선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구에서는 Albumin-erythropoietin (Alb-EPO)을 생산하는 CHO 세포의 2단계 배양 (biphasic culture)을 통하여 sialidase의 활성을 억제함으로서 Alb-EPO의 시알산 함량 증대를 목적으로 하였다. 세포의 사멸로 sialidase가 배양액으로 방출될 가능성이 높은 배양 5일차에 온도와 CO2의 공급을 조절하여 2단계 배-양을 진행하였다.
제안 방법
- 세포 내의 sialyltransferase 활성을 측정하기 위하여 3, 6, 8일 차의 세포를 7×105개 회수하여 PBS로 3회 세척하였다.
- 회수한 상등액은 sialyltransferase activity kit (R&D Systems, USA)를 사용하여 메뉴얼에 따라서 실험을 진행하였고 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 Albumin-erythropoietin (Alb-EPO)을 생산하는 CHO 세포의 2단계 배양 (biphasic culture)을 통하여 sialidase의 활성을 억제함으로서 Alb-EPO의 시알산 함량 증대를 목적으로 하였다. 세포의 사멸로 sialidase가 배양액으로 방출될 가능성이 높은 배양 5일차에 온도와 CO2의 공급을 조절하여 2단계 배-양을 진행하였다. Sialidase의 활성이 가장 낮은 조건을 선정하여 시알산 관련 효소의 유전자 발현 정도와 활성을 측정하고 2단계 배양을 통해 글리칸 말단의 시알산이 증가한 것을 확인하였다.
- 배양 중 24시간마다 샘플링을 하여 trypan blue (Sigma-Aldrich)로 염색을 진행 후 광학 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 hemocytometer (Superior, Marienfeld, Germany)로 세포 수 및 생존도를 확인하였다.
- , USA)를 사용하였다. 항체와 Alb-EPO와의 결합이 완료된 후 기질로 ABTS peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 발색반응을 진행하였다. 발색 후 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 405 nm에 흡광도를 측정하였다.
- 항체와 Alb-EPO와의 결합이 완료된 후 기질로 ABTS peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 발색반응을 진행하였다. 발색 후 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 405 nm에 흡광도를 측정하였다.
- 배양액에 존재하는 sialidase를 측정하기 위하여 회수한 배양액을 Neuraminidase assay kit (Abcam Inc., USA)를 사용하여 sialidase의 활성을 측정하였다. 샘플을 assay buffer에 희석 후 NeuroBlue dye stock solution을 첨가하여 37℃에서 60분 동안 암반응을 시켰다.
- 샘플을 assay buffer에 희석 후 NeuroBlue dye stock solution을 첨가하여 37℃에서 60분 동안 암반응을 시켰다. 반응 후 DyNA Quant 200 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 Ex/Em=365/460 nm에서 측정하였다.
- 개 회수하여 PBS로 3회 세척하였다. Protein Extraction Solution (Elpis biotech, Korea)을 이용하여 lysis 반응을 진행한 후 12,500 g에서 원심분리 후 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 sialyltransferase activity kit (R&D Systems, USA)를 사용하여 메뉴얼에 따라서 실험을 진행하였고 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 합성한 cDNA를 이용하여 GAPDH, α2,3-sialyltransferase (α2,3-ST), NEU1 유전자를 확인하기 위하여 제작한 primer와 함께 PCR반응을 진행 후 전기영동을 통하여 확인하였다.
- 동결 건조한 Alb-EPO 100 μg을 PNGase F(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 처리를 하였다.
- 시알산 함량을 분석하기 위하여 정제된 Alb-EPO 10 μg과 10mM sodium periodate (Sigma-Aldrich, USA)를 20 μL를 4℃에서 45분간 반응시켰다.
- 세포를 회수하여 RNeasy PlusMini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA를 정량 후 Maxime RT Premix Kit (iNtRon, Seongnam, Korea)를 이용하여 T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 cDNA를 합성하였다.
- 세포를 회수하여 RNeasy PlusMini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA를 정량 후 Maxime RT Premix Kit (iNtRon, Seongnam, Korea)를 이용하여 T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 이용하여 GAPDH, α2,3-sialyltransferase (α2,3-ST), NEU1 유전자를 확인하기 위하여 제작한 primer와 함께 PCR반응을 진행 후 전기영동을 통하여 확인하였다.
