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문제 정의
- 7 ×108 CFU/g의 매우 높은 분포율을 나타내어 방선균 유전자원 탐색을 위한 우수한 서식처라고 보고한 바 있다(Lee and Whang,2010). 본 연구에서는 방선균 유전자원 확보를 위한 기반 연구를 수행하고자 대용량의 염기서열을 분석할 수 있는 차세대 염기서열분석(pyrosequencing) 기술을 이용해 조릿대 대나무림의 낙엽층과 근권토양 내 분포하는 주요 세균군집의 계통해석과 더불어 방선균군집의 계통학적 특성을 분석하였다.
- 본 연구에서는 차세대 염기서열분석(pyrosequencing) 기술을 이용해 조릿대(Sasa borealis) 대나무림의 낙엽층과 근권토양 내 주요 군집인 방선균군집의 계통학적 특성을 분석하여 방선균 유전자원 다양성 확보를 위한 기반 연구를 수행하고자 하였다. 낙엽층 시료 내 세균군집은 2,588 OTUs, 다양성 지수 7.
제안 방법
- 낙엽층 시료와 근권토양 시료로부터 추출한 DNA를 이용하여 PCR 증폭한 16S rRNA 유전자를 pyrosequencing 하고 각각 11,687개 염기서열로 normalization (평균길이 450 bp)하였다. 종 풍부도 추정치(Richness estimator)와 다양성 지수(Diversity index)를 비교하기 위하여 400 bp 이하의 염기서열과 계(kingdom) 수준에서 분류가 안된 염기서열들을 제거한 후 염기서열 유사도 97% 기준으로 cut-off 하였다.
- 낙엽층과 근권토양으로부터 확보된 16S rRNA 유전자 염기서열을 RDP's pipeline를 이용하여 계통해석 하였다.
- 상기의 연구에서 전체 방선균군집 35개 과 중 28개 과는 Actinomycetales 목에 속하는 주요 방선균군집으로 확인되었다. 이들 Actinomycetales 목에 속하는 방선균군의 계통학적 특성을 검토하기 위하여 PCA (principal component analysis) 분석하였다.
- 조릿대 대나무림 토양 내 주요 세균군집인 Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria 그리고 Acidobacteria 계통군의 OTUs network 분석을 통해 낙엽층과 근권토양 내에 공통으로 분포하며 우점을 이루고 있는 세균군집의 토양간 상관관계를 조사하였다. 낙엽층과 근권토양 내에 약 50–60%를 차지하는 Proteobacteria 계통군의 상관관계를 조사한 결과, Bradyrhizobiaceae, Phyllobacteriaceae 그리고 Commamonadaceae는 P < 0.
- 낙엽층 시료와 근권토양 시료로부터 추출한 DNA를 이용하여 PCR 증폭한 16S rRNA 유전자를 pyrosequencing 하고 각각 11,687개 염기서열로 normalization (평균길이 450 bp)하였다. 종 풍부도 추정치(Richness estimator)와 다양성 지수(Diversity index)를 비교하기 위하여 400 bp 이하의 염기서열과 계(kingdom) 수준에서 분류가 안된 염기서열들을 제거한 후 염기서열 유사도 97% 기준으로 cut-off 하였다. 낙엽층 시료의 경우 2,588 OTUs, 다양성 지수 7.
- 정방향 프라이머는 V1-9F (5′-X-AC-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′), 역방향 프라이머는 V3-541R (5′-X-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3′)을 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 아가로스겔 전기영동을 통하여 약 500 bp 크기의 밴드를 확인한 후 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN)로 정제하였다. 파이로시퀀싱분석은 GS FLX Titanium system (Roche)를 이용하여 Macrogen에서실시하였다.
- )를 이용하였다. 파이로시퀀싱 분석을 위해 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)을 이용하여 추출된 DNA의 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 정방향 프라이머는 V1-9F (5′-X-AC-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′), 역방향 프라이머는 V3-541R (5′-X-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3′)을 사용하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 아가로스겔 전기영동을 통하여 약 500 bp 크기의 밴드를 확인한 후 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN)로 정제하였다. 파이로시퀀싱분석은 GS FLX Titanium system (Roche)를 이용하여 Macrogen에서실시하였다.
대상 데이터
- 전라남도 담양 죽녹원 내에 자생하고 있는 조릿대 대나무림의 낙엽층과 표층으로부터 약 15 cm 아래의 근권으로부터 토양 시료를 3반복으로 채취하였다. 채취한 토양시료는 polyethylene vinyl에 넣어 4°C에 보존한 후 24시간 이내에 실험하였다.
