선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- MH-8 균주의 EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 생존율을 알아보기 위한 실험을 실시하였다. EGCG에 노출된 세균은 노출 농도와 시간이 증가함에 따라 점차 생존율이 감소하였다.
- 본 연구는 녹차 카테킨인 epigallocatechin gallate (EGCG)에 노출된 용혈성 Aeromonas sp. MH-8의 특성을 조사하기 위하여 실시하였다. 먼저 용혈성의 Aeromonas sp.
- 녹차 및 녹차추출물을 다양한 분야에서 이용하려는 노력이 많이 이루어지고 있으나, 식중독 및 병원성 원인 세균 등을 제어하거나 산업적으로 응용하려는 연구는 여전히 미진한 편이다. 따라서 본 연구에서는 용혈활성을 가진 Aeromonas에 대한 녹차 카테킨인 ECGC 노출에 따른 다양한 특성조사를 실시하였다. 향후 이들 결과를 바탕으로 Aeromonas의 식중독 기작과 EGCG에 의해 억제되는 독성 단백질의 저해 기작을 규명하는 방향으로 연구가 진행되어야 할 것이다.
- 선행 연구 및 본 연구결과에서 보는 바와 같이 EGCG는 다양한 세균에서 뛰어난 살균효과를 가지고 있어 식중독 세균을 예방, 제어하거나 산업적으로 응용가치가 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서는 생존율 조사실험에 근거하여 분리세균이 아치사 조건의 EGCG에 노출되었을 때 일어나는 다양한 세포 반응을 조사하기 위하여 3 mg/mL 농도의 EGCG에서 다양한실험들을 수행하였다.
제안 방법
- 30분 간격으로 LB 고체 평판 배지에 100 µL씩 평판 도말하여 30oC에서 24시간 배양한 후, 형성된 집락을 계수하여 EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 분리세균의 생존율을 조사하였다.
- EGCG에 노출된 분리세균의 세포 외부 형태 변화를 주사전자현미경으로 정상세포와 비교, 관찰하였다. 분리세균을 24시간 동안 배양시킨 후, 원심분리하여 얻어진 균체를 PBS로 3회 세척하여 준비하였다.
- EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 분리세균의 LPS 변화를 관찰하기 위하여 EGCG를 농도별 (0~4 mg/mL)로 3시간 동안 노출시킨 균체와 3 mg/mL의 동일한 농도에서 30분 간격으로 노출 시간의 변화를 주어 최대 180분까지 노출시킨 균체를 원심분리하여 (4oC, 13,000 rpm) 얻었다. 얻어진 모든 균체를 각각 PBS로 3회 세척하여 phenol-water 추출법 [13]에 근거한 LPS Extraction kit (Intron, Korea)를 사용하여 분리세균의 LPS를 추출하였다.
- , Germany)에 1 µL씩 주입하여 peptide를 분석하였다. MALDITOF/MS로 분석된 단백질의 분자량을 Mascot (http://www.matrixscience.com)의 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)와 MS-FIT (www.prospector.ucsf.edu) database에 근거하여 단백질을 동정하였다.
- 본 연구에서는 상한 생선에서 Aeromonas sp. MH-8을 분리 하고, 분리세균이 EGCG에 노출되었을 때 일어나는 여러 가지 세포반응 및 프로테옴 분석을 실시하였다. 먼저 EGCG에노출되었을 때의 분리세균의 생존율을 조사하였으며, SDS-PAGE와 silver staning을 통해 LPS의 변화를 관찰하였다.
- 먼저 EGCG에노출되었을 때의 분리세균의 생존율을 조사하였으며, SDS-PAGE와 silver staning을 통해 LPS의 변화를 관찰하였다. SDS-PAGE와 Western blot을 이용하여 분리세균이 아치사량의 EGCG에 노출되었을 때 유도 발현되는 스트레스충격 단백질 (SSPs)의 변화와 주사전자 현미경을 이용하여 노출에 따른 세포외부 형태의 변화를 관찰하였다. 또한 EGCG에 노출 되었을 때 일어나는 다양한 프로테옴 변화를 2-DE와 MALDITOF 분석을 통하여 확인하였다.