- Alb-EPO의 antennary 구조를 확인하기 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 동결 건조한 Alb-EPO 100 μg을 PNGase F(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 처리를 하였다.
- 동결 건조한 Alb-EPO 100 μg을 PNGase F(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 처리를 하였다. Graphitized carbon columns (Grace Davison Discovery Sciences, Deerfield, IL, USA)을 이용하여 유리화된 N-글리칸만을 정제하여 2-aminobenzamide (2-AB; TCI, Tokyo, Japan)와 반응시켰다. 2-AB labeling 후에 GlycoClean S-cartridge (Prozyme, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 N-글리칸을 정제하고 TSKgel DEAE-5PW column (Tosoh bioscience,Tosoh, Tokyo, Japan)을 사용하여 HPLC 분석을 하였다.
- Graphitized carbon columns (Grace Davison Discovery Sciences, Deerfield, IL, USA)을 이용하여 유리화된 N-글리칸만을 정제하여 2-aminobenzamide (2-AB; TCI, Tokyo, Japan)와 반응시켰다. 2-AB labeling 후에 GlycoClean S-cartridge (Prozyme, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 N-글리칸을 정제하고 TSKgel DEAE-5PW column (Tosoh bioscience,Tosoh, Tokyo, Japan)을 사용하여 HPLC 분석을 하였다.
- CHO 세포배양에 영향을 미치는 가장 큰 요인 중 온도와 CO2 농도에 대한 효과를 확인하기 위하여 배양을 진행하였다. 배양 중 CO2 농도가 높아지면 배양액의 pH가 낮아지는 효과를 얻을 수 있었다 (data not shown).
- 2단계 배양이 α2,3-ST의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 배양 3, 6, 8일차의 세포를 lysis 하여 분석을 진행하였다.
- 2). 이후 세포사멸이 가장 많이 일어나는 시점인 배양 7일차와 8일차의 배양액내의 sialidase를 측정하였다 (Fig. 3). 배양 7일차와 배양 8일차 모두 온도와 CO2가 감소함에 따라서 sialidase의 활성도가 감소하였다 (Fig.
- 9는 CHO 세포의 배양에는 적절하지 않은 조건이므로 세포의 증식에 부정적인 영향을 주지 않는 범위 내에서 sialidase 활성도를 억제하는 것이 중요하다. 배양 8일차는 배양기간의 마지막에 해당하므로 배양 종반부인 7일차에 가장 sialidase 활성도가 낮게 측정되는 33℃, 1% CO2를 최적 조건으로 선정하여 향후 실험을 진행하였다.
- 2단계 배양이 α2,3-ST의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 배양 3, 6, 8일차의 세포를 lysis 하여 분석을 진행하였다. 33℃, 1% CO2 농도와 동물세포에서 기준으로 사용하는 조건인 37℃, 5% CO2에서 각각 분석을 진행하였다 (Fig. 4). 6일차 α2,3-ST의 활성이 대조군보다 1.
- 앞서 얻은 결과를 통하여 33℃, 1% CO2의 2단계 배양이 AlbEPO의 시알산 및 안테나 구조에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 배양 8일차의 샘플을 회수하여 분석하였다. 첫 번 째로 Alb-EPO의 전체 시알산 함량을 분석하여 2단계 배양이 어떠한 영향을 주었는지 확인하였다 (Fig.
- 의 2단계 배양이 AlbEPO의 시알산 및 안테나 구조에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 배양 8일차의 샘플을 회수하여 분석하였다. 첫 번 째로 Alb-EPO의 전체 시알산 함량을 분석하여 2단계 배양이 어떠한 영향을 주었는지 확인하였다 (Fig. 5). 그 결과 sialidase의 활성이 가장 낮게 확인된 33℃, 1% CO2의 조건에서 대조군에 비하여 시알산의 함량이 13.
- 3% 높게 확인되었다. 또한 시알산이 포함된 안테나 구조를 확인하기 위하여 분석을 진행하였다. 대조군에 비하여 실험군에서 Bi-, tri-, tetraantenna의 상대 비율이 모두 증가한 것을 알 수 있었다.
