[보고서]유전자기술을 활용한 젖소 유방염 원인균 탐색 및 박테리오파지를 이용한 치료용 물질 개발

권혁준

[국가R&D연구보고서] 유전자기술을 활용한 젖소 유방염 원인균 탐색 및 박테리오파지를 이용한 치료용 물질 개발
Molecular screening of mastitis bacteria of cow and development of therapeutic bacteriophages and lysins 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	서울대학교 Seoul National University
연구책임자	권혁준
참여연구자	김단일 , 김은경 , 성원진 , 고대성 , 김남형 , 최은희 , 김예실
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2018-02
과제시작연도	2017
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
연구관리전문기관	농촌진흥청 Rural Development Administration
등록번호	TRKO201800043141
과제고유번호	1395050559
사업명	친환경안전농축산물생산기술
DB 구축일자	2018-11-24
키워드	젖소.유방염.마이크로비옴.분자진단.유방염치료제.cow.mastitis.microbiome.molecular diagnosis.mastitis ointment.
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201800043141

초록 ▼

본 과제를 통해 주요 유방염 원인균 확보 및 감수성 항생제 선정하였고, 유방염과 1등급 원유내 마이크로비옴 차이 규명하였으며 분자진단법 개발 및 원인균 분자동정/역학 연구기법 확립함. 국내 유방염 유래 S. aureus 주요 유전형 3종 게놈 분석하였고, 악성 S. aureus 농장유입 및 개체 간 전파 저감 정책을 수립하였으며 다약제 내성 K. oxytoca 특이 박테리오파지 확보함. 인공리신 2의 S. uberis 효능 확인 및 수용성 재조합 단백질 생산하였고, 유방염 치료제 조성 2종 확보 및 동물약품 허가신청 착수함.

Abstract ▼

□ Purpose& Contents
This research work was aimed at development of rapid molecular diagnosis methods and prophylactic/therapeutic reagents containing phage or artificial lysins. To fulfill the aims we isolated and identified bacteria causing bovine mastitis, tested antibiotics susceptibility, then finally determined major bacteria for molecular diagnosis and therapy. We determined the nucleotide sequences of rpoB genes of major bacteria and established rpoB sequence databases by adding rpoB genes of reference strains in the GenBank. On the basis of the rpoB database we designed the major bacteria-specific primer sets for the molecular diagnosis of bovine mastitis. We found antibacterial activity of egg white and lysozyme(from egg white) against the major bacteria and tested antibacterial activity of lysins found in the genome of the major bacteria by using in vitro transcription and translation combined colony reduction tests. We isolated lytic bacteriophages which lyse the major bacteria and characterized their biological traits. We successfully expressed and purified soluble recombinant artificial lysin 2 (ALS 2) from E. coli and found it has also antibacterial activity against Streptococcus uberis. We developed two kinds of mastitis ointment compositions, and planned for the ointments to be approved from APQA.

□ Results
1. Isolation and identification of the major mastitic bacteria and selection of common, efficacious antibiotics
2. Demonstration of microbiomic differences between mastitic and the 1st-class raw milk
3. Development of molecular diagnosis, molecular species identification and epidemiological study methods
4. Genomic analysis of 3 major genotypes of S. aureus
5. Development of policy to control incurable S. aureus
6. Isolation of lytic bacteriophages against multidrug-resistant K. oxytoca
7. Production of recombinant ALS 2 efficacious against S. uberis
8. Development of mastitis ointments compositions for approval of APQS

□ Expected Contribution
1. Collected mastitic bacteria: useful for antibiotics susceptibility test, phage isolation and vaccine seeds (e.g. S. aureus 3 strains with genome sequences)
2. Methods of molecular diagnosis, identification and molecular epidemiological study: useful kit development and database establishment
3. Lytic bacteriophage against K. oxytoca: useful as a biological disinfectant
4. Two mastitis ointment is going to be subjected to approval of APQS
5. Development of mutated lysozyme with enhanced antibacterial activity;development of anti-mastitis cows with increased concentration of mutated lysozyme
6. Policy suggestion to control incurable S. aureus

(출처 : Summary 5p)