- 마지막으로 100% ethanol에 30분씩 2회 탈수하고, hexamethyldisilazane (EMS, Fort Washington, PA, USA)에 20분간 반응시켜 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 membrane filter를 slide glass 상에 부착시키고, sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co., Japan)를 사용하여, 2 mA로 3분간 gold coating하여 주사전자현미경 (LEO 1455VP, ZEISS, Germany)으로 관찰하였다.
- 0)를 넣고 45분간 반응시켜 LPS를 추출하였다. 고순도의 LPS를 얻기 위해 추출한 LPS에 proteinase K를 첨가하여 60oC에서 1시간 반응시켜 LPS를 정제하였다.
- 농축된 peptide시료를 Matrix buffer (50% ACN, 0.1% TFA) 1 mL에 녹인 후, 0.01 g의 CHCA (α-cyano-4-hydroxyciannamic acid)를 첨가하여 분석용 시료를 만들었다.
- Louis, MO, USA)와 1% osmium tetroxide (Sigma, USA)로 각각 2시간 처리하여 고정을 실시하였다. 다양한 농도의 ethanol (50, 60, 70, 80, 95, 100%)을 준비하여, 저 농도로부터 점차 농도를 높여가면서 각 농도별로 10분씩 연속적으로 탈수시켰다. 마지막으로 100% ethanol에 30분씩 2회 탈수하고, hexamethyldisilazane (EMS, Fort Washington, PA, USA)에 20분간 반응시켜 공기 중에서 건조시켰다.
- 단백질 시료는 각각 180 µg/mL의 농도로 준비하여, TCA 침전법으로 시료를 정제한 후, 기존에 기술된 방법으로 이차원 젤 전기영동 (2-DE)을 수행하였다 [17].
- SDS-PAGE와 Western blot을 이용하여 분리세균이 아치사량의 EGCG에 노출되었을 때 유도 발현되는 스트레스충격 단백질 (SSPs)의 변화와 주사전자 현미경을 이용하여 노출에 따른 세포외부 형태의 변화를 관찰하였다. 또한 EGCG에 노출 되었을 때 일어나는 다양한 프로테옴 변화를 2-DE와 MALDITOF 분석을 통하여 확인하였다.
- MH-8을 분리 하고, 분리세균이 EGCG에 노출되었을 때 일어나는 여러 가지 세포반응 및 프로테옴 분석을 실시하였다. 먼저 EGCG에노출되었을 때의 분리세균의 생존율을 조사하였으며, SDS-PAGE와 silver staning을 통해 LPS의 변화를 관찰하였다. SDS-PAGE와 Western blot을 이용하여 분리세균이 아치사량의 EGCG에 노출되었을 때 유도 발현되는 스트레스충격 단백질 (SSPs)의 변화와 주사전자 현미경을 이용하여 노출에 따른 세포외부 형태의 변화를 관찰하였다.
- 분리세균 MH-8의 EGCG 노출에 의해 나타난 다양한 단백질의 변화를 이차원전기영동 (2-DE)을 통하여 비교 관찰하였다. 3 mg/mL의 EGCG에서 2시간 동안 배양된 MH-8 균주의 프로테옴 발현 변화 양상을 관찰한 결과, pH 4~7 범위에서 약 18개의 프로테옴 스팟 (spots)의 증감이 관찰되었다 (Fig.
- 분리세균의 EGCG 노출에 의한 생존율을 알아보기 위하여 분리세균을 LB 액체 배지에 배양하여, 파장 660 nm에서 혼탁도가 1.0일 때, 배양액을 4oC를 유지하며 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리 하였다. 얻어진 균체를 PBS (pH 7.