- 특히 N-글리칸의 말단에 위치하는 시알산은 당단백질의 체내 반감기에 많은 영향을 주게 된다. 본 연구에서는 CHO 배양 중 방출되는 sialidase의 활성을 pH에 영향을 주는 CO2 농도와 온도 조절을 통하여 2단계 배양을 진행하였다. sialidase의 방출이 증가하는 5일차에 배양조건 변화를 통하여 33℃, 1% CO2의 조건이 가장 배양액 내의 sialidase의 활성이 낮은 것을 확인하였다.
- 배양 중 온도와 CO2를 조절하는 2단계 배양에서는 0일차에 5% CO2로 배양을 진행 후 5일차에 온도는 33, 35, 37℃로 CO2는 1, 5, 10, 15%로 각각 조절하였다.
- 세포 사멸이 발생하게 되면 세포 내 존재하는 sialidase가 배양액으로 방출되어 생산된 당단백질 말단에 위치하는 시알산을 분해하는데 영향을 준다 [13]. 2단계 배양이 세포내 sialidase의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 진행하였다. 확인 결과 온도와 CO2의 농도 변화에 따라서 sialidase의 mRNA 발현에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다 (Fig.
대상 데이터
- 실험에 사용한 세포주는 Alb-EPO를 생산하는 CHO DUKXB11를 사용하였다 [17]. 배양은 125-mL Erlenmeyer flask에 20 mL의 working volume으로 ProCHO5 (Lonza, Verviers, Belgium) 배지를 분주한 후 4 mM glutamine (Sigma-Aldrich, St.
- 회수한 배양액을 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 정량분석 하였다. Sandwich ELISA를 진행하기 위하여 1차 항체로 albumin에 결합하는 goat anti-human albumin antibody (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)와 2차 항체로 peroxidase-labeled goat anti-human albumin antibody(Abcam Inc., USA)를 사용하였다. 항체와 Alb-EPO와의 결합이 완료된 후 기질로 ABTS peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 발색반응을 진행하였다.
- 실험에 사용한 세포주는 Alb-EPO를 생산하는 CHO DUKXB11를 사용하였다 [17]. 배양은 125-mL Erlenmeyer flask에 20 mL의 working volume으로 ProCHO5 (Lonza, Verviers, Belgium) 배지를 분주한 후 4 mM glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 진행하였다. 또한 orbital shaker(Vision Scientific Co.
이론/모형
- 회수한 배양액을 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 정량분석 하였다. Sandwich ELISA를 진행하기 위하여 1차 항체로 albumin에 결합하는 goat anti-human albumin antibody (Abcam Inc.
성능/효과
- 세포의 사멸로 sialidase가 배양액으로 방출될 가능성이 높은 배양 5일차에 온도와 CO2의 공급을 조절하여 2단계 배-양을 진행하였다. Sialidase의 활성이 가장 낮은 조건을 선정하여 시알산 관련 효소의 유전자 발현 정도와 활성을 측정하고 2단계 배양을 통해 글리칸 말단의 시알산이 증가한 것을 확인하였다.
- 농도에 대한 효과를 확인하기 위하여 배양을 진행하였다. 배양 중 CO2 농도가 높아지면 배양액의 pH가 낮아지는 효과를 얻을 수 있었다 (data not shown). 낮은 온도와 CO2 농도로 배양조건을 변화시킨 각각의 조건에서 8일차의 VCD가 높은 것으로 확인되었다 (Fig.
- 배양 중 CO2 농도가 높아지면 배양액의 pH가 낮아지는 효과를 얻을 수 있었다 (data not shown). 낮은 온도와 CO2 농도로 배양조건을 변화시킨 각각의 조건에서 8일차의 VCD가 높은 것으로 확인되었다 (Fig. 1(a)).
- 1(a)). 33℃로 온도를 변화시킨 실험군은 1, 5, 10, 15%의 CO2 농도에서 37℃로 배양한 같은 CO2 농도의 실험군에 비하여 8일차 VCD가 각각 1.16, 1.29, 1.34, 1.81배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 35℃로 온도를 변화시킨 실험군은 각각의 CO2 조건에서 37℃로 배양한 실험군에 비하여 1.
