[논문]재조합 대장균에서 새로운 코엔자임 에이 트랜스퍼레이즈를 이용한 젖산을 모노머로 함유한 폴리하이드록시알칸산 생산 연구

김유진; 채철기; 강경희; 오영훈; 주정찬; 송봉근; 이상엽; 박시재

doi:10.7841/ksbbj.2016.31.1.27

[국내논문] 재조합 대장균에서 새로운 코엔자임 에이 트랜스퍼레이즈를 이용한 젖산을 모노머로 함유한 폴리하이드록시알칸산 생산 연구
Biosynthesis of Lactate-containing Polyhydroxyalkanoates in Recombinant Escherichia coli by Employing New CoA Transferases 원문보기

KSBB Journal, v.31 no.1, 2016년, pp.27 - 32

김유진 (명지대학교 환경에너지공학과) , 채철기 (명지대학교 환경에너지공학과) , 강경희 (한국화학연구원 바이오화학연구센터) , 오영훈 (한국화학연구원 바이오화학연구센터) , 주정찬 (한국화학연구원 바이오화학연구센터) , 송봉근 (한국화학연구원 바이오화학연구센터) , 이상엽 (한국과학기술원 생명화학공학과) , 박시재 (명지대학교 환경에너지공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Several CoA transferases from Clostridium beijerinckii, C. perfringens and Klebsiella pneumoniae were examined for biosynthesis of lactate-containing polyhydroxyalkanoates (PHAs) in recombinant Escherichia coli XL1-Blue strain. The CB3819 gene and the CB4543 gene from C. beijerinckii, the pct gene from C. perfringens and the pct gene from K. pneumoniae, which encodes putative CoA transferase gene, respectively, was co-expressed with the Pseudomonas sp. MBEL 6-19 phaC1437 gene encoding engineered Pseudomonas sp. MBEL 6-19 PHA synthase 1 ($PhaC1_{Ps6-19}$) to examine its activity for the construction of key metabolic pathway to produce poly(3-hydroxybutyrate-co-lactate) [P(3HB-co-LA)]. The recombinant E. coli XL1-Blue expressing the phaC1437 gene and CB3819 gene synthesized poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] homopolymer to the P(3HB) content of 60.5 wt% when it was cultured in a chemically defined medium containing 20 g/L of glucose and 2 g/L of sodium 3-hydroxybutyrate. Expression of the phaC1437 gene and CB4543 gene in recombinant E. coli XL1-Blue also produced P(3HB) homopolymer to the P(3HB) content of 51.2 wt% in the same culture condition. Expression of the phaC1437 gene and the K. pneumoniae pct gene in recombinant E. coli XL1-Blue could not result in the production of PHAs in the same culture condition. However, the recombinant E. coli XL1-Blue expressing the phaC1437 gene and the C. perfringens gene could produce poly(3-hydroxybutyrate-co-lactate [P(86.4mol%3HB-co-13.7 mol%LA) up to the PHA content of 10.6 wt% in the same culture condition. Newly examined CoA transfereases in this study may be useful for the construction of engineered E. coli strains to produce PHA containing novel monomer such lactate.

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AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 대장균을 비롯한 여러 미생물에서 lactate 및 hydroxycarboxylic acid를 모노머로 함유한 PHA를 보다 효율적으로 합성하기 위해 lactyl-CoA를 합성할 수 있는 새로운 코엔자임에이 트랜스퍼레이즈를 탐색하였다. Pseudomonas sp.
최근, 본 연구그룹은 C. propionicum 유래 propionyl-CoA transferase를 이용해서 lactate를 모노머로 함유한 PHA에 대한 합성을 연구해왔다. 대장균을 비롯한 여러 미생물에서 lactate 및 다른 hydroxycarboxylic acid를 모노머로 함유한 PHA를 합성하기 위해서는 lactate 및 hydroxycaboxylic acid를 lactylCoA 및 hydroxyacyl-CoA로 전환하는 CoA transferase가 필수적으로 이용된다.
따라서 효율적 으로 lactate를 비롯한 2-hydroxyacid를 모노머로 함유하는 PHA를 합성하기 위해서는 lactyl-CoA 및 2-hydroxyacylCoA를 생산하는 활성이 높은 CoA transferase를 이용해야 한다. 이와 같은 이유로 본 연구에서는 기존에 사용했던 C. propionicum 유래 propionyl-CoA transferase이외에 lactate를 모노머로 함유한 PHA합성에 이용할 수 있는 다른 유래의 CoA transferase를 탐색하고자 하였다. BLAST 탐색을 통해 정보를 얻은 C.
본 연구진은 lactate를 모노머로 함유한 PHA를 합성하기 위한 대사경로 제작을 위하여 새로운 코엔자임 에이트랜스퍼 레이즈를 탐색하였으며, P(3HB-co-LA) 및 P(3HB)를 합성하는 재조합 대장균 시스템을 개발하였다. 본 연구진이 개발한 새로운 코엔자임에이 트랜스퍼레이즈를 이용한다면 다양한 모노머 조성을 지닌 lactate가 함유된 고분자를 생산할 수 있어, 다양한 물성을 지닌 lactate 모노머 함유 고분자를 합성할 수 있을 것으로 기대된다.