- 분리세균이 EGCG에 노출되었을 때 발현되는 단백질 변화를 분석하기 위하여 대상 균주를 3 mg/mL 농도의 EGCG에 2시간 동안 배양한 후 획득한 단백질 시료와 대조군으로서 EGCG에 노출되지 않은 균주에서 얻은 단백질 시료를 각각 준비하 였다. 단백질 시료는 각각 180 µg/mL의 농도로 준비하여, TCA 침전법으로 시료를 정제한 후, 기존에 기술된 방법으로 이차원 젤 전기영동 (2-DE)을 수행하였다 [17].
- 분리세균인 MH-8에 EGCG를 노출농도와 시간을 달리하여, EGCG 노출에 따른 LPS의 변화를 SDS-PAGE와 silver staining을 통해 조사하였다. 추출된 LPS의 크기를 확인하기 위하여 마커를 사용하였으며, gel 상에서 나타난 약 24 kDa의 밴드가 LPS인 것으로 확인되었다.
- 살균효과 실험에 근거한 아치사농도의 EGCG를 처리하였을때 일어나는 MH-8의 세포 외부형태의 변화를 주사전자현미경으로 관찰하였다. EGCG에 노출되지 않은 MH-8 세포는 정상적인 모습의 세포표면이 매끄러운 간균의 형태를 나타내었다 (Fig.
- C, 13,000 rpm) 얻었다. 얻어진 모든 균체를 각각 PBS로 3회 세척하여 phenol-water 추출법 [13]에 근거한 LPS Extraction kit (Intron, Korea)를 사용하여 분리세균의 LPS를 추출하였다. 균체에 lysis buffer를 넣어 완전히 현탁시킨 후, chloroform을 첨가하여 10~20초간 교반하고 실온에서 5분간 반응시켰다.
- 시료 약 5 g을 채취하여 100 mL의 생리 식염수가 담긴 플라스크에 넣고 교반시킨 후, 상등액 100 µL를 취하여 5% sheep blood agar (Difco Co, Sparks, USA)배지에 평판 도말하고, 30oC에서 24시간 배양하였다. 용혈능을 가지는 세균을 분리하기 위하여 배양 과정에서 집락 주변에 투명대 (clear zone)을 생성하는 균주를 선별하였으며, 선별된 균주를 혈액평판배지에 3회에 걸친 도말평판법을 이용한 순수배양기법으로 세균을 분리하였다.
- 분리세균을 24시간 동안 배양시킨 후, 원심분리하여 얻어진 균체를 PBS로 3회 세척하여 준비하였다. 이 균체를 3 mg/mL 농도의 EGCG에 각각 90분, 180분 동안 노출시킨 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 여과지에 부착하여 2.5% glutaraldehyde (Sigma, St. Louis, MO, USA)와 1% osmium tetroxide (Sigma, USA)로 각각 2시간 처리하여 고정을 실시하였다. 다양한 농도의 ethanol (50, 60, 70, 80, 95, 100%)을 준비하여, 저 농도로부터 점차 농도를 높여가면서 각 농도별로 10분씩 연속적으로 탈수시켰다.
- C를 유지하면서 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 균체를 10 mM PBS로 3회 세척하여 시료를 준비하였다. 이후 PRO-PREPTM Protein extraction solution (Intron, Korea)에 균체를 현탁하여 4oC에서 30분간 반응시켜 단백질을 추출하였다. 현탁된 세포는 30분간 원심분리 (4oC, 13,000 rpm)한 후 단백질을 포함하고 있는 상등액을 취하여 SMARTTM BCA Protein assay kit (Intron, Korea)을 사용하여 단백질을 정량하였다.
- 준비된 시료를 PTFE (polytetrafluoroethylene) 필름으로 코팅된 96 well plate (Applied Biosystems Inc., Germany)에 1 µL씩 주입하여 peptide를 분석하였다.
- 전기영동한 gel 은 고정 용액 (25% isopropyl alcohol, 7% acetic acid)으로 4oC 에서 1시간 동안 처리하였다. 처리한 gel을 증류수로 세척한 후 산화 용액 (0.7% periodic acid, 3% ethanol, 0.1% acetic acid)을 첨가하여 5분간 반응시킨 후, 증류수로 30분씩 3회 세척하였다. Silver stain 용액 (1.
