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문제 정의
- Lactobacillus rhamnosus GG 의 경우 알레르기 증상이 있는 유아들에게 투여하여 장내염증과 아토피 피부염(atopic dermatitis) 증상이 완화된 바 있다 (Majamaa and Isolauri, 1997). 본 연구에서는 아토피 피부염을 포함하는 알레르기 증상 예방 및 완화능을 갖는 기능성 프로바이오틱스 균주를 개발하기 위하여, 한국인의 유아 분변에서 분리된 유산균에서 in vitro 실험을 통해 Th1/Th2 싸이토카 인의 균형을 동시에 유지시킬 수 있는 유산균을 선별하고 동물실험을 통해 그 면역 조절 기능을 확인하였다.
- 본 연구에서는 우수한 아토피 완화능을 가진 유산균을 선별하기 위해 한국인 유아 분변으로부터 23종의 유산균을 분리하였다. 후보 균주들을 배양하여 열처리 된 세포와 상등액 농축물을 각각 얻었다.
제안 방법
- 5% CO 2 배양기에서 2일간 배양한 다음 IL-4와 IL-12, IFN-γ의 생성량을 cytoset kit를 이용하여 측정하였다.
- RH3201가 마우스 대식세포(macrophage)에 독성을 가지는지 확인하기 위하여 사균체와 상등액 농축물을 RAW 264.7 세포에 처리한 후 세포의 생존율을 MTT assay로 측정하였다(Fig. 2). 대식세포에 24시간 처리한 후에도 전 농도에서 컨트롤 대비 유의적인 세포사멸이 발견되지 않았다.
- RH3201의 사균체와 상등액 농축물을 농도 별로 투여한 마우스군에서의 싸이토카인 변화를 확인하였다(Fig. 4). 사균체를 108, 109 cells/day의 양으로 섭취시킨 결과, IgE의 비정상적인 증가를 일으키는 Th2 싸이토카인인 IL-4의 수치를 농도 의존적으로 감소시켰다.
- RH3201의 사균체와 상등액 농축액을 108, 109 cells/day의 양으로 매일 섭취한 마우스의 혈중 IgE 농도를 7일 간격으로 측정하였다(Fig. 3).
- 각 균주들의 면역조절 작용을 확인하기 위해 Xu 등(2013) 의 방법을 변형하여 실험법을 확립하였다. 적응기간을 거친 실험동물을 난괴법으로 시험군 당 6마리씩 나누고 7일마다 각각의 마우스에 OVA 100 μg과 Al(OH) 3 2 mg을 복강 주사하여 부스팅 하였다.
- 시험군은 RH3201의 사균체(108 , 109 cells) 섭취군, 상등액 농축물(10, 100 mg) 섭취군, 증류수만 섭취한 군으로 분류하였으며, 시험물질은 음용수의 형태로 마우스 당 1 mg/day 경구투여 하였다. 각 실험군 마우스의 혈중 IgE의 농도를 7일 간격으로 sandwich ELISA kit (Shibayagi)를 사용하여 측정하였다. 마지막 28일째에는 마우스의 비장을 적출하여 10% FBS과 OVA가 100 μg/ml 함유된 DMEM배지에 5 × 10 6 cells/ml의 농도로 현탁하여 96 well plate에 분주하였다.
- 균체는 70°C에서 2시간 열처리(tyndallization) 하여 사균화 하였고, 상등액은 감압 농축기(N-1100, EYELA)를 사용하여 10배 농축한 다음 각각 동결건조 하여 분쇄하였다.
- 배양종료 후 배양액 중의 IL-4, IL-12, IFN-γ를 cytoset kit (Biosource International)를 이용하여 측정하였다.
- 우수 균주 선별은 마우스 비장세포를 이용하여 IL-4의 억제 및 IFN-γ의 증가 정도를 확인하는 실험을 통해 진행되었다. 선별 실험 결과로 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (RH3201)을 OVA로 면역 반응을 유발시킨 BALB/c 마우스에 투여할 유산균으로 선정하였다. RH3201의 균체와 대사물을 경구 투여한 군에서는 유발군에 비해 혈중 IgE의 과다 생성이 억제된 것을 확인하였다.
- 적응기간을 거친 실험동물을 난괴법으로 시험군 당 6마리씩 나누고 7일마다 각각의 마우스에 OVA 100 μg과 Al(OH) 3 2 mg을 복강 주사하여 부스팅 하였다. 시험군은 RH3201의 사균체(108 , 109 cells) 섭취군, 상등액 농축물(10, 100 mg) 섭취군, 증류수만 섭취한 군으로 분류하였으며, 시험물질은 음용수의 형태로 마우스 당 1 mg/day 경구투여 하였다. 각 실험군 마우스의 혈중 IgE의 농도를 7일 간격으로 sandwich ELISA kit (Shibayagi)를 사용하여 측정하였다.
- 신생아 유아 분변에서 분리한 23종 유산균의 사균체에 의한 비장세포의 in vitro 싸이토카인 생성능을 확인하였다. Fig.
- 후보 균주들을 배양하여 열처리 된 세포와 상등액 농축물을 각각 얻었다. 우수 균주 선별은 마우스 비장세포를 이용하여 IL-4의 억제 및 IFN-γ의 증가 정도를 확인하는 실험을 통해 진행되었다. 선별 실험 결과로 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (RH3201)을 OVA로 면역 반응을 유발시킨 BALB/c 마우스에 투여할 유산균으로 선정하였다.
- 이 결과를 토대로 IL-4과 IFN-γ의 수치가 양성대조군인 L. rhamnosus GG에 비해 유의적인 차이가 있는 후보군을 선별하고, 특히 IFN-γ/IL-4의 수치가 압도적으로 높았던 RH3201을 사용하여 동물실험을 진행하였다.
