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문제 정의
- 현재 아가로즈와 블루베리를 사용하여 진행된 화장품 제형연구는 진행된 바가 없으며, 블루베리의 최근의 연구동향으로는 항산화작용, 항암작용, 피부미백작용에 관한 연구가 진행되었다 [6]. 따라서 본 연구에서는 피부 미백효과가 있다고 알려진 블루베리 착즙액과 피부 보습력을 극대화시킬 수 있는 꼬시래기 유래 아가로즈 추출물을 사용하여 피부 미백 및 보습 효과를 증대시킬 수 있는 화장용 에멀젼 제형을 개발하고자 하였다.
- 0에서는 초기부터 활성 물질의 높은 피부투과율을 보이며, 내부에 탑재된 활성물질 (알부틴)을 외부 환경으로부터 보호하여 안정성을 유지시켜주는 것으로 조사되었다 [22]. 본 실험에서는 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품의 제형의 pH는6.1~6.15 범위에서 제조하였으며, 피부 보습 실험을 통해 안전성 및 사용감을 확인하고자 하였다.
- 아가로즈는 주변의 pH 변화에 따라 네트워크의 구조적 변화를 일으켜 선별적으로 탑재된 물질의 방출을 조절할 수 있다. 본 연구에서는 블루베리 열매 추출물의 유효성분을 꼬시래기 유래 아가로즈에 포집시키는 형태의 에멀젼 제형을 개발하고, 외부환경에 불안정한 활성 물질을 화장품 제형 내에서는 안정하게 보존하며, 피부에 도포 시 빠른 방출로 피부에 흡수될 수 있는 제형을 개발하고자 하였다. 블루베리 열매 추출물의 효능, 효과 검증에서 tyrosinase와 collagenase의 IC50 값은 100 µg/mL 이하로 나타났다.
제안 방법
- Apply test에서 알러지 반응이 없었던 20명을 대상으로 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 에멀젼 형태의 보습크림 15 µL씩을 시험 부위인 얼굴 볼에 골고루 도포하고 바르기 전과 바른 후의 피부를 수분측정기(Health and Beautiful SK-IV, China)로 촬영하였다.
- C로 가열하였다. Homogenizer (JSRC-13C, Japan)를가동시켜 3,000 rpm까지 올리고 준비된 기본제형 1 L와 블루베리 추출물 2%, 아가로즈 0.1%을 넣고 교반하여 블루베리 화장품을 제조하였다. 제조된 블루베리 화장품 제형을 vaccumoven (OV-11 Korea)을 사용하여 -0.
- O/W에멀젼은 온도 25±2oC, 상대습도 60±5%에서 보관하면서 주기적으로 점도를 측정하였으며, 측정 시 조건은 spindle No. 6, 20rpm, 2 min이었으며, 에멀젼의 변취 및 변색을 육안적으로 평가하여 안정성을 평가하였다.
- Syringe filter (0.45 µm)를 사용하여 여과를 통하여 불순물을 제거하였고, 40oC 이하의 온도에서 감압 농축하여 ethanol을 선택적으로 증발시켰다.
- Tyrosinase 저해능은 Kwon (2015)의 방법을 변형하여 측정하였다 [9]. 실험방법은 Eppendorf tube에 0.
- Positive control로는 gallic acid를 사용하였다. Tyrosinase의 활성 저해 정도는 2가지 시료와 증류수의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다.
- 수용액 (2:98, w/v)을 각각 1:1:1 비율로 교반하여 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. UV-spectrophotometer를 이용하여750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로는 Gallicacid를 사용하여 GAE의 양으로 표시하였다.
- 따라서 피부에 사용하는 화장품은 약산성이나 중성의 pH를 띄는 제품을 사용하는 것이 바람직하며, 제품 사용 중 pH가 안정하게 유지되어야 한다 [20]. 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물 함유 화장품을 25oC, 35oC, 45oC 및 55oC에서 인큐베이터를 사용한 암실조건과 상온의 자연광 노출 조건에서 pH의 변화를 측정하여 제품의 안정성을 검토하였다. 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물 함유 화장품의 초기 pH는 6.