- , Victoria, Canada)을 사용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Promega, Madison, USA)를 사용하였다. 항원 항체 반응을 검출하기 위해 ECL kit (Amersham internation plc. Buckinghamshire, England)를 사용하여 X-선 필름 (AGFA, Belgium)에 현상한 후, SSPs의 발현을 분석하였다.
- 현상액 (0.1% citric acid, 0.05% formaldehyde)에서 밴드가 뚜렷하게 나타날 때까지 반응시키고, 정지 용액 (0.8% acetic acid)을 넣어 반응을 정지시킨 후 증류수로 세척하여 EGCG에 노출시킨 분리세균의 LPS 변화를 관찰하였다.
- 이후 PRO-PREPTM Protein extraction solution (Intron, Korea)에 균체를 현탁하여 4oC에서 30분간 반응시켜 단백질을 추출하였다. 현탁된 세포는 30분간 원심분리 (4oC, 13,000 rpm)한 후 단백질을 포함하고 있는 상등액을 취하여 SMARTTM BCA Protein assay kit (Intron, Korea)을 사용하여 단백질을 정량하였다.
대상 데이터
- EGCG에 의한 스트레스 충격단백질 (stress shock proteins, SSPs)을 분석하기 위하여 Sambrook 등 [16]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 1차 항체는 anti-DnaK와 antiGroEL (StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, Canada)을 사용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Promega, Madison, USA)를 사용하였다. 항원 항체 반응을 검출하기 위해 ECL kit (Amersham internation plc.
- 본 연구에 사용된 균주는 상한 생선에서 농화 배양기법을 이용하여 분리하였다. 시료 약 5 g을 채취하여 100 mL의 생리 식염수가 담긴 플라스크에 넣고 교반시킨 후, 상등액 100 µL를 취하여 5% sheep blood agar (Difco Co, Sparks, USA)배지에 평판 도말하고, 30oC에서 24시간 배양하였다.
- 분리세균인 MH-8에 EGCG를 노출농도와 시간을 달리하여, EGCG 노출에 따른 LPS의 변화를 SDS-PAGE와 silver staining을 통해 조사하였다. 추출된 LPS의 크기를 확인하기 위하여 마커를 사용하였으며, gel 상에서 나타난 약 24 kDa의 밴드가 LPS인 것으로 확인되었다. 분리세균에 다양한 농도의 EGCG를 노출시켜 LPS의 변화를 관찰한 결과, LPS의 양적 변화는 노출 농도가 증가함에 따라 상대적으로 증가하였으나, 3 mg/mL의 농도에서는 LPS가 현저히 감소하였으며, 4 mg/mL의 농도에서는 완전히 사라지는 것이 관찰되었다 (Fig.
이론/모형
- , Hercules, CA, USA) 1시간 동안 염색하였고, destaining solution (30% methanol, 7% acetic acid)로 1시간 동안 탈색하였다. EGCG에 의한 스트레스 충격단백질 (stress shock proteins, SSPs)을 분석하기 위하여 Sambrook 등 [16]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 1차 항체는 anti-DnaK와 antiGroEL (StressGen Biotechnologies Corp.
- LPS의 변화를 Fomsgaard의 방법 [14]에 따라 SDS-PAGE 및 변형된 silver staining을 통하여 확인하였다. SDS-PAGE의 separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 5% acrylamide gel을 사용하였다 [15].
- Peptide sequencing을 위한 gel digestion은 이전에 기술된 방법에 따라 실시되었다 [18]. 농축된 peptide시료를 Matrix buffer (50% ACN, 0.
- 분리세균이 EGCG에 노출이 되었을 때 스트레스 충격단백질의 변화를 조사하기 위하여 SDS-PAGE와 Western blot을 실시하였다. SDS-PAGE는 Bollag 등 [15]의 방법에 따라 수행하였으며, Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 4% acrylamide gel을 사용하였다. 전기영동 후 gel은 2.
