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문제 정의
- 본 연구는 토양 환경 중, PCB의 식물로의 흡수/이행 관련 연구의 일환으로 다양한 PCB 이성질체의 식물에 대한 흡수/이행에 영향을 미칠 수 있는 주요 인자 중 하나인 미생물 대사에 관한 연구를 수행하였다. 세부 연구에 소요되는 표준품인 PCB-1, 3, 38 및 126을 개선된 Suzuki coupling법으로 합성하였으며, GC-MS 등의 기기 분석 및 유도체화 반응을 통하여 적절한 정량 및 정성 분석법을 확립하였으며, 이를 활용하여 토양 환경 중 일반적으로 검출되는 것으로 알려진 A.
- 본 연구에서는 다양한 polychlorinated biphenyl 이성질체중, 구조적 특성이 상이한 5종의 이성질체를 Suzuki coupling 법을 활용하여 합성하고, 토양 미생물의 일종으로서 토양 및 식품 전반에 광범위하게 검출되는 것으로 알려진 Aspergillus niger에 의한 대사과정을 밝히고자 하였다.
제안 방법
- 대표적 합성법으로 PCB-126 (3,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl)은 아래의 방법으로 수행하였다. 5-Bromo-1,2,3-trichlorobenzene (2 mmole) 및 촉매(50 mg, Pd (PPh3)4의 toluene 용액(20 mL)에 K2CO3수용액(2 M, 2 mL)을 가하고, 질소 환경 중에서 3,4-dichlorobenzeneboronic acid (2 mmole, ethanol, 4 mL) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소로 5분 내외 처리하여, 용액 중 산소를 제거한 다음, 80-100℃에서 8시간 동안 교반하였다.
- Biphenyl 및 PCB congener의 logP 및 기타 계산화학적 물성은(예: dipolemoment, charge 등) Hypercube사의 HyperChem (ver. 8.0, USA)을 이용하여 구하였다.
- 반응물에 과산화수소(38%, 5 mL)을 가하여 2시간 동안 교반 후, 증류수(200 mL) 및 ethyl acetate (300 mL)을 가하여 합성 PCB를 추출하였다. Ethyl acetate 추출물을 silica gel 컬럼에 가하고 hexane, hexane/ethyl acetate 혼합물을 이용 하여 PCB-126을 순수분리하였다.
- 배양액을 감압여과 후, 잔사는 ethyl acetate (200 mL)를 가하여 세정하고 여액을 합하였다. PCB 및 대사물은 상기의 여액에 ethyl acetate (200 mL*2)를 추가하여, 진탕 추출하였다. Ethyl acetate 추출물을 합한 다음, 무수 Na2SO4를 통과시키고, 여액을 감압 건고하였다.
- 균사체가 포함된 상기의 배양액에 묽은 염산(1 N, 15 mL) 및 포화식염수(100 mL)를 가하고 Waring blendor를 이용, 2분간 마쇄하였다. 배양액을 감압여과 후, 잔사는 ethyl acetate (200 mL)를 가하여 세정하고 여액을 합하였다.
- 혼합물을 질소로 5분 내외 처리하여, 용액 중 산소를 제거한 다음, 80-100℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응물에 과산화수소(38%, 5 mL)을 가하여 2시간 동안 교반 후, 증류수(200 mL) 및 ethyl acetate (300 mL)을 가하여 합성 PCB를 추출하였다. Ethyl acetate 추출물을 silica gel 컬럼에 가하고 hexane, hexane/ethyl acetate 혼합물을 이용 하여 PCB-126을 순수분리하였다.
- 5시간 동안 가열하여 유도체화를 수행하였다. 배양 후 7일차 시료의 경우, 균사체에 의한 PCB 의 흡착효과 검정을 위하여, 배양액과 균사체를 분리하여 상기의 추출을 실시하고, 각 분획에 대하여 분석을 수행하였다.
- 1 mL)를 가하였다. 상기 혼합물을 75℃에서 1.5시간 동안 가열하여 유도체화를 수행하였다. 배양 후 7일차 시료의 경우, 균사체에 의한 PCB 의 흡착효과 검정을 위하여, 배양액과 균사체를 분리하여 상기의 추출을 실시하고, 각 분획에 대하여 분석을 수행하였다.