데이터처리
- 조릿대 낙엽층 및 근권토양 시료로부터 얻어진 염기서열 데이터는 GS FLX 소프트웨어(Roche)를 이용하여 염기서열의 adaptor와 PCR primer 부위를 제거하고 Mothur 프로그램(version 1.23.1)을 이용하여 분석하였다(Schloss et al., 2009).낮은 품질의 염기서열과 키메라는 PyroNoise algorithm (Quince et al.
- 최종 얻어진 서열들은 97% 유사도 수준에서 average neighbor algorithm 방법으로 OTUs (operational taxonomic units)를 결정하였다. 종 풍부도 지수(Chao1, ACE), 종 다양성 지수(Shannon) 등은 Mothur 프로그램을 통해 계산하였으며, 시료 간 OUTs의 상관관계는 Cytoscape(version 3.3) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- , 2009).낮은 품질의 염기서열과 키메라는 PyroNoise algorithm (Quince et al., 2011)과 UCHIME를 이용해서 제거하였다(Cole et al.,2009; Edgar et al., 2011). 최종 얻어진 서열들은 97% 유사도 수준에서 average neighbor algorithm 방법으로 OTUs (operational taxonomic units)를 결정하였다.
- , 2011). 최종 얻어진 서열들은 97% 유사도 수준에서 average neighbor algorithm 방법으로 OTUs (operational taxonomic units)를 결정하였다. 종 풍부도 지수(Chao1, ACE), 종 다양성 지수(Shannon) 등은 Mothur 프로그램을 통해 계산하였으며, 시료 간 OUTs의 상관관계는 Cytoscape(version 3.
- 토양시료로부터 genomic DNA 추출은 Takada와 Matsumoto(2004)의 bead beating 방법을 개량한 ISOIL kit (Nippon Kit Co.)를 이용하였다. 파이로시퀀싱 분석을 위해 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)을 이용하여 추출된 DNA의 16S rRNA 유전자를 증폭하였다.
성능/효과
- 근권토양의 경우, 총 6목 32과 88속으로 구성되었으며전체 방선균군집의 약 60%을 차지하는 Actinomycetales목은 Micromonosporaceae (15.6%), Pseudonocardiaceae (12%), Streptomycetaceae (10.2%), Nakamurellaceae (8.1%), Nocardiaceae(7.9%) 그리고 Kineosporiaceae (5.6%)을 포함하는 24개 과로 확인되었다(Fig. 3B).
- 근권토양 내에는 20개의 phyla와 15개의 미동정 phyla로 분류되었다. 근권토양의 경우도 Proteobacteria 문은 전체군집의 51%로 가장 높은 분포율을 나타내었으며, Acidobacteria (16.1%), Bacteriodetes(16.0%), Actinobacteria (4.0%)가 주요 계통군으로 확인되었다(Fig. 1). 이상의 결과로부터, 조릿대 대나무림 내 주요 세균 군집은 Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria 그리고 Acidobacteria로 확인되었다.
- 낙엽층 내 방선균군집은 총 3목 30과 81속으로 구성되었으며, 전체 방선균군집의 약 96%가 Actinomycetales 목으로 Pseudonocardiaceae (22.7%), Microbacteriaceae (10.6%),Streptomycetaceae (11.3%), Nocardioidaceae (10.9%) 그리고 Micromonosporaceae (10.6%)을 포함하는 26개 과가 확인되었다(Fig. 3A).
- 본 연구에서는 차세대 염기서열분석(pyrosequencing) 기술을 이용해 조릿대(Sasa borealis) 대나무림의 낙엽층과 근권토양 내 주요 군집인 방선균군집의 계통학적 특성을 분석하여 방선균 유전자원 다양성 확보를 위한 기반 연구를 수행하고자 하였다. 낙엽층 시료 내 세균군집은 2,588 OTUs, 다양성 지수 7.55로 나타났으며, 근권토양 시료의 경우 2,868 OTUs, 다양성지수 8.15로 다양한 세균군집이 균등하게 분포하고 있는 것으로 확인되었다. 대나무림 토양시료 내 세균군집은 총 35개의 문으로 구성되었으며, Proteobacteria (51–60%), Bacteroidetes(16–20%), Acidobacteria (4–16%) 그리고 Actinobacteria (4–14%) 계통군이 주요 세균군집으로 확인되었다.