-
7. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석
분리세균이 EGCG에 노출이 되었을 때 스트레스 충격단백질의 변화를 조사하기 위하여 SDS-PAGE와 Western blot을 실시하였다
. SDS-PAGE는 Bollag 등 [15]의 방법에 따라 수행하였으며, Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 4% acrylamide gel을 사용하였다.
성능/효과
- MH-8을 상한 물고기로부터 농화, 분리하였다. 1~4 mg/mL 범위의 EGCG 에 노출된 MH-8 균주의 생존율을 조사하였으며, EGCG에 노출된 분리세균은 3 mg/mL 이상의 농도에서 3시간 이내에 완전히 살균되었다. EGCG의 노출 농도와 시간에 따라 분리세균 MH-8의 LPS의 양적변화를 SDS-PAGE와 silver staining을 통하여 관찰하였으며, EGCG에 노출된 세균의 LPS는 EGCG에 노출되지 않은 세균의 LPS (대조군)보다 상대적으로 그 양이 증가하였으나, 일정농도 이상의 EGCG에 노출된 분리 세균의 LPS는 현저히 감소하거나 사라지는 것이 관찰되었다.
- 분리세균 MH-8의 EGCG 노출에 의해 나타난 다양한 단백질의 변화를 이차원전기영동 (2-DE)을 통하여 비교 관찰하였다. 3 mg/mL의 EGCG에서 2시간 동안 배양된 MH-8 균주의 프로테옴 발현 변화 양상을 관찰한 결과, pH 4~7 범위에서 약 18개의 프로테옴 스팟 (spots)의 증감이 관찰되었다 (Fig. 5).
- 주사전자현미경을 이용하여 EGCG에 노출시킨 세균의 외부 형태를 분석한 결과, 움푹 패이고 불규칙적인 형태가 관찰되었다. EGCG에 노출된 MH-8 배양의 수용성 단백질 부분에 대한 2-DE에서 18개의 단백질 스팟이 EGCG 노출에 의해 크게 변화하는 것이 확인되었다. Chaperon (예, DnaK, GroEL), 장독소 (예, aerolysin, phospholipase C precursor), LPS 합성 (예, LPS biosynthesis protein, outer membrane protein A precursor), 생합성 및 에너지 대사 등에 수반되는 이들 단백질은 MALDI-TOF를 사용한 peptide mass fingerprinting에 의해 동정되었다.
- MH-8 균주의 EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 생존율을 알아보기 위한 실험을 실시하였다. EGCG에 노출된 세균은 노출 농도와 시간이 증가함에 따라 점차 생존율이 감소하였다. 4 mg/mL의 농도의 EGCG에 노출된 세균은 빠르게 집락의 수가 감소되어 150분에 집락이 발견되지 않았으며, 3 mg/mL의 농도에서는 180분에 집락이 관찰되지 않았다 (Fig.
- 1~4 mg/mL 범위의 EGCG 에 노출된 MH-8 균주의 생존율을 조사하였으며, EGCG에 노출된 분리세균은 3 mg/mL 이상의 농도에서 3시간 이내에 완전히 살균되었다. EGCG의 노출 농도와 시간에 따라 분리세균 MH-8의 LPS의 양적변화를 SDS-PAGE와 silver staining을 통하여 관찰하였으며, EGCG에 노출된 세균의 LPS는 EGCG에 노출되지 않은 세균의 LPS (대조군)보다 상대적으로 그 양이 증가하였으나, 일정농도 이상의 EGCG에 노출된 분리 세균의 LPS는 현저히 감소하거나 사라지는 것이 관찰되었다. EGCG의 세포독성 효과에 저항성을 증진시키는데 기여하는 스트레스 충격단백질 (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL)이 MH-8의 세포 배양에 다양한 농도의 EGCG에 노출됨으로서 유도되었다.
