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문제 정의
- 하지만 식품 위해성 세균이나 식품 부패균에 대한 분획물의 항균활성을 확인하는 실험은 미비하였다. 따라서 본 연구에서는 지유의 추출물 및 분획물의 식중독 원인균에 대한 항균활성 및 항산화 활성을 검증하여 천연 식품첨가제로서의 이용 가능성을 탐색하는 기초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 5 ㎎이 되도록 천천히 흡수시켜 용매를 완전히 휘발시킨 후 평판배지에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양하였다. disc를 중심으로 생성된 저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
- 건조된 지유를 마쇄한 후 추출 용매를 methanol (MeOH)로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 (BUCHI, Flawil, Switzerland) 및 동결 건조 (Sam Won Industry, Seoul, Korea)를 실시하여 분말화하였고 추출물의 수율은 19.
- Louis, MO, USA) 60 ㎕를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다. 대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 지유 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). MeOH을 이용해 시료를 0.
- 33%이었다. 추출물 중 일부를 증류수에 분산시킨 후 순차적으로 chloroform, ethylacetate, nbutanol을 사용하여 용매분획을 실시하였으며, 획득된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 분획수율은 chloroform 분획물 (CF) 6.
- 그 후 원심분리하여 상등액 120 ㎕를 취하여 96 well plate에 옮겨 microplate reader (BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 사용하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 chlorogenic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 ㎎/g로 나타내었다.
대상 데이터
- 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다. 대조군으로 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 지유 (Sanguisorba officinalis L.)는 2013년 화림제약에서 건조된 것을 구입하여 4℃ 이하로 냉장보관하며 실험에 사용하였다. 표품은 동신대학교 생물자원산업화지원센터에 확인하여 보관하며 사용하였다.
- Moreno 등 (2000)의 방법을 변형하여 flavonoid 함량을 다음과 같이 측정하였다. 시료액 (1 ㎎/㎖ in MeOH) 100 ㎕, 10% aluminium nitrate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20 ㎕, 1 M potassium acetate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20 ㎕ 를 가하여 잘 혼합한 후 MeOH 860 ㎕를 첨가하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자연적으로 존재하는 대부분의 flavonoid는 대부분 배당체로 존재하기 때문에 (Peterson and Dwyer, 1998) 가장 흔하게 존재하는 flavonoid glycoside인 rutin (Sigma-Aldrich, St.
- 식중독 원인균을 대상으로 지유 추출물과 분획물을 disc diffusion assay를 이용하여 항균활성을 측정하였다. 항균활성 측정을 위해 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양받은 미생물 균주인 Staphylococcus aureus (KCTC3881), Bacillus cereus (KCTC1012), Vibrio vulnificus (KCTC 2959)를 사용하였으며, S. aureus와 B. cereus 균주는 Nutrient agar 및 broth (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였고, V. vulnificus 균주는 Heart Infusion (HI) agar 및 broth (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하였다. 항균시험용 평판배지는 107 - 108CFU/㎖로 희석한 배양액을 100 ㎕씩 분주한 후 멸균 면봉으로 도말하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 유의성을 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준 편차 (means ± SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS (Statistical pakage for social science, version 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 지유 추출물 및 분획물의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Folin and Denis, 1912). 시료액 (1 ㎎/㎖ in MeOH) 80 ㎕와 Folin-Denis reagent (SigmaAldrich, St.
- 식중독 원인균을 대상으로 지유 추출물과 분획물을 disc diffusion assay를 이용하여 항균활성을 측정하였다. 항균활성 측정을 위해 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양받은 미생물 균주인 Staphylococcus aureus (KCTC3881), Bacillus cereus (KCTC1012), Vibrio vulnificus (KCTC 2959)를 사용하였으며, S.
성능/효과
- 32 ㎜의 생육 저해환을 형성함으로서 ethanol 추출물보다 항균활성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 반면 그람 음성균인 V. vulnificus에서는 저농도인 0.5 ㎎/disc로 시료를 처리하였을 때 모든 시료에서 생육 저해환을 형성함으로써 지유의 추출물 및 분획물이 그람 양성균보다 그람 음성균에서 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 시료를 3 ㎎/disc로 처리하였을 때, 그람 양성균인 S.
