgG 계열의 아형에는 고농도(200 ㎎/㎏)에서만 억제하는 경향을 보였고 25-100 ㎎/㎏에서는 큰 영향을 미치지 않은 것으로 조사되었다.
- 이상의 결과를 종합해볼 때 補中益氣湯은 TMA로 유도된 귀 부종, 혈청내 IgE, 복강 대식세포의 NO와 PGE2, 비장세포의 Th2 생산 및 귀 조직내 진피층의 백혈구 침윤을 억제하는 효과가 있었다.
- 이상의 결과에서 補中益氣湯 추출물(BTE)이 TMA로 유도된 접촉성 과민반응을 억제하는 작용이 있음을 보여주고 있다. 따라서 補中益氣湯은 유해한 환경에 노출되어 유발될 수 있는 각종 알러지성 질환에 사용할 수 있는 方劑임을 제시하고 있다.
후속연구
- 따라서 TMA와 같은 환경성 화학 항원에 노출된 알러지성 질환 치료에 補中益氣湯을 유용하게 활용할 수 있음을 보여주고 있으며, 이에 대한 자세한 작용기전은 앞으로도 계속 硏究되어야 할 것으로 思料된다.
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