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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 A. niger가 생산하는 TG를 산업적으로 이용하기 위하여, TG 생산을 위한 최적의 A. niger 균주를 선별하고 선별된 균주에서 TG 생산을 위한 최적 배지와 배양 조건을 수립하고자 한다.
제안 방법
- niger KCTC6913을 대상으로 초기 pH와 배양 시간을 달리하여 배양한 뒤 생산되는 TG활성을 측정하였다.
- 6 종의 A. niger 균주를 200 ml straight jar에 감자 전분 1.5%, 효모추출물 1.0%, KH2PO4 0.1%를 조성으로 하는 배지를 30℃, 150 rpm의 조건으로 20일 동안 현탁배양하여 상층액을 분리해 TG 활성을 측정하였다.
- A. niger 균주 6 종을 이용하여 TG 활성이 가장 높은 균주를 선별하였다.
- A. niger를 배양하기 위하여 감자 전분 1.5%, 효모추출물 1.0%, 그리고 KH2PO4 0.1%를 기본배양배지로 사용하였으며, 배양 용기 내 배지 volume 40%를 기본 조건으로 하여 30℃, 150 rpm의 조건에서 현탁배양 하였다.
- Batch culture 조건에서 탄소원에 따른 TG 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 감자 전분, 고구마 전분, 옥수수 전분,밀 전분 그리고 덱스트린을 이용하였다. 각 탄소원을 1.
- niger KCTC6913의 경우생장과 TG 활성에 초기 pH가 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다. Fig. 3에서 볼 수 있듯이, pH 5와 15일 배양 시 가장높은 TG활성을 확인할 수 있었으며, 따라서 이후의 실험은pH 5, 15일 배양을 기준으로 한 뒤 확인되는 TG활성을 기준으로 평가하였다.
- 0% 첨가하여 배양하였다. Straight jar 내의 산소포화도에 따른 TG 효소 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 각각 배지의 volume을 10, 20, 30, 그리고 60%로 조정한 후 TG의 활성을 평가하였다.
- TG 생산에 있어서 straight jar 내의 산소포화량이 TG 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 상기 확립된 배지 조성에 배지의 volume을 달리하여 초기 pH 5.0, 30℃ 그리고 150 rpm의 조건으로 15일 동안 배양하여 5일 간격으로 TG 활성을 확인하였다. 그 결과 straight jar 내의 산소포화량이 증가함에 따라 TG의 활성이 증가됨을 확인 할 수 있었고, straight jar내의 산소포화량이 가장 높은 10%(v/v)의 배지 조성에서 3.
- TG 생산을 위한 탄소원과 질소원 확립 후, TG 생산을 위한 최적의 탄소원/질소원 비율을 조사하기 위해 탄소원과 질소원의 비율을 조절한 배지를 제조하여 세포생장 및 TG 생합성을 평가하였다.
- TG 효소 활성에 탄소원이 미치는 영향을 조사하기 위해 감자 전분(Woomtree Co., Ltd., Korea), 고구마 전분(Gayasan general food Co., Ltd., Korea), 옥수수 전분(Tureban Co., Ltd., Korea), 밀 전분(Beksul Co., Ltd., Korea), 덱스트린(Qone Co., Ltd., Korea)을 각 시험군에 1.5%로 첨가하여 배양하였다. 질소원 종류에 따른 TG 효소 활성을 조사하기 위해 감자전분을 단일 탄소원으로 하여, 효모추출물(Choheung Co.
- TG와 당화 효소(amyloglucosidase, AG)가 혼재되어 있는 효소액에 반응기질로 p-nitro phenyl glucopyranoside (p-NPG) 와 AG억제제로 알려진 pyridine을 첨가하여 반응 시킨 다음, 알칼리 용액 내에서 발색 정도에 따라 TG만의 활성을 선택적으로 측정하는 원리를 이용하여 TG 활성을 측정하였으며 다음에 자세히 설명하였다[28]. 밀봉이 가능한 시험관에 10 mM p-NPG 1 ml, 0.