- 91 ㎎/g으로 나타났다. 분획물의 경우 EF와 BF가 각각 538.93 ㎎/g, 433.30 ㎎/g으로 추출물보다 높은 함량을 보였다. Flavonoid 함량도 이와 유사한 양상으로 EF와 BF의 flavonoid 함량이 각각 23.
- 추출물 중 일부를 증류수에 분산시킨 후 순차적으로 chloroform, ethylacetate, nbutanol을 사용하여 용매분획을 실시하였으며, 획득된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 분획수율은 chloroform 분획물 (CF) 6.19%, ethylacetate 분획물 (EF) 34.10%, n-butanol 분획물 (BF) 26.44%, aqueous 분획물 (AF) 28.71%로 나타났다.
- 5 ㎎/disc로 시료를 처리하였을 때 모든 시료에서 생육 저해환을 형성함으로써 지유의 추출물 및 분획물이 그람 양성균보다 그람 음성균에서 높은 항균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 시료를 3 ㎎/disc로 처리하였을 때, 그람 양성균인 S. aureus와 B. cereus의 경우 EF가 각각 13.67 ㎜, 16.85 ㎜ 의 생육 저해환을 형성하면서 가장 높은 활성을 나타내었고, 그람 음성균인 V. vulnificus에서는 CF가 20.00 ㎜의 생육 저해환을 형성함으로써 가장 높은 활성을 보여주었다.
- 85 ㎍/㎖로 가장 높은 활성을 보였다. 이러한 결과를 양성대조군으로 사용된 L-ascorbic acid에 대한 상대적 활성으로 비교하면 CF를 제외한 모든 분획물이 L-ascorbic acid에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 특히 EF의 경우 양성 대조군보다 약 2.5배 높은 활성을 나타내었다 (Table 2). Kim 등 (2013) 이 보고한 소리쟁이 70% ethanol 추출물의 EtOAc 분획물이 L-ascorbic acid보다 2배정도 높은 활성을 보여준 것과 유사한 결과이다.
- 이상의 결과에서, 지유 MeOH 추출물의 EF가 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 높은 DPPH radical과 NO 소거 활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 식중독 원인균에 대한 항균활성을 측정한 결과 그람 양성군인 S. aureus와 B. cereus의 경우 EF가 가장 높은 활성을 나타낸 반면 그람 음성 균인 V. vulnificus에서는 CF가 가장 높은 활성을 보여줌으로써 항균활성을 가지는 기능성 소재로서의 개발이 가능할 것으로 판단되었다.
- , 2006). 지유 추출물 및 분획물을 6, 30, 150 ㎍/㎖의 농도로 조제하여 NO 소거능을 측정한 결과, 150 ㎍/㎖의 농도에서 모든 분획물과 추출물이 양성대조군인 L-ascorbic acid보다 높은 활성을 보였다. 특히 EF는 30 ㎍/㎖와 150 ㎍/㎖의 농도 차이에 의한 활성의 차이가 거의 없어 경제적인 활용 지표를 산출할 수 있었다 (Fig.
- ) 추출물과 분획물의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table 1에 제시하였다. 지유 추출물의 총 phenol성 화합물 함량은 337.91 ㎎/g으로 나타났다. 분획물의 경우 EF와 BF가 각각 538.
- 추출물과 분획물의 DPPH radical 소거 활성을 SC50 값으로 환산하면, 추출물은 6.86 ㎍/㎖ 의 값을 가졌으며, EF가 3.85 ㎍/㎖로 가장 높은 활성을 보였다. 이러한 결과를 양성대조군으로 사용된 L-ascorbic acid에 대한 상대적 활성으로 비교하면 CF를 제외한 모든 분획물이 L-ascorbic acid에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 특히 EF의 경우 양성 대조군보다 약 2.
- 1). 항산화 효과가 뛰어나다고 알려진 흑마늘 분획물과 NO 소거능을 비교한 결과 (Shin et al., 2010) 시료를 150 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 흑마늘과 지유의 EF가 각각 85.99%, 87.75%의 유사한 소거 활성을 나타냄으로써 천연 항산화 물질로의 활용가능성을 확인할 수 있었다.
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