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문제 정의
- 본 연구의 목적은 임상검체에서 분리된 Aspergillus의 형태학적 특성과 염기서열분석의 유용성에 대하여 보고하고자 한다.
가설 설정
- A. terreus도 SDA에서 빨리 자라 3일 이내에 성숙된다. 집락의 표면은 베이지색 또는 계피색, 황갈색이며, 벨벳(velvety) 또는 가루 같은(powdery) 성상을 보이며, 뒷면은 노란색 또는 황갈색이다.
제안 방법
- 2008년 1월부터 2012년 12월까지 서울 소재의 대형병원 미생물검사실에 의뢰된 98,697개의 임상검체를 대상으로 중복 의뢰로 분리된 균주를 제외한 51,462건의 배양검사에서 분리된 4,984건의 진균의 종류와 분리빈도를 분석한 자료에서 Aspergillus species로 동정된 475건을 형태학적으로 동정된 결과를 기준으로, 형태학적으로 종 수준의 동정이 불가능하고, 임상적 의의가 있는 균종을 대상으로 종(species) 수준까지 분자유전학적인 방법으로 동정하여 형태학적 분석 자료와 비교하였다(Table 1, 2).
- terreus는 LPCB 도말 슬라이드의 현미경 관찰로 속을 구분하고 집락의 색깔로 종을 구분하였다. Aspergillus nidulans와 Aspergillus clavatus는 집락의 색깔로는 구분할 수 없었고, LPCB 도말 슬라이드의 현미경 관찰로 종 특성을 찾아 구분하여 동정하였다(Table 3, Fig. 1).
- 배양된 사상균의 형태학적인 동정은 증식 속도와 색깔, 그리고 형태 등을 관찰하고 충분히 자란 것으로 확인되면 스카치테이프를 이용하여 도말 슬라이드를 만들어 lactopheol cotton blue (LPCB)로 염색하여 광학현미경으로 균사와 분생자(conidia)의 모양과 배열의 특성으로 동정하였고. 일부 형태학적 구분이 어려운 균종은 슬라이드 배양을 추가로 시행하여 형태학적 동정을 시행하였다.
- 증폭을 위한 표적부위로 ITS,D1/D2, β-tubulin을 선택하였으며, 시발체의 염기서열은 CLSI 가이드라인 MM18-A를 참조하였다. 염기서열 상동성 분석을 위한 데이터베이스로는 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)를 이용하여 퍼센트 일치도를 산출하였다.
- 배양된 사상균의 형태학적인 동정은 증식 속도와 색깔, 그리고 형태 등을 관찰하고 충분히 자란 것으로 확인되면 스카치테이프를 이용하여 도말 슬라이드를 만들어 lactopheol cotton blue (LPCB)로 염색하여 광학현미경으로 균사와 분생자(conidia)의 모양과 배열의 특성으로 동정하였고. 일부 형태학적 구분이 어려운 균종은 슬라이드 배양을 추가로 시행하여 형태학적 동정을 시행하였다.
- 형태학적으로 동정된 결과를 기준으로 동정이 불가능한 진균, 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주, 종(species) 수준까지 동정이 요구되는 진균을 대상으로 염기서열분석을 시행하였다(Table 4). Aspergillus species 8 균주를 분석한 결과 Aspergillus fumigatus 5주, Aspergillus falvus (ITS 98%) 1주, Aspergillus terreus (ITS 98%) 1주, 그리고 Aspergillus lentulus (ITS 100% D1D2 100%)로 동정되었다.
대상 데이터
- 증폭을 위한 표적부위로 ITS,D1/D2, β-tubulin을 선택하였으며, 시발체의 염기서열은 CLSI 가이드라인 MM18-A를 참조하였다.
- , Korea)에 접종하여 30℃에서 3일간 배양하고 검체에 따라 무균검체는 실온(23∼26℃)에서 3주간 배양하였고, 오염된 비뇨생식기, 호흡기, 그리고 소화기 검체는 실온에서 10일간 배양하였다. 피부과에서 의뢰하는 검체는 피부과 처치실에서 채취하여 바로 MYCO-B agar(SDA with chloramphenicol and cycloheximide, Hanil KomedCo., Korea)에 접종하여 검사실로 보내오면 실온에서 3주 동안 배양하였다.