- , 2011). 낙엽층 시료는 Sphingobacteriaceae와 높은 상관관계를 나타내었으며, 근권토양은 Cryomorphaceae와 유연관계가 높은 특징을 나타내었다(Fig. 2B). 한편, Acidobacteria 계통군은 토양 시료간 유의성이 낮아 유전적 변이가 있는 계통군으로 평가되었다.
- 한편, Acidobacteria 계통군은 토양 시료간 유의성이 낮아 유전적 변이가 있는 계통군으로 평가되었다. 낙엽층 시료는 Terriglobus, Edaphobacter, Acidicapsa그리고 Granulicell을 포함하는 GP1 그룹과 상관관계가 높았으며, 근권토양은 Acidobacteria GP6, GP7 그룹 그리고 GP16 그룹과 유연관계가 높은 특징을 나타내었다(Fig. 2C).
- 종 풍부도 추정치(Richness estimator)와 다양성 지수(Diversity index)를 비교하기 위하여 400 bp 이하의 염기서열과 계(kingdom) 수준에서 분류가 안된 염기서열들을 제거한 후 염기서열 유사도 97% 기준으로 cut-off 하였다. 낙엽층 시료의 경우 2,588 OTUs, 다양성 지수 7.55로 나타났으며, 근권토양 시료의 세균군집은 2,703 OTUs, 다양성 지수 7.98로 확인되어 근권토양 내에 더 다양한 세균군집이 균등하게 분포하고 있는 것으로 나타났다(Table 1).
- 낙엽층과 근권토양 내에 약 50–60%를 차지하는 Proteobacteria 계통군의 상관관계를 조사한 결과, Bradyrhizobiaceae, Phyllobacteriaceae 그리고 Commamonadaceae는 P < 0.017의 높은 유의성을 나타내어 낙엽층과 근권토양에 변이가 크지 않은 주요 세균군집으로 평가되었다(Fig. 2A).
- 대나무림 토양시료 내 세균군집은 총 35개의 문으로 구성되었으며, Proteobacteria (51–60%), Bacteroidetes(16–20%), Acidobacteria (4–16%) 그리고 Actinobacteria (4–14%) 계통군이 주요 세균군집으로 확인되었다.
- 공동연구자는 선행연구에서 조릿대 대나무림토양으로부터 방선균 총 200균주를 분리하고 16S rRNA 유전자 염기서열 해석한 결과, 분리 균주의 94%가 Streptomyces 이었음을 보고한 바 있다(Lee and Whang, 2010). 본 연구에서 대용량의 염기서열을 분석할 수 있는 454 pyrosequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과, 조릿대 대나무림 토양 시료 내에는 6목 36과 121속을 포함하는 다양한 방선균군집이 분포해 있음을 확인하였다. 이들 방선균 군집의 83% 가 Actinomycetales 목에 속하였으며, Pseudonocardiaceae, Micromonosporaceae 그리고 Streptomycetaceae은 조릿대 대나무림의 대표 방선균군집으로 확인되었다.
- 상기의 연구에서 전체 방선균군집 35개 과 중 28개 과는 Actinomycetales 목에 속하는 주요 방선균군집으로 확인되었다. 이들 Actinomycetales 목에 속하는 방선균군의 계통학적 특성을 검토하기 위하여 PCA (principal component analysis) 분석하였다.
- 특히, Actinobacteria 은 총 6목 35과 121속의 다양한 방선균이 분포하였으며, 전체 방선균군집의 83%가 Actinomycetales 목으로 확인되었다. 이들 Actinomycetales 목은 28개 과로 구성되었으며, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae 그리고 Streptomycetaceae는 조릿대 대나무림의 낙엽층과 근권토양에서 풍부도가 가장 높고 변이가 적은 대표 방선균군집으로 확인되었다.
- 본 연구에서 대용량의 염기서열을 분석할 수 있는 454 pyrosequencing 기법으로 염기서열을 분석한 결과, 조릿대 대나무림 토양 시료 내에는 6목 36과 121속을 포함하는 다양한 방선균군집이 분포해 있음을 확인하였다. 이들 방선균 군집의 83% 가 Actinomycetales 목에 속하였으며, Pseudonocardiaceae, Micromonosporaceae 그리고 Streptomycetaceae은 조릿대 대나무림의 대표 방선균군집으로 확인되었다. 이상 pyrosequencing기법을 통해 확인된 조릿대 대나무림의 낙엽층과 근권토양 내 방선균군집의 계통해석 결과는 향후 방선균 유전자원의 다양성 확보를 위한 기반연구가 되리라 기대한다.