- 본 연구는 토양 환경 중, PCB의 식물로의 흡수/이행 관련 연구의 일환으로 다양한 PCB 이성질체의 식물에 대한 흡수/이행에 영향을 미칠 수 있는 주요 인자 중 하나인 미생물 대사에 관한 연구를 수행하였다. 세부 연구에 소요되는 표준품인 PCB-1, 3, 38 및 126을 개선된 Suzuki coupling법으로 합성하였으며, GC-MS 등의 기기 분석 및 유도체화 반응을 통하여 적절한 정량 및 정성 분석법을 확립하였으며, 이를 활용하여 토양 환경 중 일반적으로 검출되는 것으로 알려진 A. niger 중 대사 속도 및 대사 경로를 규명하고자 하였다. Biphenyl 및 PCB 이성질체의 대사속도는 치환 염소의 개수가 증가할수록 감소되어, TCDD-관련 독성이 가장 높은 것으로 알려진 PCB-126은 A.
- 5 mL, dimethyl sulfoxide) 을 가하여 27℃, 200 rpm 조건에서 진탕배양을 실시하였다. 실험구는 PCB 이성질체별로 3반복으로 수행하였다.
- 1991). 이와 같은 생물 유효도(bioavailability)와 관련 하여 본 연구에서는 비교적 지용성이 높은 PCB38 및 PCB126의 배양액 및 균사체중 농도를 분석하였다. 그 결과, PCB126의 경우, 대부분의 화합물이 균사체에 흡착된 형태로 존재함을 알 수 있었다(Fig.
대상 데이터
- Biphenyl 표준품(>98%) 및 bromobenzene 유도체(1-bromo 2-chlorobenzene, 1-bromo-4-chlorobenzene, 4-bromo-1,2- dichlorobenzene, 5-Bromo-1,2,3-trichloro-benzene)는 Alfa Aesar Korea (서울)에서 구입하였고, palladium tetrakis (triphenylphosphine) (Pd (PPh3)4)및 PCB 합성 관련 유기용매는 HPLC급으로 Sigma-Aldrich Korea 및 Fisher Scientific (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- PCB 및 대사물의 분석은 Shimadzu GC-2010/SE GC-MS 로 수행하였으며, Restek사의 Rtx-5MS (30 m, 0.25 mm i.d., 0.25 µm thickness) column을 사용하였다.
- )및 PCB 합성 관련 유기용매는 HPLC급으로 Sigma-Aldrich Korea 및 Fisher Scientific (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 시약으로 크로마토그래피용 silica gel은 Merck사의 제품을 사용하였으며, ethyl acetate 등 대사물 추출용 용매는 대정사의(Korea) 제품을 구입, 사용하였다. 대사물의 trimethylsilyl (TMS) 유도체화는 Sigma-Aldrich 사의 N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide-trimethylchlorosilane (BSTFA-TMCS) 용액을 사용하였다.
- 기타 시약으로 크로마토그래피용 silica gel은 Merck사의 제품을 사용하였으며, ethyl acetate 등 대사물 추출용 용매는 대정사의(Korea) 제품을 구입, 사용하였다. 대사물의 trimethylsilyl (TMS) 유도체화는 Sigma-Aldrich 사의 N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide-trimethylchlorosilane (BSTFA-TMCS) 용액을 사용하였다.
- 실험에 사용한 Aspergillus niger는 건국대학교 미생물학 연구실에서 분양받아 사용하였다. 해당 균주는 potato dextrose agar (Difco Laboratories) 배지를 이용, 27℃에서 5일간 고체상 배양을 실시하였다.
이론/모형
- PCB 이성질체별 미생물 분해 연구를 위하여 소요된 PCB 이성질체는 chlorophenylboronic acid 및 bromo-chlorobenzene을 기초로 하여, Suzuki coupling 법을 이용하여 합성하였다(Fig. 1) (Lehmler and Robertson 2001). 대표적 합성법으로 PCB-126 (3,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl)은 아래의 방법으로 수행하였다.
- 대표적 합성법으로 PCB-126 (3,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl)은 아래의 방법으로 수행하였다.
성능/효과
- Biphenyl 및 PCB congener 배양액 및 균사체 추출물을 GC-MS로 분석한 결과, 다양한 대사물의 형성을 확인할 수 있었다. 주요 대사물로서 biphenyl ring에 수산기(hydroxy) 가 1-3개 치환된 물질이 확인되었으며, 배양 경과시간에 따라 다수의 수산기를 보유한 대사물이 생성되었다(Fig.
- niger 중 대사 속도 및 대사 경로를 규명하고자 하였다. Biphenyl 및 PCB 이성질체의 대사속도는 치환 염소의 개수가 증가할수록 감소되어, TCDD-관련 독성이 가장 높은 것으로 알려진 PCB-126은 A. niger에 의한 분해가 관찰되지 않았다. 주요 대사물로서 1-3개의 수산기가 도입된 hydroxy PCB가 검출되었다.