- EGCG의 노출 농도와 시간에 따라 분리세균 MH-8의 LPS의 양적변화를 SDS-PAGE와 silver staining을 통하여 관찰하였으며, EGCG에 노출된 세균의 LPS는 EGCG에 노출되지 않은 세균의 LPS (대조군)보다 상대적으로 그 양이 증가하였으나, 일정농도 이상의 EGCG에 노출된 분리 세균의 LPS는 현저히 감소하거나 사라지는 것이 관찰되었다. EGCG의 세포독성 효과에 저항성을 증진시키는데 기여하는 스트레스 충격단백질 (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL)이 MH-8의 세포 배양에 다양한 농도의 EGCG에 노출됨으로서 유도되었다. 주사전자현미경을 이용하여 EGCG에 노출시킨 세균의 외부 형태를 분석한 결과, 움푹 패이고 불규칙적인 형태가 관찰되었다.
- Chaperon (예, DnaK, GroEL), 장독소 (예, aerolysin, phospholipase C precursor), LPS 합성 (예, LPS biosynthesis protein, outer membrane protein A precursor), 생합성 및 에너지 대사 등에 수반되는 이들 단백질은 MALDI-TOF를 사용한 peptide mass fingerprinting에 의해 동정되었다. 결론적으로 EGCG는 식중독 원인세균인 Aeromonas sp. MH-8에 대하여 상당한 항세균 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
- 3A). 그러나 3 mg/mL의 EGCG에 노출된 세균에서는 노출되지 않은 세균과 비교하여 볼 때, 세포의 크기가 비대해지고 정상적인 간균의 형태를 잃어버렸으며, 외형의 변화가 관찰되었다 (Fig. 3B). 동일조건 하에서 LPS 및 SSPs의 발현이 증가한 점과 결부시켜볼 때, 세포생존을 위하여 LPS 의 증가로 세포외부의 형태와 표면의 변화가 발생한 것으로 판단된다.
- SDS-PAGE와 Western blotting은 분리세균의 EGCG 노출에 따른 스트레스 충격단백질 (SSPs)인 Dnak와 GroEL 분석을 위해 수행되었다. 다양한 농도의 EGCG (1~4 mg/mL)에 노출된 분리세균의 SSPs의 발현은 노출농도가 증가함에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다 (Fig. 4A). 또한 EGCG 노출 시간에 따른 SSPs의 발현을 조사한 결과, Dnak와 GroEL은 노출 후 초기부터 60분까지 점차 발현이 증가하였으나, 그 후로는 점차 감소하였으며, 120분이 경과한 후에는 노출이 되지 않은 세균보다도 발현 양이 현저히 감소한 것을 확인하였다 (Fig.
- 특히 lipopolysaccharide biosynthesis protein (RfbH)은 LPS의 핵심 다당류 합성에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 따라서 EGCG 노출에 의해 분리세균에서 LPS 합성에 관여하는 단백질의 증가는 LPS를 생합성하여 세포막의 안정화를 돕고, 외부 유해 물질의 유입을 막아 세포를 보호하는 장벽역할을 할 수 있도록 발현이 증가한 것으로 사료된다.
- cereus 등 다양한 균주에서도 발현이 되며 온도, H2O2, NaCl, pH 등 세포 외부 환경변화에 의해 발현이 유도되는 것으로 보고되었다 [23,24]. 따라서 분리세균에서 EGCG에 의해 발현의 증감을 보인 SSPs의 변화는 EGCG가 세포 사멸을 유도한 결과 분리세균이 생존을 위해 발현의 변화를 보인 것으로 판단되며, 세균의 종류와 특성에 따라 SSPs의 발현정도에 차이가 있는 것으로 사료된다.
- 4A). 또한 EGCG 노출 시간에 따른 SSPs의 발현을 조사한 결과, Dnak와 GroEL은 노출 후 초기부터 60분까지 점차 발현이 증가하였으나, 그 후로는 점차 감소하였으며, 120분이 경과한 후에는 노출이 되지 않은 세균보다도 발현 양이 현저히 감소한 것을 확인하였다 (Fig. 4B). SSPs인 DnaK와 GroEL은 그람음성세균인 E.