제안 방법

Ampicillin (Ap, 50 μg/mL)을 균주의 플라스미드의 안정성을 위하여 배지에 첨가하였다.
PHA의 농도와 PHA 모노머의 조성을 fused silica capillary column (Supelco SPBTM-5, 30 m × 0.32 mm ID 0.25 mm film, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (6890N GC System, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)로 benzoic acid methyl ester를 internal standard로 사용하여 분석하였다 [12].
Pseudomonas sp. 6-19 PHA synthase 변이체와 새롭게 탐색한 코엔자임에 이 트랜스퍼레이즈로 E. coli XL1-Blue를 형질 전환하여 재조합 대장균을 제작하였고 (Fig. 1), 제작된 재조합 대장균을 이용하여 P(3HB-co-LA)합성대사회로를 구축하여, P(3HBco-LA) 및 P(3HB)의 생산능을 확인하였다.
Pseudomonas sp. 6-19 PHA synthase 유전자 phaC1437과 새로운 코엔자임 에이 트랜스퍼레이즈 유전자를 발현하는 플라스미드를 제작하기 위해서 p619C1437-pct540을 SbfI과 NdeI으로 절단하여 pct540 유전자를 제거한 후에 C. beijerinckii CB3819 유전자와 CB4543 유전자, C. perfringens pct 유전자, Klebsiella pneumoniae pct 유전자를 SbfI과 NdeI으로 p619C1437-pct540에 삽입하여 pct540유전자를 치환하였다. 각각의 벡터는 p619C1437-CB3819, p619C1437-CB4543, p619C1437-CpfPct, p619C1437-KpPct로 명명하였다.
클로닝작업을 위해서 대장균 XL1-Blue는 Luria-Bertani (LB) medium (리터당: 10 g tryptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl 함유)에서 37°C로 배양하였다. PHA의 생산을 위하여 p619C 1437-CB3819, p619C1437-CB4543, p619C1437-CpfPct, p619 C1437-KpPct를 함유한 재조합 대장균 XL1-Blue 균주를 100 mL의 MR medium을 함유하고 있는 250 mL 플라스크에서 96시간 동안 배양하였다. 이때, 2 g/L의 sodium 3-hydroxybutyrate (3HB sodium salt, Acros organics, Geel, Belgium)를 3- hydroxybutyryl-CoA (3HB-CoA)의 기질로 제공하기 위해 MR medium에 첨가하였다.
propionicum 유래 propionyl-CoA transferase이외에 lactate를 모노머로 함유한 PHA합성에 이용할 수 있는 다른 유래의 CoA transferase를 탐색하고자 하였다. BLAST 탐색을 통해 정보를 얻은 C. propionicum 유래 propionyl-CoA transferase와 유사성이 높은 C. perfringens pct 유전자를 비롯해 C. beijerinckii에서 CoA transferase로 annotation된 두 유전자 CB 3819, CB4543와 K. pneumoniae에서 CoA transferase로 annotation된 pct 유전자를 lactate를 모노머로 함유한 PHA생산에 적용하여 실험하였다. 탐색된 CoA transferase의 클로닝을 위하여 해당 미생물의 크로모좀으로 부터 CoA transferase유전자를 PCR 증폭을 통하여 얻었다.
pneumoniae에서 CoA transferase로 annotation된 pct 유전자를 lactate를 모노머로 함유한 PHA생산에 적용하여 실험하였다. 탐색된 CoA transferase의 클로닝을 위하여 해당 미생물의 크로모좀으로 부터 CoA transferase유전자를 PCR 증폭을 통하여 얻었다. C.
perfringens pct 유전자의 증폭을 위하여 5'-cctgcaggttccctcccgtttccattgaaaggactacaca atggtaagagttagtttttt 와 5'-catatg ttatttaagtcccataagct를 사용하였다. 증폭된 유전자를 각각 SbfI과 NdeI으로 절단한 후 SbfI과 NdeI으로 절단한 p619C1437-pct540에 pct540을 제거하면서 삽입하여 각 유전자를 발현하는 플라스미드를 제작하였다 (Fig. 2)