목차 Contents

표지 ... 1
제 출 문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
국 문 요 약 문 ... 4
Summary ... 5
목차 ... 6
제 1 장 연구 개발 과제의 개요 ... 7
제1절 연구 개발 목적 ... 7
제2절 연구 개발의 필요성 ... 7
제3절 연구 개발 범위 ... 11
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 12
제 3 장 연구 수행 내용 및 결과 ... 14
제 4 장 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 98
제1절 : 목표대비 달성도 ... 98
제2절 : 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 99
제 5 장 연구 결과의 활용 계획 ... 100
제 6 장 연구 과정에서 수집한 해외 과학 기술 정보 ... 102
제 7 장 연구 개발 결과의 보안 등급 ... 104
제 8 장 국가과학기술지식정보서비스에 등록한 연구시설·장비 현황 ... 105
제 9 장 연구개발과제 수행에 따른 연구실 등의 안전조치 이행실적 ... 106
제 10 장 연구개발과제의 대표적 연구실적 ... 107
제 11 장 기타사항 ... 108
제 12 장 참고문헌 ... 109
끝페이지 ... 115

표/그림 (29)

표 파지리신에 의해 세포벽이 약회되어 내부 팽압으로 세포막이 부풀어 올라 파열 직전의 현미경 사진
표 파지 리신의 세포벽 작용점 및 기능
표 파지와 리신의 기존 항생제 대비 장단점
표 연차별 연구개발범위
표 Antibiotics resistance of major bovine mastitis bacteria
표 Antibiotics susceptibility test of S. aureus isolates from raw milk speciments
표 Amplification of a methicillin resistance gene, mecA by PCR. A, PMB2; B, PMB4; C, PMB5; D, PMB8; E, PMB9; F, PMB36; G, PMB46; P, MRSA11069; P, MRSA3713
표 16S rDNA metagenome sequencing
표 Comparison of microbiota of mastitis and normal raw milk samples by 16S rRNA pyrosequencing
표 Comparison of microorganism in mastitis milk by 16S rRNA pyrosequencing- and culture-based identification
표 rpoB sequence typing
표 Phylogenetic analysis of the complete rpoB sequences of 90 representative RSTs and consensus sequence of S. aureus. The phylogenetic tree was constructed by using the neighbour-joining method (p-distance and 1,000 bootstrapping replicates) with MEGA software (ver. 7). The bovine isolates analysed in this study are marked with closed circles
표 Molecular typing of rpoB sequence types (RSTs) and prophage types (PPTs) of S. aureus strains from bovine mastitis
표 Real and in silico molecular typing of rpoB sequence types (RSTs) and prophage types (PPTs) of S. aureus strains in GenBank (n=180)
표 Amino acid changes of RpoB in rpoB sequence types (RSTs) of S. aureus
표 Primer sets for PCR and sequencing of terminase (large subunit) genes
표 Amplification of terminase large subunit genes of prophage groups, 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, and 10. Amplicons of prophage group 5 and 12 are not shown because positive bovine isolates and human strains are not available. Lanes M (1 kb marker), 1 (prophage group 1, 1585 bp), 2 (prophage group 2, 1212 bp), 3 (prophage group 3, 813 bp), 4 (prophage group 6, 575 bp), 5 (prophage group 7, 895 bp), 6 (prophage group 8, 1116 bp), 7 (prophage group 9, 1223 bp), 8 (prophage group 10, 1769 bp)
표 Evolution of S. aureus on dairy farm by acquiring temperate phages. The first, second, and third numbers of each isolate name identify the farm, individual cow, and udder, respectively. mPPT (molecular prophage type), +pp (acquisition of prophage)
표 Virulence genes of prophage groups 3 and 7. The staphylokinase (panel A) and chemotaxis inhibiting gene (panel B) were detected by PCR. Panel A, M: marker (100 bp), 1 (PMB 81-1), 2 (PMB 232-1), 3 (PMB 67-1), 4 (PMB 177-1), 5 (PMB 188-1), 6 (PMB 196-1), 7 (PMB 208-1); panel B, M (100 bp marker), 1 (PMB 67-1), 2 (PMB 177-1), 3 (PMB 188-1), 4 (PMB 196-1), 5 (PMB 208-1)
표 General genomic features of S. aureus isolates from bovine mastitis
표 Primer sets for rpoB PCR and sequencing
표 Identification of CNS by VITEK2, 16S rRNA gene and rpoB sequencing
표 Molecular detection of major mastitic bacteria in raw milk specimens
표 Susceptibility of major bovine mastitis bacteria to chicken egg white, lysozyme and duck egg white
표 Construction of artificial lysin 2 (upper, ALS2) and 3(lower).
표 Antibacterial activity of ALS2 against S. aureus, S. uberis and E. faecalis
표 Comparison of amino acid sequences of genomic and phage amidases
표 Purification of soluble recombinant ALS2
$Antibacterial efficacy of soluble fraction of recombinant ALS2 expressed in different induction conditions$ 표 Antibacterial efficacy of soluble fraction of recombinant ALS2 expressed in different induction conditions

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