- 질소원에 따른 TG 활성을 평가하기 위해 효모추출물, 맥아추출물, 쇠고기추출물을 질소원으로 사용하였다. 각 질소원이1.0% 함유된 배지에 A. niger KCTC6913 균주 접종 후 pH 5.0,30℃, 150 rpm으로 15일 동안 배양하여 TG 활성을 확인하였다.
- Batch culture 조건에서 탄소원에 따른 TG 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 감자 전분, 고구마 전분, 옥수수 전분,밀 전분 그리고 덱스트린을 이용하였다. 각 탄소원을 1.5% 함유하는 배지에 A. niger KCTC6913 균주를 초기 pH 5.0, 배양온도 30℃ 그리고 150 rpm으로 하여 15일 간 배양 후 5일 간격으로 p-NPG assay를 실시하였다.
- 앞선 결과에서 볼 수 있듯이 TG 생산을 위한 최적의 탄소원, 질소원, 용존산소, C/N 비율 등의 배양 조건은 다음과 같이 결정되었다: 탄소원으로 감자전분과 질소원으로 효모추출물을 배양액의 1.5%로 각각 사용하여 호기적 조건에서 배양.확립된 최적배양 조건에서의 TG 생산을 평가하고자 기본조성배지 및 A.
- 2). 이는 두 번째로 높은 TG 활성을 보인 A. niger KCTC6985 균주 보다 약 3배, 가장 낮은 TG 활성을 보인 A. niger KCTC6911 보다 약 7배 높은 TG 활성으로 이후 실험은 A. niger KCTC6913을 이용하여 진행하였다.
- 4에서 언급했듯이 감자 전분과 효모추출물은 TG 생산을 위한 가장 적합한 탄소원 및 질소원임을 확인하였다. 이에최적 배지로 선정된 탄소원 및 질소원의 비율이 TG 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 감자 전분 및 효모추출물의 기본 첨가비율인 1.5:1.0(wt/v)을 다양하게 변화시켜 그 결과를확인하였다. 탄소원 혹은 질소원을 고정한 뒤 탄소원 및 질소원의 비율을 1:1, 2:1, 1.
- 5%로 첨가하여 배양하였다. 질소원 종류에 따른 TG 효소 활성을 조사하기 위해 감자전분을 단일 탄소원으로 하여, 효모추출물(Choheung Co., Ltd., Korea), 맥아추출물(BD Co., Ltd., USA), 쇠고기추출물(BD Co., Ltd., USA)을 각 시험군에 1.0% 첨가하여 배양하였다. Straight jar 내의 산소포화도에 따른 TG 효소 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 각각 배지의 volume을 10, 20, 30, 그리고 60%로 조정한 후 TG의 활성을 평가하였다.
- niger KCTC6913의 TG 생산을 실시하였다. 초기 pH 5.0, 30℃, 배지volume 10% 그리고 150 rpm의 조건으로 A. niger KCTC6913 균주를 15일 동안 배양하였고 5일 간격으로 TG의 활성을 조사 하였다.
- 0(wt/v)을 다양하게 변화시켜 그 결과를확인하였다. 탄소원 혹은 질소원을 고정한 뒤 탄소원 및 질소원의 비율을 1:1, 2:1, 1.5:0.5, 1.5:1.5(wt/v)로 변화한 뒤, pH5.0, 30℃ 그리고 150 rpm의 조건으로 15일 동안 배양하고 5일간격으로 TG의 활성을 조사하였다. 그 결과 균체량의 경우모든 시험군에서 유사한 수치를 나타내 비율에 따른 유의미한 변화를 관찰할 수 없었으며, TG 활성의 경우 탄소원을 고정한후 질소원의 양을 증가시킨 1.
- 5%로 각각 사용하여 호기적 조건에서 배양.확립된 최적배양 조건에서의 TG 생산을 평가하고자 기본조성배지 및 A. niger 배양에 일반적으로 널리 사용되고 있는 potatodextrose broth (PDB) 배지를 대조군으로 사용하여 A. niger KCTC6913의 TG 생산을 실시하였다. 초기 pH 5.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 균주 A. niger KCTC6913, 6911, 6906, 6985, C6144, 6592는 한국 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 구매하여 사용하였다.
