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문제 정의
- , 2001) 등 개발가능성이 매우 많은 식물인 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서는 산벚나무의 가지의 75% ethanol 추출물과 용매 분획별 항산화 활성, nitric oxide 생성억제능과 피부질환 중 여드름 원인균에 대한 항균활성 등을 조사하여 산벚나무 가지를 이용한 피부 관련 기능성 소재 개발의 가능성을 살펴보고자 한다.
제안 방법
- 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하여 항산화 활성을 비교하였다 (Blois, 1958). MeOH에 일정농도로 용해시킨 시료액 20 ㎕ 와 MeOH에 200 µM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였다.
- 7 세포를 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화를 시킨 후, 다양한 농도로 조제한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 2.5 ㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액 (in PBS)을 각 well에 20 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 생성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 100 ㎕ 의 DMSO를 첨가하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 well의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 1 - 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합하여 150분 동안 25℃에서 반응시켰다. 30% acetic acid에 용해시킨 1% sulfanilamide 60 ㎕를 혼합하고 5분후 60% acetic acid에 용해시킨 0.1% N-(naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride 60 ㎕를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 520㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 NO를 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였으며, positive control로 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- Disc diffusion assay를 이용하여 산벚나무 가지 추출물과 분획의 항균활성을 비교하였다. 계대 배양된 각 균주 배양액(107 - 108 CFU/㎖)을 100 ㎕씩 항균시험용 평판배지에 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하였고, 시료를 6 ㎜의 paper disc에 1.
- 한편, 페놀성 화합물중 여러 기능성을 가지는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 flavonoid 함량을 측정하였다. MeOH에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 100 ㎕ 와 1 M potassium acetate 20 ㎕, 10% aluminium nitrate 20 ㎕, MeOH 860 ㎕를 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 사용한 rutin을 MeOH에 0 - 500 ㎍/㎖의 다양한 농도로 용해시켜 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- MeOH에 일정농도로 용해시킨 시료액 20 ㎕ 와 MeOH에 200 µM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였다.
- 계대 배양된 각 균주 배양액(107 - 108 CFU/㎖)을 100 ㎕씩 항균시험용 평판배지에 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하였고, 시료를 6 ㎜의 paper disc에 1.0, 5.0 ㎎이 되도록 천천히 흡수시킨 뒤 건조한 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 24시간 배양한 후 disc를 중심으로 생성된 생육저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
- 5 ㎎/㎖의 농도로 제조한 MTT 용액 (in PBS)을 각 well에 20 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 생성된 formazan 결정을 용해시키기 위하여 100 ㎕ 의 DMSO를 첨가하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 well의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 40%의 수율로 추출물을 획득하였고, 이중 일부를 증류수에 분산시킨 후 chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 사용하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과, 농축 및 동결건조하여 분말화하였다. 추출물과 분획물은 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 분획수율은 BuOH 분획 (BF)과 Aqueous 분획 (AF)이 각각 39.
- 1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in H2O)를 혼합하여 상온에서 10분간 반응시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 PBS를 가하여 blank를 측정하였으며, 표준물질로 sodium nitrite를 농도별로 희석하여 시료액과 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 작성한 검량선을 이용하여 NO 생성량을 산출하였다 (Ding et al., 1988).
- 건조된 산벚나무 가지를 마쇄한 후 75% Ethanol (EtOH)을 이용하여 80℃에서 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과, 농축 및 동결건조를 실시하여 9.40%의 수율로 추출물을 획득하였고, 이중 일부를 증류수에 분산시킨 후 chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 사용하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과, 농축 및 동결건조하여 분말화하였다.
- 표준물질인 tannic acid를 MeOH에 0 - 500 ㎍/㎖의 다양한 농도로 용해시켜 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 ㎎/g로 나타내었다. 한편, 페놀성 화합물중 여러 기능성을 가지는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 flavonoid 함량을 측정하였다. MeOH에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 100 ㎕ 와 1 M potassium acetate 20 ㎕, 10% aluminium nitrate 20 ㎕, MeOH 860 ㎕를 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- MeOH에 일정농도로 용해시킨 시료액 20 ㎕ 와 MeOH에 200 µM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 20분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하여 50%의 radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였다. Positive control로 천연 항산화제로 알려진 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 7은 BRC에서 분양 받은 것을 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, WelGENE, Gyeongsan, Korea) 에 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 혼합한 배지를 이용하여 실험에 사용하였다. 그 외 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)을 통하여 구입, 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 산벚나무 (Prunus sargentii)가지는 2011년 6월 전라남도 나주시 야산에 자생하는 산벚나무에서 분리한 것으로 수세하여 40℃에서 건조시킨 후 4℃ 이하로 냉장 보관하였으며, 표품은 동신대학교 생물자원산업화지원센터(BIC)에 보관되어 있다.