- 적응기간을 거친 실험동물을 난괴법으로 시험군 당 6마리씩 나누고 7일마다 각각의 마우스에 OVA 100 μg과 Al(OH) 3 2 mg을 복강 주사하여 부스팅 하였다.
- 본 연구에서는 우수한 아토피 완화능을 가진 유산균을 선별하기 위해 한국인 유아 분변으로부터 23종의 유산균을 분리하였다. 후보 균주들을 배양하여 열처리 된 세포와 상등액 농축물을 각각 얻었다. 우수 균주 선별은 마우스 비장세포를 이용하여 IL-4의 억제 및 IFN-γ의 증가 정도를 확인하는 실험을 통해 진행되었다.
대상 데이터
- 서울·경기 소재의 산후조리원에서 사전 동의 후 신생아 분변에서 분리한 유산균을 사용하였다.
- 이 실험에서는 생후 5주령 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였다. 실험 과정은 National Institutes of Health Animal Research and Care에 따라 진행되었고, 일동제약의 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 승인을 받아 진행하였다(승인번호 A1303-6, A1305-4).
- 처리 시료는 23종의 유산균 사균체 및 상등액 농축물을 증류수에 현탁하였고, 양성대조군으로는 L. rhamnosus GG를 사용하였다. BALB/c 마우스에 Al(OH)3 2 mg과 ovalbumin(OVA) 1 mg을 복강주사로 부스팅 시키고 6일 경과 후 동일하게 2차 부스팅 하였다.
데이터처리
- 결과는 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 균주 선별 실험 결과는 3회 반복 실험하여 student t-test로 분석하였고, 혈중 IgE 농도와 싸이토카인 수치는 Mann-Whitney U test로 처리하였다.
- 결과는 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 균주 선별 실험 결과는 3회 반복 실험하여 student t-test로 분석하였고, 혈중 IgE 농도와 싸이토카인 수치는 Mann-Whitney U test로 처리하였다. 모든 데이터 분석은 SPSS Statics 19.
이론/모형
- 균주 선별 실험을 통해 선정된 L. rhamnosus IDCC 3201 (RH3201, GenBank AY094065)의 사균체와 상등액 농축물의 농도 별 세포 독성은 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay (Promega, USA)로 측정하 였다. RAW 264.
- 균체는 70°C에서 2시간 열처리(tyndallization) 하여 사균화 하였고, 상등액은 감압 농축기(N-1100, EYELA)를 사용하여 10배 농축한 다음 각각 동결건조 하여 분쇄하였다. 균체와 상등액 시료는 멸균 증류수를 사용해 희석하여 사용하였으며, 사균체 개수는 Neubauer counting chamber (Superior)를 사용하여 직접계수법(direct count method)을 통해 계측하였다.
성능/효과
- 선별 실험 결과로 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (RH3201)을 OVA로 면역 반응을 유발시킨 BALB/c 마우스에 투여할 유산균으로 선정하였다. RH3201의 균체와 대사물을 경구 투여한 군에서는 유발군에 비해 혈중 IgE의 과다 생성이 억제된 것을 확인하였다. 그러한 알레르기 억제능은 type-1 T helper (Th1) 세포와 type-2 T helper (Th2) 세포의 싸이토카인 간의 균형을 향상시킴으로써 유도되었다.
- Th1과 Th2 간의 비율인 IFN-γ/IL-4 수치는 증류수만 투여한 유발군에 비해 크게 향상된 모습을 보였다(Fig. 4D).
- 대부분의 후보 균주에서 증류수 섭취군과 비교했을 때 유의적으로 낮은 수치를 보였으며(Fig. 1A), 반대로 Th1 싸이토카인인 IL-12과 IFN-γ의 수치는 상승하였다(Fig. 1B and C).
- 그러한 알레르기 억제능은 type-1 T helper (Th1) 세포와 type-2 T helper (Th2) 세포의 싸이토카인 간의 균형을 향상시킴으로써 유도되었다. 따라서 RH3201의 균체와 배양물은 면역 조절을 통해 아토피 증상을 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
- 사균체에서와 마찬가지로 RH3201의 상등액 농축물도 다른 균주의 상등액 농축물에 비해 모든 싸이토카인에서 유의성 있는 차이를 보여 주었다. 따라서 RH3201의 사균체와 상등액 성분은 Th2 세포가 우세한 면역반응 상태를 Th1이 우세하게 변화시키므로 B 세포 생성을 억제하고, 그 결과로 IgE 억제능을 가질 것으로 생각된다.
- 대식세포에 24시간 처리한 후에도 전 농도에서 컨트롤 대비 유의적인 세포사멸이 발견되지 않았다. 또한 농도 간에도 서로 유의적인 차이를 보이지 않았기 때문에 RH3201의 균체와 대사물은 대식세포에 대한 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.
- 양성대조군인 L. rhamnosus GG에 비해 Th1/Th2 균형이 유의성 있게 높은 균주 6개에 대한 상등액 농축물에 의한 비장세포의 싸이토카인 변화를 나타내었다(Table 1). 사균체에서와 마찬가지로 RH3201의 상등액 농축물도 다른 균주의 상등액 농축물에 비해 모든 싸이토카인에서 유의성 있는 차이를 보여 주었다.
후속연구
- 하지만 상등액 농축액의 경우 높은 농도로 섭취한 군에서만 28일째에서야 유의적으로 낮아진 수치를 나타내었다. 앞서 확인한 독성실험과 IgE 억제능을 생각하면 균체와 상등액 농축물 모두 아토피를 억제하는 원료로서의 가능성을 가지고 있다고 할 수 있다.
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