이론/모형
- PCR은 thermal cycler model 9700 (Applied BiosystemsInc,.)를 이용하였고, 증폭된 산물의 염기서열 분석은 BigDye terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems Inc.)와 API Prism 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems Inc.)을 이용하였다. 증폭을 위한 표적부위로 ITS,D1/D2, β-tubulin을 선택하였으며, 시발체의 염기서열은 CLSI 가이드라인 MM18-A를 참조하였다.
- 분자유전학적 동정은 형태학적으로 동정이 불가능하거나 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주를 대상으로 종(species)수준까지 동정을 sequencing 방법으로 시행하였다. DNA 분리는 자동핵산 추출기 MagNA pure LC 1.
성능/효과
- Aspergillus species 8 균주를 분석한 결과 Aspergillus fumigatus 5주, Aspergillus falvus (ITS 98%) 1주, Aspergillus terreus (ITS 98%) 1주, 그리고 Aspergillus lentulus (ITS 100% D1D2 100%)로 동정되었다. Aspergillus fumigatus 5주는 4주에서 ITS 100% (2주)와 99% (2주)의 결과를 보였으며, 1주는 D1D2에서 99%를 보였다. 미동정 균주 1주와 Scopulariopsis sp.
- Aspergillus niger의 특징은 SDA에서 대부분 3일 내에 빨리 자라며, 집락은 양털 같으며 처음에는 흰색을 보이다가 분생포자가 생성됨에 따라 검은색으로 변한다. 대부분 성장하면서 방사상의 균열(fissure)을 보이며, 집락의 뒷면은 흰색 또는 연노란색을 띠었다.
- 형태학적으로 동정된 결과를 기준으로 동정이 불가능한 진균, 형태학적으로 유사하여 동정이 까다로운 균주, 종(species) 수준까지 동정이 요구되는 진균을 대상으로 염기서열분석을 시행하였다(Table 4). Aspergillus species 8 균주를 분석한 결과 Aspergillus fumigatus 5주, Aspergillus falvus (ITS 98%) 1주, Aspergillus terreus (ITS 98%) 1주, 그리고 Aspergillus lentulus (ITS 100% D1D2 100%)로 동정되었다. Aspergillus fumigatus 5주는 4주에서 ITS 100% (2주)와 99% (2주)의 결과를 보였으며, 1주는 D1D2에서 99%를 보였다.
- Aspergillus 균종의 동정에서 집락의 색깔과 Lactophenol cotton blue (LPCB) 도말슬라이드의 현미경 관찰에 의한 형태학적으로 동정이 가능한 균종은 Aspergillus fumigatus, A. niger, A.flavus, A. terreus, A. nidulans, 그리고 A. clavatus 이었으며, A.fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus는 LPCB 도말슬라이드에서 현미경으로 분생포자(conidia)가 소낭(vesicle)에 형성되어있는 형태로 Aspergillus를 확인한 후 집락의 색깔로 동정이 가능하나, A. clavatus, A. nidulans, 그리고 A. versicolor는 집락의 색깔과 관계없이 현미경적 형태로 동정이 가능하다[1,2].
- 본 연구에서 시행한 염기서열분석에서는 증폭을 위한 표적부위로 ITS, D1D2, 그리고 β-tubulin을 선택하여 형태학적으로 종수준의 동정이 불가능했던 Aspergillus species 8 균주와 미동정 2 균주, 그리고 R/OScopulariopsis species로 보고되었던 1주를 포함한 11 균주 중에서 10 균주가 ITS에서 상동성이 98∼100%를 나타냈고, 5 균주에서 D1D2에서 99∼100%의 상동성을 보였다. ITS에서 동정된 균주는 Aspergillus fumigatus가 5주로 가장 많았고, Aspergillusfalvus, Aspergillus terreus, 그리고 Aspergillus lentulus가 각각 1주씩 종 수준까지 동정되었고, Aspergillus versicolor는 2주 모두 ITS와 D1D2에서 100% 상동성을 나타냈다. 형태학적 검사에서 분생자가 생성되지 않아 미동정 균주로 보고되었던 1주는 Emericella parvathecia로 ITS 100%, β-tubulin 99%의 상동성을 보였다.