- 81배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 35℃로 온도를 변화시킨 실험군은 각각의 CO2 조건에서 37℃로 배양한 실험군에 비하여 1.02, 1.05, 1.36, 1.22배 VCD가 증가한 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 같은 CO2 농도에서 온도가 감소할수록 VCD가 높아지는 것을 알 수 있었다.
- 22배 VCD가 증가한 것을 알 수 있었다. 이를 통하여 같은 CO2 농도에서 온도가 감소할수록 VCD가 높아지는 것을 알 수 있었다. 같은 온도의 실험군에서 CO2 농도 변화에 따른 VCD를 비교하였을 때 모든 온도에서 CO2의 농도가 가장 낮은 1% 조건에서 8일차에 VCD가 가장 높게 확인되었다.
- 이를 통하여 같은 CO2 농도에서 온도가 감소할수록 VCD가 높아지는 것을 알 수 있었다. 같은 온도의 실험군에서 CO2 농도 변화에 따른 VCD를 비교하였을 때 모든 온도에서 CO2의 농도가 가장 낮은 1% 조건에서 8일차에 VCD가 가장 높게 확인되었다. 5일차 이후 33, 35, 37℃의 온도 조건의 순서로 생존도가 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 같은 온도의 실험군에서 CO2 농도 변화에 따른 VCD를 비교하였을 때 모든 온도에서 CO2의 농도가 가장 낮은 1% 조건에서 8일차에 VCD가 가장 높게 확인되었다. 5일차 이후 33, 35, 37℃의 온도 조건의 순서로 생존도가 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1(b)).
- 또한 같은 온도의 배양 조건에서 CO2의 값이 낮아질수록 생존도가 5일차 이후 높게 확인되었다. 이를 통하여 33℃ 1%의 조건에서 가장 높은 생존도를 확인하였다. 이러한 결과에 따른 생산성을 확인하였다 (Fig.
- 98 mg/L의 생산성을 확인하였다. 시간에 따른 생산성을 확인한 결과 VCD와 생존도와 유사하게 낮은 온도와 CO2의 농도에 따라서 생산성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 일부 실험군에서 VCD의 증가에 비해 생산성이 많이 증가하지 않은 것을 확인할 수 있었다.
- 앞서 진행한 방법과 같이 2단계 배양이 α2,3-ST의 mRNA 발현에 영향을 주는지 확인한 결과 mRNA 발현에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다 (Fig. 2).
- 따라서 세포내 α(2,3)-ST의 활성도는 배양 조건에 따라서 유사한 결과를 나타나는 것으로 확인하였다.
- 6일차 α2,3-ST의 활성이 대조군보다 1.1배 높게 확인되었고 3, 8일차는 각각 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.
- 2단계 배양이 세포내 sialidase의 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여 RT-PCR을 진행하였다. 확인 결과 온도와 CO2의 농도 변화에 따라서 sialidase의 mRNA 발현에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다 (Fig. 2). 이후 세포사멸이 가장 많이 일어나는 시점인 배양 7일차와 8일차의 배양액내의 sialidase를 측정하였다 (Fig.
- 3). 배양 7일차와 배양 8일차 모두 온도와 CO2가 감소함에 따라서 sialidase의 활성도가 감소하였다 (Fig. 3(a)).
- 3(a)). 배양 7일차의 33℃, 1% CO2 농도 조건에서는 같은 온도의 10% CO2 농도 조건에 비하여 sialidase 활성이 28% 낮게 확인되었다. 하지만 35℃와 37℃의 조건에서는 CO2 농도에 따라서 sialidase 활성에 크게 영향을 주지 않음을 확인하였다.
- 배양 7일차의 33℃, 1% CO2 농도 조건에서는 같은 온도의 10% CO2 농도 조건에 비하여 sialidase 활성이 28% 낮게 확인되었다. 하지만 35℃와 37℃의 조건에서는 CO2 농도에 따라서 sialidase 활성에 크게 영향을 주지 않음을 확인하였다. 배양 8일차의 경우 온도와 CO2 농도에 따른 sialidase 활성과의 관계가 배양 7일차보다 확연하게 관찰되었다 (Fig.