- 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품을 제조하여 저장 조건에 따른 안정성을 평가하기 위하여 육안으로 층분리 및 응집 여부, 이취발생 여부 등을 검토하였다. 두 제품 모두 12일 동안 관찰한 결과 크리밍, 응집과 같은 분리현상이 관찰되지 않았으며, 산화에 의한 특이취도 거의 없었다 (Table 4).
- 본 실험에서 사용한 아가로즈 제조는 Kang (2011) 등의 DMSO추출법을 이용하여 제조하였다 [7]. 꼬시래기로부터 제조한 한천 10 g을 200 mL DMSO (Daejung chemicals Co.,Korea)와 함께 80oC에서 3시간 교반시킨 다음 원심분리(15,000 rpm, 30 min)하여 상층액을 아세톤에 침전시키고, 침전된 아가로즈를 회전 증발 농축기를 사용하여 40oC 이하 온도에서 감압건조하고 겔로 제조 후 건조시켜 분쇄하였다(Fig. 1).
- 5 mM 40 µL, 1500 unit 로 제조한 mushroom tyrosinase (T3824, Sigma, USA) 20 µL 을 넣고 37oC에서 15 min 간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 tyrosinase에 의해 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로부터 형성되는 dopaquinone의 양을490 nm에서 측정하였다. Positive control로는 gallic acid를 사용하였다.
- 본 실험은 Sluis 등 [8]의 방법을 변형하여 사용하였으며, 측정 방법은 1 M Folin-Ciocalteu phenol시약 (Sigma-Aldrich,USA)을 10배 희석하여 블루베리 열매 추출물과 2% Na2CO3수용액 (2:98, w/v)을 각각 1:1:1 비율로 교반하여 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. UV-spectrophotometer를 이용하여750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 점도는 액체가 일정 방향으로 운동할 때, 그 흐름에 평행한 평면의 양측에 내부 마찰력으로서 온도 및 유체의 종류에 따라 다르며, 또한 시간 및 기포 등에 따라 점도가 달라질 수 있다 [18]. 본 연구에서는 다양한 온도 (25oC, 35oC, 45oC, 65oC)로 설정한 인큐베이터에서 보관한 시료의 점도 변화를 측정하였으며, 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물 함유 화장품의 안정성을 조사하였다 (Fig. 3). 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품 초기 점도는 146,000 cPs으로 25~35oC에서 시간의 경과에 따라 점차적으로 점도가 증가하는 것을 알 수 있으며, 45~55oC에서는 3일 이후부터 점차적으로 점도가 감소하였다.
- 블루베리 아가로즈 보습크림을 15 µL씩 chamber에 적하시킨 뒤, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정하여 첩포하고, 48시간 동안 도포하여 관찰하였다.
- 블루베리 열매 추출물 2% 에멀젼의 사용성 검사를 위하여 20~50대 여성 20명을 대상으로 하였다. 블루베리 열매 추출물 2% 에멀젼은 20일간 냉장 보관하면서 사용하도록 한 후에 향, 색상, 점성도, 발림성, 도포 후 느낌, 흡수력, 점도, 보습력의 7항목에 대하여 조사하였다. 피시험자들을 대상으로 설문 조사를 통해 진행하였으며, 5점을 만점으로 하여 진행하였다.
- 온도에 따른 안정성을 평가하기 위해 25oC, 45oC, 65oC의 온도에서 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품 추출물을 함유한 에멀젼 제형을 인큐베이터 암실조건 (dark condition)에 보관하여 물리화학적 특성에 대한 변화를 평가하였다. 일광조사에 따른 안정성을 평가하기위해 햇빛이 잘 드는 실험대에 방치하여 상온에서 14일 동안의 물리화학적 특성 (pH, 점도, 분리, 침전형성정도)을 측정하였다.