각각의 CoA transferase를 이용한 P(3HB-co-LA) 합성대사회로 구축을 확인하기 위하여, p619C1437-CB3819, p619C 1437-CB4543, p619C1437-CpfPct, p619C1437-KpPct로 E. coli XL1-Blue를 각각 형질전환하여 재조합 대장균을 제작하 였다. 제작된 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-CB3819), 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-CB4543), 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-CpfPct), 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-KpPct)를 2 g/L의 sodium 3-hydroxybutyrate 가 함유된 MR medium에서 20 g/L의 글루코스를 탄소원으로 이용하여 30^oC에서 96시간 동안 배양하였다 (Table 2).
coli XL1-Blue를 각각 형질전환하여 재조합 대장균을 제작하 였다. 제작된 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-CB3819), 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-CB4543), 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-CpfPct), 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-KpPct)를 2 g/L의 sodium 3-hydroxybutyrate 가 함유된 MR medium에서 20 g/L의 글루코스를 탄소원으로 이용하여 30^oC에서 96시간 동안 배양하였다 (Table 2). 이러한 배양조건에서 PHA synthase의 기질인 3HB-CoA는 배양액에 첨가된 3HB가 propionyl-CoA transferase에 의해 3HBCoA로 전환되어 생성되며, 또 다른 기질인 lactyl-CoA는 자연적인 lactate 합성회로를 이용하여 글루코스로부터 생산된 lactate가 propionyl-CoA transferase에 의해 lactyl-CoA로 전환되어 생성된다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 균주와 플라스미드를 Table 1에 정리하였다. 플라스미드 제작을 위하여 대장균 XL1-Blue를 호스트 균주로 이용하였다. 새로운 코엔자임 에이 트랜스퍼레이즈를 이용한 P(3HB-co-LA)의 생산실험을 위하여 대장균 XL1-Blue를 호스트 균주로 사용하였다.
플라스미드 제작을 위하여 대장균 XL1-Blue를 호스트 균주로 이용하였다. 새로운 코엔자임 에이 트랜스퍼레이즈를 이용한 P(3HB-co-LA)의 생산실험을 위하여 대장균 XL1-Blue를 호스트 균주로 사용하였다. 플라스미드 p619C1437-pct540은 E130D, S325T, S477G, Q481K의 총 4개의 아미노산의 변이가 가해진 Pseudomonas sp.
이때, 2 g/L의 sodium 3-hydroxybutyrate (3HB sodium salt, Acros organics, Geel, Belgium)를 3- hydroxybutyryl-CoA (3HB-CoA)의 기질로 제공하기 위해 MR medium에 첨가하였다. 탄소원으로는 20 g/L의 글루코스를 사용하였다. MR medium (pH 7.
C. beijerinckii의 CB3819 유전자를 증폭하기 위하여 5'-cctgcaggttccctcccgtttccattgaaa ggactacacaatgaagtcaaaggtaatctctat와 5'-catatg ctatttaaacatattttcatcc의 프라이머를 사용하였으며 C. beijerinckii의 CB4543 유전자를 증폭하기 위하여 5'-cctgcaggttccctcccgtttccattgaaag gactacaca atgagaaaagtaaaagttttaac와 5'-catatg ttactcccttaatccc atcaac의 프라이머를 사용하였다.
C. perfringens pct 유전자의 증폭을 위하여 5'-cctgcaggttccctcccgtttccattgaaaggactacaca atggtaagagttagtttttt 와 5'-catatg ttatttaagtcccataagct를 사용하였다.
K. pneumoniae에서 pct유전자의 증폭을 위하여 5'-cctgcaggttccctcccgtttccattgaaaggactacaca atgagcagcaaatttatcgacg와 5'-catatg ttatgagtcagaggatgaa ttc를 사용하였다.