- 3(b)). 하지만 같은 CO2의 농도에서 온도의 변화에 따른 sialidase 활성도의 차이는 크지 않은 것으로 관찰되어 2단계 배양 시 온도에 따른 영향보다는 CO2 농도에 따른 영향이 더 큰 것을 확인하였다.
- 5). 그 결과 sialidase의 활성이 가장 낮게 확인된 33℃, 1% CO2의 조건에서 대조군에 비하여 시알산의 함량이 13.3% 높게 확인되었다. 또한 시알산이 포함된 안테나 구조를 확인하기 위하여 분석을 진행하였다.
- 또한 시알산이 포함된 안테나 구조를 확인하기 위하여 분석을 진행하였다. 대조군에 비하여 실험군에서 Bi-, tri-, tetraantenna의 상대 비율이 모두 증가한 것을 알 수 있었다. Biantenna는 16.
- 대조군에 비하여 실험군에서 Bi-, tri-, tetraantenna의 상대 비율이 모두 증가한 것을 알 수 있었다. Biantenna는 16.8%에서 18.8%로, tri-antenna는 17.0%에서 20.5%로 tetra-antenna는 10.7%에서 11.5%로 대조군보다 실험군에서 각각 함량이 증가한 것을 알 수 있었다.
- 반면에 같은 조건에서 시알산을 부가해주는 α2,3-ST의 활성에는 영향이 없는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3).
- 시알산의 부가 및 제거에 영향을 주는 효소는 앞서 언급한 것과 같이 sialidase와 CHO cell에서 발현하는 α2,3-ST가 있다. 실험결과 33℃, 1% CO2의 조건에서 sialidase는 최대 28%까지 활성이 감소하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3). 반면에 같은 조건에서 시알산을 부가해주는 α2,3-ST의 활성에는 영향이 없는 것을 알 수 있었다 (Fig.
- 3). 이러한 결과를 종합할 때 Alb-EPO의 전체 시알산 함량의 증가는 2단계 배양을 통한 sialidase의 활성 억제가 주요한 역할을 한 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 CHO 배양 중 방출되는 sialidase의 활성을 pH에 영향을 주는 CO2 농도와 온도 조절을 통하여 2단계 배양을 진행하였다. sialidase의 방출이 증가하는 5일차에 배양조건 변화를 통하여 33℃, 1% CO2의 조건이 가장 배양액 내의 sialidase의 활성이 낮은 것을 확인하였다. 또한 이러한 조건이 N-글리칸에 시알산을 부가해주는 α2,3-ST의 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
- sialidase의 방출이 증가하는 5일차에 배양조건 변화를 통하여 33℃, 1% CO2의 조건이 가장 배양액 내의 sialidase의 활성이 낮은 것을 확인하였다. 또한 이러한 조건이 N-글리칸에 시알산을 부가해주는 α2,3-ST의 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 최종적으로 시알산 함량을 분석한 결과 대조군에 비하여 13%의 시알산이 증가한 것을 확인하였다.
- 또한 이러한 조건이 N-글리칸에 시알산을 부가해주는 α2,3-ST의 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 최종적으로 시알산 함량을 분석한 결과 대조군에 비하여 13%의 시알산이 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 CHO 세포의 2단계 배양이 N-글리칸의 시알산 함량에 긍정적인 효과를 얻는 것으로 확인되었으며 치료용 단백질 생산에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 8일 차의 생산성을 확인한 결과 1, 5, 10, 15%의 CO2 농도순서로 33도의 조건에서 30.2±0.6, 36.4±2.3, 35.0±0.8, 28.8±0.7 mg/L의 생산성을 확인하였으며 35℃와 37℃의 배양조건에서도 같은 CO2 농도순서로 29.41±0.80, 33.60±1.76, 32.67±2.65, 27.96±1.19mg/L와 31.43±2.22, 28.21±0.87, 33.74±1.07, 29.81±0.98 mg/L의 생산성을 확인하였다.
후속연구
- 최종적으로 시알산 함량을 분석한 결과 대조군에 비하여 13%의 시알산이 증가한 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 CHO 세포의 2단계 배양이 N-글리칸의 시알산 함량에 긍정적인 효과를 얻는 것으로 확인되었으며 치료용 단백질 생산에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.