- 질소원에 따른 TG 활성을 평가하기 위해 효모추출물, 맥아추출물, 쇠고기추출물을 질소원으로 사용하였다. 각 질소원이1.
성능/효과
- niger KCTC6913을 대상으로 초기 pH와 배양 시간을 달리하여 배양한 뒤 생산되는 TG활성을 측정하였다. Fig. 3에는 나타내지 않았지만, 배양액의 pH를 각각 2~7로 설정하여 20일 동안 배양한 결과 배양 중기 및 배양 후기의 배지 내 pH는초기 pH에서 크게 벗어나지 않아 A. niger KCTC6913의 경우생장과 TG 활성에 초기 pH가 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다. Fig.
- Fig. 4에서 언급했듯이 감자 전분과 효모추출물은 TG 생산을 위한 가장 적합한 탄소원 및 질소원임을 확인하였다. 이에최적 배지로 선정된 탄소원 및 질소원의 비율이 TG 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 감자 전분 및 효모추출물의 기본 첨가비율인 1.
- Fig. 6에서 볼 수 있듯이, 본 연구에서 확립한 최적의 TG생산 배지는 대조군으로 사용한 2 종류의 배지와 비교할 때배양 후 세포 중량은 비슷한 것으로 나타났으나, TG 활성의경우 매우 다른 양상을 보였다. 즉, 배양 후 TG 활성은 기본조성 배지에서 3.
- 1%를 조성으로 하는 배지를 30℃, 150 rpm의 조건으로 20일 동안 현탁배양하여 상층액을 분리해 TG 활성을 측정하였다. 그 결과 A. niger KCTC6913에서 다른 5 종의 균주에 비해 가장 높은 TG 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이는 두 번째로 높은 TG 활성을 보인 A.
- 0, 30℃ 그리고 150 rpm의 조건으로 15일 동안 배양하여 5일 간격으로 TG 활성을 확인하였다. 그 결과 straight jar 내의 산소포화량이 증가함에 따라 TG의 활성이 증가됨을 확인 할 수 있었고, straight jar내의 산소포화량이 가장 높은 10%(v/v)의 배지 조성에서 3.2U/ml의 활성을 얻었다(Fig. 4C). 또한 기존 배지의 조성 volume인40%(v/v)과 비교하여 10%(v/v)에서 1.
- 0, 30℃ 그리고 150 rpm의 조건으로 15일 동안 배양하고 5일간격으로 TG의 활성을 조사하였다. 그 결과 균체량의 경우모든 시험군에서 유사한 수치를 나타내 비율에 따른 유의미한 변화를 관찰할 수 없었으며, TG 활성의 경우 탄소원을 고정한후 질소원의 양을 증가시킨 1.5:1.5(wt/v)의 C/N ratio의 조건에서 5.1 U/ml의 TG활성을 확인할 수 있었으며 이는 기본 조성 배지에 비해 1.3배 증가한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5).
- 그 결과, 감자 전분, 고구마 전분, 옥수수 전분, 밀 전분, 그리고 덱스트린을 각 탄소원으로 이용한 경우, 2.19, 1.8, 0.8, 0.6,그리고 1.8 U/ml로 TG 활성이 나타나 기존에 이용하던 감자전분이 차상위 활성을 보인 덱스트린 대비 1.2배 높은 활성을 나타냄을 확인하였다(Fig. 4A). 또한 가장 많은 양의 균체량(dry cell weight, DCW)이 검출된 밀 전분 또는 옥수수 전분첨가군에서 가장 낮은 TG 활성이 확인됨에 따라, 단순히 균체량에 따라 단위 세포 당 TG 활성 생산이 결정되는 것이 아님을 보여준다.
- 4A). 또한 가장 많은 양의 균체량(dry cell weight, DCW)이 검출된 밀 전분 또는 옥수수 전분첨가군에서 가장 낮은 TG 활성이 확인됨에 따라, 단순히 균체량에 따라 단위 세포 당 TG 활성 생산이 결정되는 것이 아님을 보여준다. 이는 감자 전분이 균체량 보다는 TG 생산에 특이적으로 유리한 탄소원으로 작용한다는 사실을 보여준다.