- 로 보고되었던 1주는 Aspergillus versicolor (ITS 100%, D1D2 100%)(Fig. 1)로 동정되었으며, Unidentified mold 1주는 Emericella parvathecia (ITS 100%, β-tubulin 99%)로 동정되었다.
- 본 연구에서 Aspergillus 균종은 효모균을 포함한 전체 배양 양성 진균 46,479주 중에 475주로 14.4% 이며, 효모균과 피부사상균을 제외한 사상균 717주 중에 475주로 66.2%가 분리되었다. 457주의 Aspergillus 균종은 Aspergillus fumigatus가 257주(54%)로 가장 많이 분리된 것으로 나타나, 최근에 국내에서 Heo 등이 발표한 42.
- 본 연구에서 시행한 염기서열분석에서는 증폭을 위한 표적부위로 ITS, D1D2, 그리고 β-tubulin을 선택하여 형태학적으로 종수준의 동정이 불가능했던 Aspergillus species 8 균주와 미동정 2 균주, 그리고 R/OScopulariopsis species로 보고되었던 1주를 포함한 11 균주 중에서 10 균주가 ITS에서 상동성이 98∼100%를 나타냈고, 5 균주에서 D1D2에서 99∼100%의 상동성을 보였다.
- 연구 대상 기간 동안 진균배양으로 의뢰된 98,697건의 배양검사에서 7,174건(7.3%)의 검체에서 진균이 배양되었고, 한 환자에서 의뢰된 중복 검체를 제외하면 4,984건(9.7%)의 환자에서 진균이 배양되었다. 진균이 배양된 4,984건을 분석한 결과 효모균 3,396건(68.
- 7%)의 환자에서 진균이 배양되었다. 진균이 배양된 4,984건을 분석한 결과 효모균 3,396건(68.1%), 피부사상균 857건(17.2%), Aspergillus species 475건(9.5%), 그 외 진균 242건(4.9%), 그리고 진균은 아니지만 항상성균이 14건이 분리 동정되었다(Table 1, 2).
- 형태학적인 동정에서 가장 흔하게 분리되는 Aspergillusfumigatus는 SDA 배지에서 납작하고 벨벳 또는 솜털 같은 모양의 집락으로 3∼5일 이내에 빨리 자라서 성숙된다. 집락의 앞면 색깔은 엷은 녹색, 청록색, 녹갈색을 보이며, 집락의 가장자리는 하얗고,뒷면은 흰색이거나 베이지색을 보였다. 현미경 소견에서는 균사는 투명하고 격막이 분명하며, 둥근 열매구조가 사슬형태로 보이는데, 부풀어 오른 소낭(vesicle)의 상부 2/3 부분에 방사 형태로 경자(phialides)가 덮이고 여기에서 둥근 분생포자(conidia)가 생성되어 있다[1,2,10].
- 형태학적 검사에서 분생자가 생성되지 않아 미동정 균주로 보고되었던 1주는 Emericella parvathecia로 ITS 100%, β-tubulin 99%의 상동성을 보였다.
- 2%) 이었다. 형태학적으로 종 구분할 수 없는 Aspergillus species는 42주(8.8%) 이었고 Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus는 LPCB 도말 슬라이드의 현미경 관찰로 속을 구분하고 집락의 색깔로 종을 구분하였다. Aspergillus nidulans와 Aspergillus clavatus는 집락의 색깔로는 구분할 수 없었고, LPCB 도말 슬라이드의 현미경 관찰로 종 특성을 찾아 구분하여 동정하였다(Table 3, Fig.
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