- 또한 세포 외막인 LPS 합성에 관여하는 프로테옴들이 증가하는 것으로 확인되었다. 특히 lipopolysaccharide biosynthesis protein (RfbH)은 LPS의 핵심 다당류 합성에 관여하는 단백질로 알려져 있다.
- 특히 Chaperon (DnaK, GroEL, trigger factor)의 증가가 확인되었는데, 이들 단백질은 세포가 온도, pH, NaCl, 독성 화학물질 등 다양한 형태의 스트레스에 대한 반응기작으로 신속히 유도 및 합성되어 손상된 단백질의 구조를 정상적으로 회복시키는 기능을 한다 [23, 24]. 본 연구의 결과, EGCG 노출에 의해 증가된 이들 단백질은 외부 화학물질에 대하여 세포를 방어하거나 생존을 돕는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
- 이들 연구에 따르면, EGCG에 노출된 그람음성 세균의 경우 그람양성 세균에 비해 낮은 세포 사멸률을 보이는데, 이는 그람음성 세균의 LPS에 의해 EGCG와 같은 외부 살균물질의 유입을 억제하기 때문이라고 제시하였다. 본 연구의 결과와 비교하여 볼 때, MH-8 균주가 치사량 이상의 EGCG에 노출 되어 세포 내로 EGCG가 침투되어 세포 손상이 발생한 결과 LPS합성이 억제되어 결국 세포가 사멸되는 것이라고 사료된 다.
- cereus JCM2152의 세포표면이 심하게 주름이 지고, 찌그러지는 모습을 관찰하였으며, Cho 등 [7]은 EGCG에 노출된 imipenem-저항성인 Klebsiella pneumonia의 세포 표면의 천공과 뭉그러짐을 관찰하였다. 본 연구의 여러 실험에서 얻어진 결과에 근거하여 볼 때, MH-8이 EGCG에 단시간 노출되었을 때, EGCG 의 유입을 억제하기 위하여 LPS의 양이 증가되어 세포의 표면이 변화되었으나, 장시간에 노출이 되었을 때는 세포 외막의 LPS가 파괴되어 EGCG가 세포 내로 유입되어 세포 사멸에 영향을 미치는 것으로 판단된다. EGCG 노출에 의해 세포사멸이 일어나는 기작에 대하여, Hajime 등 [20]은 녹차 카테킨의 주성분인 EGCG가 지질 이중층에 손상을 주어 세균의 생존에 영향을 준다는 결과를 발표하였으며, Shimamura 등 [22]은 카테킨의 주성분인 EGCG가 직접적으로 펩티도글리칸에 결합하여 세포벽을 손상시키고, 세포벽의 생합성을 방해한다고 보고하였다.
- 추출된 LPS의 크기를 확인하기 위하여 마커를 사용하였으며, gel 상에서 나타난 약 24 kDa의 밴드가 LPS인 것으로 확인되었다. 분리세균에 다양한 농도의 EGCG를 노출시켜 LPS의 변화를 관찰한 결과, LPS의 양적 변화는 노출 농도가 증가함에 따라 상대적으로 증가하였으나, 3 mg/mL의 농도에서는 LPS가 현저히 감소하였으며, 4 mg/mL의 농도에서는 완전히 사라지는 것이 관찰되었다 (Fig. 2A). 분리세균을 3 mg/mL 농도의 EGCG에서 180분 동안 노출시켜 LPS의 변화를 확인한 결과, 노출 90분 이후부터 LPS가 점차 감소하였으며, 180분 경과 후, EGCG에 노출되지 않은 세균보다 LPS의 양이 적게 관찰되었다 (Fig.
- 2A). 분리세균을 3 mg/mL 농도의 EGCG에서 180분 동안 노출시켜 LPS의 변화를 확인한 결과, 노출 90분 이후부터 LPS가 점차 감소하였으며, 180분 경과 후, EGCG에 노출되지 않은 세균보다 LPS의 양이 적게 관찰되었다 (Fig. 2B). 살균효과 조사 실험 결과에 따르면 3 mg/mL의 EGCG에서 180분 동안 노출되었을 때, 세균이 완전히 사멸되는 것이 관찰되었는데, 동일 조건 하에서 LPS의 양적변화를 관찰한 결과 분리세균의 세포 사멸이 발생되어 LPS의 양이 감소한 것으로 사료 된다.