- edu/)에 등록된 방선균표준균주는 338속이 보고되었다. 이들 방선균 표준균주 중 Streptomyces 속이 약 70%, Micromonospora 속이 11%, Nocardia 속이 6%로 확인되었다. Lechevalier 등(1970)은 16종의 토양으로부터 5,000주의 방선균을 분리 동정하여 Streptomyces 속 방선균이 95%를 차지함을 보고한 바 있으며, Kim 등(1997)은 산림, 밭 초지, 논 등 다양한 토양에서 Streptomyces 속을 제외한 희소 방선균은 30–40%를 차지한다고 밝힌바 있다.
- 이상 조릿대 대나무토양 내 전체 방선균군집의 83% 차지하는 Actinomycetales 목은 28개 과로 세분류되었으며, Amycolatopsis, Pseudonocardia, Actinophytocola, Actinomycetospora 속을 포함하는 Pseudonocardiaceae와 Catenuloplanes, Actinoplanes, Dactylosporangium 속을 포함하는 Micromonosporaceae 그리고 Streptomyces 속을 포함하는 Streptomycetaceae는 낙엽층과 근권토양에서 변이가 적고 높은 분포율을 나타내는 대표 방선균군집으로 확인되었다.
- 1). 이상의 결과로부터, 조릿대 대나무림 내 주요 세균 군집은 Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria 그리고 Acidobacteria로 확인되었다.
- 전체 세균군집의 16–20%를 차지하는 Bacteriodetes 계통 군의 경우, Chitinophagaceae는 시료간 P < 0.015의 높은 유의성을 나타내어 낙엽층과 근권토양의 주요 세균군집으로 평가되었다.
- 전체 세균군집의 4–14%를 차지하는 방선균군집은 총 35개 과로 구성되었으며, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae 그리고 Streptomycetaceae는 낙엽층과 근권토양에서 높은 비율로 존재하고 토양간 P < 0.015의 높은 유의성을 나타내는 대표 방선균군집으로 확인되었다.
- 낙엽층 내 세균군집은 19개 문으로 분류되었다. 전체 염기서열의 약 60.0%가 Proteobacteria 문이었으며, Bacteriodetes (20.0%),Actinobacteria (14.1%) 그리고 Acidobacteria (4.1%)가 4% 이상 차지하는 주요군집으로 확인되었다. 근권토양 내에는 20개의 phyla와 15개의 미동정 phyla로 분류되었다.
- 대나무림 토양시료 내 세균군집은 총 35개의 문으로 구성되었으며, Proteobacteria (51–60%), Bacteroidetes(16–20%), Acidobacteria (4–16%) 그리고 Actinobacteria (4–14%) 계통군이 주요 세균군집으로 확인되었다. 특히, Actinobacteria 은 총 6목 35과 121속의 다양한 방선균이 분포하였으며, 전체 방선균군집의 83%가 Actinomycetales 목으로 확인되었다. 이들 Actinomycetales 목은 28개 과로 구성되었으며, Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae 그리고 Streptomycetaceae는 조릿대 대나무림의 낙엽층과 근권토양에서 풍부도가 가장 높고 변이가 적은 대표 방선균군집으로 확인되었다.
- 015의 높은 유의성을 나타내는 대표 방선균군집으로 확인되었다. 한편, Dermacoccaceae, Dietziaceae, Frankiaceae 그리고 Microbacteriaceae 계통군은 낙엽층에서 보여지는 특징적인 계통군으로 확인되었으며, Acidimicrobiaceae, Iamiaceae, Acidothermacea, Dermabacteraceae, Geodermatophilaceae, Gaiellaceae, Thermoleophilaceae 그리고 Euzebyaceae는 근권토양에서 보여지는 특징적인 방선균 군집으로 확인되었다(Fig. 2D).
후속연구
- 이들 방선균 군집의 83% 가 Actinomycetales 목에 속하였으며, Pseudonocardiaceae, Micromonosporaceae 그리고 Streptomycetaceae은 조릿대 대나무림의 대표 방선균군집으로 확인되었다. 이상 pyrosequencing기법을 통해 확인된 조릿대 대나무림의 낙엽층과 근권토양 내 방선균군집의 계통해석 결과는 향후 방선균 유전자원의 다양성 확보를 위한 기반연구가 되리라 기대한다.
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