- 다양한 기질물질의 분해 속도는 biphenyl > PCB1 > PCB3 > PCB38 > PCB126의 순으로 나타났다. 개별 물질의 logP는 3.73 (biphenyl), 4.25 (PCB1 및 3), 5.29 (PCB38) 및 6.32 (PCB126)로 예측되었으며, PCB congener 의 분해속도는 logP가 증가할수록 감소하는 것으로 나타났다. 배양시간에 따른 biphenyl 및 PCB congener의 분해는 농약을 비롯한 유기물의 환경 중 분해에서 일반적으로 관찰 되는 일차반응을 따르는 것으로 나타났다(Table 1).
- 이와 같은 생물 유효도(bioavailability)와 관련 하여 본 연구에서는 비교적 지용성이 높은 PCB38 및 PCB126의 배양액 및 균사체중 농도를 분석하였다. 그 결과, PCB126의 경우, 대부분의 화합물이 균사체에 흡착된 형태로 존재함을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 32 (PCB126)로 예측되었으며, PCB congener 의 분해속도는 logP가 증가할수록 감소하는 것으로 나타났다. 배양시간에 따른 biphenyl 및 PCB congener의 분해는 농약을 비롯한 유기물의 환경 중 분해에서 일반적으로 관찰 되는 일차반응을 따르는 것으로 나타났다(Table 1). 배양 과정 중 반감기는 3.
- Pleurotus 등의 백색부후균은 다양한 peroxidase 및 활성 산소 기반의 유기물 분해 효소군을 분비하는 것이 알려져 있으며, Aspergillus 등과 같이 토양 중에 다량 존재하는 일반적인 진균과는 생리-생화학적으로 큰 차이가 있다. 본 연구의 경우, 균사체 및 배양액 전반에 대한 세부적 분석을 수행하였으나, 백색부후균에서 일반적으로 검출된 chlorobenzoic acid 유사체는 검출되지 않았다. 이상의 결과에 따라 A.
- 이 가운데 대사물 1 및 3은 표준물질을 이용하여, 각각 4-hydroxybiphenyl 및 4,4'-dihydroxybiphenyl로 최종 확인되었다.
- 본 연구의 경우, 균사체 및 배양액 전반에 대한 세부적 분석을 수행하였으나, 백색부후균에서 일반적으로 검출된 chlorobenzoic acid 유사체는 검출되지 않았다. 이상의 결과에 따라 A. niger에 의한 PCB의 대사는 수산기 도입 반응을 통하여 주로 진행되며, congener의 지용성 및 염소의 치환위치에 따라 상이한 대사속도를 나타냄을 알 수 있었다.
- Biphenyl 및 PCB congener 배양액 및 균사체 추출물을 GC-MS로 분석한 결과, 다양한 대사물의 형성을 확인할 수 있었다. 주요 대사물로서 biphenyl ring에 수산기(hydroxy) 가 1-3개 치환된 물질이 확인되었으며, 배양 경과시간에 따라 다수의 수산기를 보유한 대사물이 생성되었다(Fig. 4, 5 및 Table 2).
- 한편 PCB1을 비롯한 PCB congener의 수산화 대사물의 확인은 대사물의 mass spectrum 중 염소동위원소에 의한 동위원소 peak의 존재 유무 및 상대비, trimethylsilyl기 도입에 의하여 증가된 분자량(M+72) 등으로 확인하였다. 주요한 분해산물로 1-3개의 수산기가 도입된 대사물을 확인할 수 있었으며, 1-2개의 수산화물이 대부분이었다 (Table 2). PCB의 토양 미생물에 의한 생분해 연구 중, 진균에 의한 연구는 주로 백색부후균(white-rot fungi)을 대상으로 수행되었으며, 수산화 대사물과 함께, 다수의 chlorobenzoic acid계 대사물이 보고되었다(Cvancarova et al.
- 주요 대사물로서 1-3개의 수산기가 도입된 hydroxy PCB가 검출되었다. 한편 PCB-1 및 PCB-3의 소실 속도의 차이로 볼 때, PCB 이성질체의 생분해는 PCB의 3차원 구조와 상관관계가 있는 것으로 사료되었다.
- 2001). 한편 PCB1을 비롯한 PCB congener의 수산화 대사물의 확인은 대사물의 mass spectrum 중 염소동위원소에 의한 동위원소 peak의 존재 유무 및 상대비, trimethylsilyl기 도입에 의하여 증가된 분자량(M+72) 등으로 확인하였다. 주요한 분해산물로 1-3개의 수산기가 도입된 대사물을 확인할 수 있었으며, 1-2개의 수산화물이 대부분이었다 (Table 2).
후속연구
- 2014). 그러나 미생물의 관련 효소에 대한 상세 연구는 미비하며, 이에 대한 추가 연구가 필요하다고 하겠다.
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