- 2B). 살균효과 조사 실험 결과에 따르면 3 mg/mL의 EGCG에서 180분 동안 노출되었을 때, 세균이 완전히 사멸되는 것이 관찰되었는데, 동일 조건 하에서 LPS의 양적변화를 관찰한 결과 분리세균의 세포 사멸이 발생되어 LPS의 양이 감소한 것으로 사료 된다. EGCG 노출에 따른 Aeromonas 속의 LPS합성 억제에 대한 기작에 관한 연구는 보고된 바 없으나, Hajime 등 [20]은 EGCG가 E.
- EGCG의 세포독성 효과에 저항성을 증진시키는데 기여하는 스트레스 충격단백질 (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL)이 MH-8의 세포 배양에 다양한 농도의 EGCG에 노출됨으로서 유도되었다. 주사전자현미경을 이용하여 EGCG에 노출시킨 세균의 외부 형태를 분석한 결과, 움푹 패이고 불규칙적인 형태가 관찰되었다. EGCG에 노출된 MH-8 배양의 수용성 단백질 부분에 대한 2-DE에서 18개의 단백질 스팟이 EGCG 노출에 의해 크게 변화하는 것이 확인되었다.
후속연구
- 또한 얻어진 결과들은 Aeromonas sp. MH-8 대한 EGCG-유도 스트레스와 세포독성의 기작을 이해하는데 중요한 단서를 제공하게 될 것이다.
- EGCG 노출에 의해 세포사멸이 일어나는 기작에 대하여, Hajime 등 [20]은 녹차 카테킨의 주성분인 EGCG가 지질 이중층에 손상을 주어 세균의 생존에 영향을 준다는 결과를 발표하였으며, Shimamura 등 [22]은 카테킨의 주성분인 EGCG가 직접적으로 펩티도글리칸에 결합하여 세포벽을 손상시키고, 세포벽의 생합성을 방해한다고 보고하였다. 그러나 EGCG 노출에 따른 세포 외부 형태의 변화와 세포사멸이 LPS 손상에 의한 것인지, 세포막의 손상에 의한 것인지에 대한 보다 명확하고 구체적인 기작에 대한 연구가 있어야 할 것으로 사료된다.
- EGCG에 의해 본 독소들이 억제되는 기작에 대한 연구 결과는 아직 보고된 바 없다. 따라서 EGCG에 의해 Aeromonas에서 생성되는 독소의 발현이 억제되는 것이 관찰된 것은 흥미로운 내용이며, 향후 EGCG에 의한 독소억제 기작을 밝히는 연구가 수행되어야 할 것이다.
- plantarum) 대하여 EGCG의 살균력 실험을 실시 하였으며, Streptococcus 속은 8시간 이내, 그리고 Lactobacillus 속은 4시간 이내 완전히 제거되는 것을 관찰하였다. 선행 연구 및 본 연구결과에서 보는 바와 같이 EGCG는 다양한 세균에서 뛰어난 살균효과를 가지고 있어 식중독 세균을 예방, 제어하거나 산업적으로 응용가치가 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서는 생존율 조사실험에 근거하여 분리세균이 아치사 조건의 EGCG에 노출되었을 때 일어나는 다양한 세포 반응을 조사하기 위하여 3 mg/mL 농도의 EGCG에서 다양한실험들을 수행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 용혈활성을 가진 Aeromonas에 대한 녹차 카테킨인 ECGC 노출에 따른 다양한 특성조사를 실시하였다. 향후 이들 결과를 바탕으로 Aeromonas의 식중독 기작과 EGCG에 의해 억제되는 독성 단백질의 저해 기작을 규명하는 방향으로 연구가 진행되어야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.