- 세포독성 시험과 NO 생성 억제실험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.7은 BRC에서 분양 받은 것을 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, WelGENE, Gyeongsan, Korea) 에 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA)과 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 혼합한 배지를 이용하여 실험에 사용하였다.
- 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양받은 Propionibacterium acnes (KCTC3314) 균주는 Reinforced Clostridial Medium (RCM, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)을, Staphylococcus aureus(KCTC3881), Staphylococcus epdermidis (KCTC1917) 균주는 nutrient broth 및 agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)를 이용하여 항균활성 실험에 사용하였다. 세포독성 시험과 NO 생성 억제실험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (means ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 75% EtOH 추출물 및 분획의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). 1 ㎎/㎖농도로 Methanol (MeOH)에 용해시킨 시료액과 FolinDenis reagent를 1:1로 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 동량의 10% Na2CO3를 혼합하여 1시간동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액을 취하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물 및 분획의 세포독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다 (Shin et al., 2003). 96 well plate에 1 × 104 cells/well의 농도로 배양된 Raw 264.
성능/효과
- 63 ㎜의 생육저해환을 형성함으로써 가장 높은 활성을 나타내었다. 1 ㎎/disc로 처리하였을 때에는 CF와 EF가 각각 11.70 ㎜와 17.19 ㎜의 생육저해환을 형성함으로써 10.58 ㎜의 생육저해환을 형성한 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. S.
- 2에 나타내었다. CF를 500 ㎍/㎖로 처리하였을 때, 세포 생존률이 15.90%로 독성을 나타냈으며, 추출물과 다른 분획의 경우에는 80% 이상의 세포 생존률을 보여줌으로써 세포독성을 나타내지 않았다.
- , 2004; Song and Lee, 2015). LPS로 염증반응이 유도된 Raw 264.7 cell에서 산벚나무 가지의 추출물과 분획의 NO 생성 억제활성을 측정한 결과 (Fig. 1), CF를 100 ㎍/㎖의 농도로 EF를 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 각각 268.58 pg/㎖, 238.38 pg/㎖의 NO를 생성함으로써 높은 NO 생성 억제능을 보여주었다. CF의 경우에는 500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때에도 268.
- epidermidis에 대한 항균활성에서 추출물, CF와 EF가 강력한 항균활성을 나타내었는데 CF의 항균활성은 세포독성에 기인한 항균활성으로 판단되어진다. NO 생성 억제 활성에서는 CF와 EF에서 높은 NO 생성 억제활성을 확인할 수 있었다. 하지만 CF를 고농도로 처리하였을 때, 세포독성이 확인되어 적절한 농도의 설정이 필요할 것으로 판단되었다.
- Disc diffusion assay를 활용하여 여드름 원인균에 대한 항균활성 비교한 결과를 Table 4에 나타내었다. P. acnes에 대한 항균활성 결과를 살펴보면, 5 ㎎/disc 농도로 처리하였을 경우 추출물은 16.08 ㎜ 의 생육저해환을 형성하였으며, EF가 20.63 ㎜의 생육저해환을 형성함으로써 가장 높은 활성을 나타내었다. 1 ㎎/disc로 처리하였을 때에는 CF와 EF가 각각 11.
- 70 ㎍/㎖인 추출물과 비슷한 수준의 활성을 보여주었다. Positive control의 SC50 값을 기준으로 비교한 relative activity에 나타난 바와 같이 추출물과 EF와 BF의 활성이 257.34 - 355.74%의 수준으로 positive control인 ascorbic acid보다 월등히 높은 수준의 NO 소거활성을 보여주었다.
- 58 ㎜의 생육저해환을 형성한 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균활성의 결과를 살펴보면 5 ㎎/disc 농도로 처리하였을 경우 EF에서 가장 큰 활성을 보여주었다. 하지만 여드름 원인균인 세 균주에 대한 CF가 가지는 항균활성은 세포독성에서 기인된 항균활성으로 사료되어진다.
- 산벚나무 가지의 추출물과 용매 분획별 시료의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과, 추출물 중 polyphenol 함량이 277.92 ㎎/g으로 나타났고, 용매 분획별 시료에서 EF와 BF의 함량이 각각 311.92 ㎎/g, 419.11 ㎎/g으로 추출물보다 높게 나타났으며, CF, AF의 함량은 각각 91.46 ㎎/g, 96.18 ㎎/g으로 추출물보다 현저히 낮은 함량을 보여주었다 (Table 1). Flavonoid 함량에서도 이와 유사한 양상으로 나타났는데, 추출물의 flavonoid 함량이 20.