- C의 온도에서 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품 추출물을 함유한 에멀젼 제형을 인큐베이터 암실조건 (dark condition)에 보관하여 물리화학적 특성에 대한 변화를 평가하였다. 일광조사에 따른 안정성을 평가하기위해 햇빛이 잘 드는 실험대에 방치하여 상온에서 14일 동안의 물리화학적 특성 (pH, 점도, 분리, 침전형성정도)을 측정하였다. O/W에멀젼의 점도측정은 Brookfield viscometer(RVDV II+, Brookfield Co.
- 피험자 20명을 대상으로 patch test를 실시하였으며, 30분, 24시간, 48시간 경과 후 피부 상태의 변화를 국제접촉피부염연구회 (International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따라 자극 정도를 분류하였다 (Table 5). 제조한 화장품을 상박의 안쪽 부위와 안면에 각각 1 mL씩 피부첩포 실험을 시행하였으며, 총 20명의 피험자 모두 알러지 반응은 나타나지 않았다 (data not shown).
- 블루베리 아가로즈 보습크림을 15 µL씩 chamber에 적하시킨 뒤, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정하여 첩포하고, 48시간 동안 도포하여 관찰하였다. 판정은첩포제거 30분, 24시간, 48시간 경과 후에 국제접촉피부염연구회 (International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따라 자극 정도를 분류하였다 (Table 2). 평균피부반응도는 아래의 계산공식에 따라 산정하였으며 피부첩포 시험결과 판정표에 따라 자극유무를 판정 하였으며, 평균 피부반응도 (Mean score) 계산공식은 아래와 같다.
- 블루베리 열매 추출물 2% 에멀젼은 20일간 냉장 보관하면서 사용하도록 한 후에 향, 색상, 점성도, 발림성, 도포 후 느낌, 흡수력, 점도, 보습력의 7항목에 대하여 조사하였다. 피시험자들을 대상으로 설문 조사를 통해 진행하였으며, 5점을 만점으로 하여 진행하였다. 설문 자료는 SPSS ver.
- 피험자 20명을 대상으로 patch test를 실시하였으며, 30분, 24시간, 48시간 경과 후 피부 상태의 변화를 국제접촉피부염연구회 (International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따라 자극 정도를 분류하였다 (Table 5). 제조한 화장품을 상박의 안쪽 부위와 안면에 각각 1 mL씩 피부첩포 실험을 시행하였으며, 총 20명의 피험자 모두 알러지 반응은 나타나지 않았다 (data not shown).
대상 데이터
- 블루베리 열매 추출물 2% 에멀젼의 사용성 검사를 위하여 20~50대 여성 20명을 대상으로 하였다. 블루베리 열매 추출물 2% 에멀젼은 20일간 냉장 보관하면서 사용하도록 한 후에 향, 색상, 점성도, 발림성, 도포 후 느낌, 흡수력, 점도, 보습력의 7항목에 대하여 조사하였다.
- 블루베리는 담양군 소재 블루베리 향토사업단 출하공장에서 구입하였으며, 꼬시래기는 2016년 3월에 전남 완도에서 채취하여 증류수로 3회 이상 세척하여 염분을 제거하여 60oC의 건조기에서 24시간 동안 건조하고 파쇄하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 시료는 블루베리 건물을 믹서기로 파쇄하여 1 g을 취한 뒤 0.1% 염산을 포함한 80% ethanol 50 mL을 2번가하여 침지하였고, 침지된 시료에 다시 80% ethanol 50 mL을 가하여 추출하였다. Syringe filter (0.
- 1%을 넣고 교반하여 블루베리 화장품을 제조하였다. 제조된 블루베리 화장품 제형을 vaccumoven (OV-11 Korea)을 사용하여 -0.05 mb에서 화장품 제조 시 발생한 기포를 제거하였다. 24시간 동안 실온에서 보관하면서 탈포 및 냉각과정을 진행한 후 실험에 사용하였다 (Table 1).
- 피험자 20명을 대상으로 patch test를 실시하였으며, 건선(psoriasis), 습진 (eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은시험에서 제외하였다. 블루베리 아가로즈 보습크림을 15 µL씩 chamber에 적하시킨 뒤, 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정하여 첩포하고, 48시간 동안 도포하여 관찰하였다.