데이터처리

플라스크 배양은 진탕배양기에서 250 rpm과 30^oC에서 수행하였다. 결과는 세 번 반복하여 평균값을 구하였다. Ampicillin (Ap, 50 μg/mL)을 균주의 플라스미드의 안정성을 위하여 배지에 첨가하였다.

이론/모형

25 mm film, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (6890N GC System, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)로 benzoic acid methyl ester를 internal standard로 사용하여 분석하였다 [12]. 건조균체중량 (dry cell weight per liter of culture broth)은 기존에 보고된 방법으로 측정하였다 [13]. PHA content (wt%)는 건조균체중량과 PHA 농도의 비율로 정의된다.

후속연구

또한, 재조합 대장균 XL1-Blue (p619C1437-KpPct)은 같은 배양조 건에서 고분자를 전혀 합성하지 못하였다. C. perfringens 유 래 CoA transferase를 사용하였을 때 획득한 고분자의 축적률 10.6 wt%는 개량된 C. propionicum 유래 propionyl-CoA transferase (Pct540)보다는 낮은 수치이지만, 야생형 C. propionicum 유래 propionyl-CoA transferase (Pct)와는 비슷한 수치이기 때문에 [9], 향후 위의 결과를 토대로 C. perfringens 유래 CoA transferase를 개량한다면 효율적으로 lactate가 함유된 PHA를 합성하는데 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 C.
perfringens 유래 CoA transferase를 개량한다면 효율적으로 lactate가 함유된 PHA를 합성하는데 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 C. beijerinckii CB3819 유전자와 CB4543 유전자는 lactate가 포함되지 않은 PHA를 합성하는데 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구진은 lactate를 모노머로 함유한 PHA를 합성하기 위한 대사경로 제작을 위하여 새로운 코엔자임 에이트랜스퍼 레이즈를 탐색하였으며, P(3HB-co-LA) 및 P(3HB)를 합성하는 재조합 대장균 시스템을 개발하였다. 본 연구진이 개발한 새로운 코엔자임에이 트랜스퍼레이즈를 이용한다면 다양한 모노머 조성을 지닌 lactate가 함유된 고분자를 생산할 수 있어, 다양한 물성을 지닌 lactate 모노머 함유 고분자를 합성할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	PHA가 PLA, PBS와의 차이점은 무엇인가?	PHA는 PHA 생산능력을 지닌 미생물이 탄소원은 과도하게 있으나 생장에 적합하지 않은 생장 환경에 놓여있을 때, 미생물 내부에 에너지 및 환원력을 비축하기 위해 저장하는 물질이다 [2]. PHA는 고분자의 모노머는 미생물의 발효공정으로 생산하고, 고분자 합성은 발효 공정을 통해 생산한 고분자 모노머의 화학공정을 통해 생산하는 PLA와 PBS와는 달리, 모노머의 합성부터 고분자 합성까지 미생물의 대사회로에 의해 미생물 체내에서 이루어지는 천연폴리에스터이다. 기존의 폴리에스터는 자연계에서 분해되지 않아 환경문제를 일으키지만, PHA는 미생물에 의해 완전히 생분해되어 친환경적이다.
	PLA의 장점 및 단점은 무엇인가?	[2, 3]. PLA 또한 생분해성이며 퇴비화가 가능하며 인간에게 독성이 적다는 장점을 지니고 있으나, 현재 PLA의 합성공정은 락타이드를 ROP (ring opening polymerization)를 통해 중합하기 때문에 간단하지 않다는 문제가 있다. 또한 PLA의 물성이 잘 부러지고 뻣뻣하다는 단점이 있다.
	PLA의 물성에 따른 단점을 보완하기 위해 수행되는 연구는 무엇인가?	또한 PLA의 물성이 잘 부러지고 뻣뻣하다는 단점이 있다. 이를 보안하기 위하여 락테이트와 같은 2-하이드록시카르복실산을 모노머로 포함하는 PHA를 생산하는 연구가 활발히 수행되어, PLA 와 PLA공중합체를 PHA와 같이 미생물 내에서 합성하는 것이 가능해졌다 [4-11]. 또한 위와 같은 모노머의 조합을 통해 다양한 물성을 갖는 PLA 공중합체의 합성이 가능해졌다 [4- 11].

참고문헌 (13)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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