- 이상의 결과에서 75% EtOH 추출물의 BF이 활성물질군인 polyphenol과 flavonoid 함량을 바탕으로 항산화 활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능과 NO 소거활성 측정에서 가장 높은 항산화 활성을 보여주었다. 여드름을 유발하는 원인균으로 밝혀진 P. acnes, S. aureus, S. epidermidis에 대한 항균활성에서 추출물, CF와 EF가 강력한 항균활성을 나타내었는데 CF의 항균활성은 세포독성에 기인한 항균활성으로 판단되어진다. NO 생성 억제 활성에서는 CF와 EF에서 높은 NO 생성 억제활성을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과에서 75% EtOH 추출물의 BF이 활성물질군인 polyphenol과 flavonoid 함량을 바탕으로 항산화 활성을 확인하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능과 NO 소거활성 측정에서 가장 높은 항산화 활성을 보여주었다. 여드름을 유발하는 원인균으로 밝혀진 P.
- 13 ㎍/㎖인 추출물보다 높은 활성을 보여주었다. 이와 같은 SC50 수치는 relative activity에 나타난 바와 같이 BF의활성이 135.62% 수준으로 positive control보다 높은 수준의 항산화 효과를 보여주었다.
- 하지만 여드름 원인균인 세 균주에 대한 CF가 가지는 항균활성은 세포독성에서 기인된 항균활성으로 사료되어진다. 이와 같은 항균활성은 산벚나무의 다른 부위인 잎 추출물 및 용매별 분획의 항균활성 (Yang et al., 2012)과 비교하였을 때, 산벚나무 가지 추출물 및 분획이 산벚나무 잎 추출물 및 분획보다 높은 활성을 보여줌으로써 활용가능성은 충분히 있는 것으로 판단되었다.
- 하지만 CF를 고농도로 처리하였을 때, 세포독성이 확인되어 적절한 농도의 설정이 필요할 것으로 판단되었다. 추출물과 BF의 경우에는 생성되어있는 NO를 소거하는 활성은 좋지만 NO의 생성을 억제하는 활성은 낮은 것으로 나타났다. 따라서 추가적인 연구를 진행한다면 산벚나무 가지 EF의 경우 여드름 원인균에 대한 항균활성을 이용한 기능성 소재로서 그리고 CF와 EF의 경우 항염증 관련 활성을 가지는 소재로서의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
- 58 pg/㎖의 NO 생성량을 보여주었지만 세포독성에 기인한 활성으로 확인되어 적절한 농도의 설정이 필요할 것으로 판단되었다. 추출물과 BF의 경우에는 이미 생성되어있는 NO를 소거하는 활성은 높지만, NO의 생성을 억제하는 활성은 소거하는 활성에 비해 낮은 것으로 판단되었다.
- 분획된 시료는 여과, 농축 및 동결건조하여 분말화하였다. 추출물과 분획물은 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였으며, 분획수율은 BuOH 분획 (BF)과 Aqueous 분획 (AF)이 각각 39.82%, 35.11%로 높게 나타났으며 CHCl3 분획 (CF)은 8.65%, EtOAc 분획 (EF)은 16.42%로 나타났다.
- 40 ㎎/g으로 추출물보다 높게 나타났다. 플라보노이드, 페놀산 등 페놀화합물을 다량 함유하고 있다고 알려진 베리류의 EtOH 추출물의 총 폴리페놀 함량을 살펴보면 아로니아G/블랙초크베리 (Aronia G, Aronia melanocarpa, GreenField s.c.)가 138.81 ㎎/g로 가장 높은 함량을 보여주었는데 이는 산벚나무 가지 추출물보다 2배정도 낮은 수치였다. 플라보노이드 함량도 총 폴리페놀 함량과 유사하게 베리류 중 가장 높은 함량을 보여준 아로니아G/블랙초크베리가 3.
후속연구
- 추출물과 BF의 경우에는 생성되어있는 NO를 소거하는 활성은 좋지만 NO의 생성을 억제하는 활성은 낮은 것으로 나타났다. 따라서 추가적인 연구를 진행한다면 산벚나무 가지 EF의 경우 여드름 원인균에 대한 항균활성을 이용한 기능성 소재로서 그리고 CF와 EF의 경우 항염증 관련 활성을 가지는 소재로서의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
- 36 ㎎/g으로 5배 정도 높은 함량을 나타내었다 (Li and Jeong, 2015). 이러한 결과는 산벚나무의 항산화 활성을 비롯하여 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 탐색하는 일차적인 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.
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