- 피험자들은 광주시에 동구에 거주하고 있는 20~40대 사이의 여대학생들과 일반 사무실 근무자로, 일차로 모집된 지원자 25명 중에서 1차로 문진을 하고 본 실험에 적합하다고 판단된 20명을 대상으로 실험군을 최종 선발하였다.
- 한천의 제조 실험에 사용한 꼬시래기는 전남 완도에서 양식을 하는 (주)대원식품에서 염장처리 한 물품을 구입하여 사용하였다. 실험실에서 염분을 제거하고 흐르는 물에 3회 이상 씻어서 자외선에 건조시켜서 사용하였다.
데이터처리
- 피시험자들을 대상으로 설문 조사를 통해 진행하였으며, 5점을 만점으로 하여 진행하였다. 설문 자료는 SPSS ver. 22.0 프로그램을 사용하여 평균과 표준편차를 구하였다.
이론/모형
- 하이드로겔로 응용이 가능한 천연고분자는 성질에 따라 음이온성, 양이온성, 중성고분자로 분류가 가능하며, 대표적인 양이온 고분자로서 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 피브린 (fibrin) 등이 있고 그 외 중성고분자로서 텍스트란 (dextran), 아가로스 (agarose) 등이 있다. 본 실험에서 사용한 아가로즈 제조는 Kang (2011) 등의 DMSO추출법을 이용하여 제조하였다 [7]. 꼬시래기로부터 제조한 한천 10 g을 200 mL DMSO (Daejung chemicals Co.
성능/효과
- 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물 함유 화장품을 25oC, 35oC, 45oC 및 55oC에서 인큐베이터를 사용한 암실조건과 상온의 자연광 노출 조건에서 pH의 변화를 측정하여 제품의 안정성을 검토하였다. 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물 함유 화장품의 초기 pH는 6.12이었고, 12일 후 25oC, 35oC, 45oC 및 55oC의 pH가 각각 6.08, 6.02 및 5.94로 매우 근소한 차이를 보였으며, pH 상에서 변화가 거의 없어 안정성은 매우 높은 것으로 판단하였다 (Fig. 3). 이와 같은 결과는 선행 연구에서 진행되었던 연잎 추출물을 함유한 화장품의 안정성 평가의 결과와 유사함을 확인하였다 [21].
- 두 제품 모두 12일 동안 관찰한 결과 크리밍, 응집과 같은 분리현상이 관찰되지 않았으며, 산화에 의한 특이취도 거의 없었다 (Table 4). 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물은 각각 0.1% 와 2%를 사용하였으며, 저장온도에 따른 안정성을 실험한 결과 가혹 조건인 45oC 및 55oC에서는 점도가 감소하는 현상을 나타내었으나, 일반적인 상온에서는 모두 안정성을 나타내었다. 고온에서 보관할 때에는 물성의 변화가 나타날 수 있으므로, 보관시 유의할 필요가 있으며, 추후 고온에서도 제품의 정성을 향상시킬 수 있는 기술적인 보완연구가 필요하다고 생각된다.
- 3). 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품 초기 점도는 146,000 cPs으로 25~35oC에서 시간의 경과에 따라 점차적으로 점도가 증가하는 것을 알 수 있으며, 45~55oC에서는 3일 이후부터 점차적으로 점도가 감소하였다. 45~55oC에서 점도가 감소하는 현상은 고온으로 인해 이화학적인 변성이 일어나는 것으로 판단되며, 이와 같은 결과는 Jeon 등[19]의 연잎 화장품 제조시 65oC 고온 조건에서 점도가 감소하였던 결과와 일치한다
- 블루베리 열매에서 추출한 유효성분과 꼬시래기 유래 아가로즈를 이용한 화장품 제조와 실험에 있어서 피부에 대한 부작용은 발생되지 않았다. 꼬시래기 유래아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품 제형의 안정성 실험에서 점도 및 pH 측정 실험결과 일상적인 상온에서 제형의 안정성을 확인할 수 있었으며, 피부 첩포시험 및 수분측정에서는 전체적으로 20~40대 여성 모두 건조한 피부의 상태가 호전됨을 알 수 있었다. 결론적으로 꼬시래기 유래아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품은 피부의 수분 흡수를 도울 뿐만 아니라 증발을 방지하는 효과가 있음을 확인하였으며, 추후 리포좀과 같은 전달체 개발을 통해피부 침투율을 극대화시키는 연구가 필요하다고 판단된다.