- 4C). 또한 기존 배지의 조성 volume인40%(v/v)과 비교하여 10%(v/v)에서 1.5배 높은 TG의활성을 확인하였다. 이러한 사실로 A.
- 특히, Lee and Chen (1997)에 따르면 효모, 맥아,펩톤, 옥수수 침지액 등의 추출물과 황화암모늄, 알라닌 그리고 아스파라긴과 같은 단일 질소원을 각각 이용하였을 때 아스파라긴 단일 질소원 첨가 시 균체량의 질량이 최소 균체량을 보인 요산 첨가군 대비 8배 가량 높은 수치를 나타내었으나 효소 활성은 최하위 수준임을 확인하였으며, 효모추출물 이용시 상대적으로 적은 균체량에도 불구하고 아스파라긴 단일질소원 첨가군 대비 TG 활성이 11배 가량 높게 나타난 것을 확인 할 수 있다[20]. 본 연구에서 마찬가지로 효모추출물 이용한 시험군에서 유사하게 나타난 것을 미루어 볼 때, TG 효소의 활성에 있어 단순 세포 수의 양이 결정적인 요소가 아닌 것을다시 한 번 확인 할 수 있었다.
- 4B). 이러한 결과는maltose 50% 및 질소화합물 5% 내외로 구성된 맥아추출물과는 달리 질소화합물의 함유량이 40% 이상인 효모추출물에서 충분한 양의 질소원을 획득함에 따라 유도된 결과인 것으로유추된다. 특히, Lee and Chen (1997)에 따르면 효모, 맥아,펩톤, 옥수수 침지액 등의 추출물과 황화암모늄, 알라닌 그리고 아스파라긴과 같은 단일 질소원을 각각 이용하였을 때 아스파라긴 단일 질소원 첨가 시 균체량의 질량이 최소 균체량을 보인 요산 첨가군 대비 8배 가량 높은 수치를 나타내었으나 효소 활성은 최하위 수준임을 확인하였으며, 효모추출물 이용시 상대적으로 적은 균체량에도 불구하고 아스파라긴 단일질소원 첨가군 대비 TG 활성이 11배 가량 높게 나타난 것을 확인 할 수 있다[20].
- 6에서 볼 수 있듯이, 본 연구에서 확립한 최적의 TG생산 배지는 대조군으로 사용한 2 종류의 배지와 비교할 때배양 후 세포 중량은 비슷한 것으로 나타났으나, TG 활성의경우 매우 다른 양상을 보였다. 즉, 배양 후 TG 활성은 기본조성 배지에서 3.9 U/ml, PDB 배지에서 1.3 U/ml, 최적 조성배지에서 5.1 U/ml의 활성을 보였으며, 이는 최적 조성의 배지가 기본 조성 배지에 비해 1.3배, PDB 배지에 비해 4배 높은TG의 활성을 나타내어, 본 연구에서 확립한 TG 생산을 위한 최적 배지 및 배양 조건이 성공적으로 확립되었음을 시사한다.
- 질소원에 따른 TG 활성을 측정한 결과 효모추출물을 이용한 시험군에서 2.1 U/ml, 맥아추출물 및 쇠고기추출물을 이용한 시험군에서 각각 0.1 및 0.6 U/ml의 활성을 나타내어 3.5배∼20.0배까지 활성의 차이를 보였다(Fig. 4B).
후속연구
- 하지만 wild type 균주의 낮은 TG 생산으로 인해 산업 분야에서 비경제적으로 나타났으며, 이후 유전 공학 기술의 발달과 함께 유전자가 조작된 균주를 대규모 생산을 위한 숙주로 사용하는 새로운 방법이 연구 중이다[20]. 그럼에도 불구하고 A. niger로 얻는 TG 생산량은 여전히 낮으며, 생산성을 향상시키고 산업적 응용을 위한 추가 연구가 필요한 실정이다.
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