- 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품을 제조하여 저장 조건에 따른 안정성을 평가하기 위하여 육안으로 층분리 및 응집 여부, 이취발생 여부 등을 검토하였다. 두 제품 모두 12일 동안 관찰한 결과 크리밍, 응집과 같은 분리현상이 관찰되지 않았으며, 산화에 의한 특이취도 거의 없었다 (Table 4). 꼬시래기 유래 아가로즈와 블루베리 열매 추출물은 각각 0.
- 본 실험에서 블루베리 열매 추출물의 collagenase 저해활성 실험결과 IC50 값은 112 µg/mL으로 측정되었으며, 양성대조군으로 사용한 gallic acid 의 IC50값은 64.8 µg/mL로측정되어 블루베리 열매 추출물은 매우 높은 collagenase 저해 활성이 있음을 확인하였다 (Fig. 2).
- 본 실험에서 블루베리의tyrosinase 저해결과 IC50 값은 168 µg/mL으로 측정되었으며, 양성대조군으로 사용한 gallic acid의 IC50값은 84.3 µg/mL로나타났다 (Fig. 2).
- 4 mg/g으로 나타났다. 이와 같은 결과로 보았을 때 블루베리 착즙액보다 ethanol이나, methanol 추출등 유기용매 추출법을 이용한 총 폴리페놀 함량이 더 높게 측정되는 것을 알 수 있다.
후속연구
- 꼬시래기 유래아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품 제형의 안정성 실험에서 점도 및 pH 측정 실험결과 일상적인 상온에서 제형의 안정성을 확인할 수 있었으며, 피부 첩포시험 및 수분측정에서는 전체적으로 20~40대 여성 모두 건조한 피부의 상태가 호전됨을 알 수 있었다. 결론적으로 꼬시래기 유래아가로즈와 블루베리 열매 추출물을 이용한 화장품은 피부의 수분 흡수를 도울 뿐만 아니라 증발을 방지하는 효과가 있음을 확인하였으며, 추후 리포좀과 같은 전달체 개발을 통해피부 침투율을 극대화시키는 연구가 필요하다고 판단된다.
- 1% 와 2%를 사용하였으며, 저장온도에 따른 안정성을 실험한 결과 가혹 조건인 45oC 및 55oC에서는 점도가 감소하는 현상을 나타내었으나, 일반적인 상온에서는 모두 안정성을 나타내었다. 고온에서 보관할 때에는 물성의 변화가 나타날 수 있으므로, 보관시 유의할 필요가 있으며, 추후 고온에서도 제품의 정성을 향상시킬 수 있는 기술적인 보완연구가 필요하다고 생각된다.
- 기존의 연구에서 피부노화 방지에 효과를 확인하기 위해 MSC line ST2, OB6 mature osteoblastic steocytic cell 및 MLO-Y4 cell을 이용하여 세포수준에서 블루베리 열매 추출물을 처리하였을 때 collagenase 발현양이 감소하는 것을 확인하였으며 [17], 이것은 블루베리 열매 추출물이 노화방지에 효과가 있다는 것을 의미한다. 따라서 피부 노화방지 및 주름 개선에 관한 연구 측면에서 보았을 때, 추후 피부 각질세포인 HaCAT cell 등을 이용하여 세포수준에서 주름개선 효과를 확인할 필요가 있다.
- 일반적으로 페놀류 화합물을 다량으로 함유하는 식물체와 그 추출물은 높은 항산화능을 갖기 때문에, tyrosinase에 의한 가역적 산화반응을 억제시키는 특성을나타낸다 [14]. 추후 세포 수준의 실험을 통해 블루베리 열매추출물의 tyrosinase 연관 단백질과 mRNA 등의 발현량을 통해 멜라닌 생성 저해에 관한 연구가 필요하다고 판단된다.
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