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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 LDL receptor knock out (LDLr KO) 마우스 모델을 이용하여 부추 추출물의 경구 투여가 죽상경화증의 예방효과에 미치는 영향을 살펴보았다.
제안 방법
- 1주간 적응기간을 거친 LDLr KO 마우스에 2주간 AIN-76A diet 사료 (protein 20.8%, carbohydrate 67.7%, fat 11.5%)에 적응시킨 후 실험동물을 정상군 (NOR), 대조군(CON), 부추 추출물 100㎎/㎏ body weight 투여군 (AT100), 부추 추출물 300㎎/㎏ body weight 투여군 AT300)으로군 분리하여 실험에 사용하였다. 군 분리 후 정상군에는 기본사료를, 대조군 및 약물투여군에는 Western diet (D12079B, Research Diets Inc, New Brunswick, NJ)를 8주간 공급하였다 (Table 1).
- LDLr KO 마우스는 정상식이 시에는 죽상경화 병변을 나타내지 않지만 western diet를 섭취시킬 경우 죽상경화증를일으키며, apoE-/- 마우스와는 달리 고지질 식이를 할 경우, 사람과 비슷한 유형으로 콜레스테롤 수치가 올라가는 성향을 나타내기 때문에 본 연구에서 LDLr KO 마우스에 21% fat 을 포함한 Western diet를 8주간 진행하였다17-19). 그 결과 체중과 식이효율 변화에 있어서, 대조군에 비해 약물투여군 모두 체중과 식이효율에 감소하는 경향을 보였다.
- 군 분리 후 정상군에는 기본사료를, 대조군 및 약물투여군에는 Western diet (D12079B, Research Diets Inc, New Brunswick, NJ)를 8주간 공급하였다 (Table 1). Western diet 사료 (protein 20%, carbohydrate 50%, fat 21%)를 공급하여 약물투여군은 각각 100, 300㎎/㎏ body weight의 농도로 8주간 투여하였다. 식이섭취량 및 체중은 매주 일정한 시간에 측정하였으며, 식이효율 (food efficiency ratio, FER)은 식 (a)에 따라 계산하여 산출하였다.
- 간 조직에서의 조직병리학적 관찰을 수행하기 위해 간 조직을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 시행한 뒤 광학현미경위에서 특이 병변의 유무를 관찰하였다.
- 간 조직의 개선 활성을 직접적으로 확인하고자 간 조직 고정 후 H&E 염색을 하였다. 정상군의 간 조직(A)에서는 간세포가 정상적인 형태를 이루고 있지만 대조군(B)에서 정상군에 비해간 조직에서 지방 조직의 축적과 지방방울 (fat droplets)의 수가 크게 증가하였음을 관찰할 수 있었다.
- 5%)에 적응시킨 후 실험동물을 정상군 (NOR), 대조군(CON), 부추 추출물 100㎎/㎏ body weight 투여군 (AT100), 부추 추출물 300㎎/㎏ body weight 투여군 AT300)으로군 분리하여 실험에 사용하였다. 군 분리 후 정상군에는 기본사료를, 대조군 및 약물투여군에는 Western diet (D12079B, Research Diets Inc, New Brunswick, NJ)를 8주간 공급하였다 (Table 1). Western diet 사료 (protein 20%, carbohydrate 50%, fat 21%)를 공급하여 약물투여군은 각각 100, 300㎎/㎏ body weight의 농도로 8주간 투여하였다.
- . 그러나 아직까지 부추 추출물이 죽상경화증에 미치는 영향에 대해 연구는 수행되지 않았기에 LDLr KO 마우스 모델에 부추 추출물을 투여하여 죽상경화증 예방효과를 조사하였다.
- 동맥에서의 조직병리학적 관찰을 수행하기 위해 동맥을 절취하여 10% neutral buffered formalin에 24시간 동안 고정 시킨 다음 graded alcohol로 탈수시키고 파라핀으로 포매하여 block을 제작한 다음 microtome으로 4㎛ 두께의 조직 절편을 제작하여 H&E 염색을 시행한 뒤 광학 현미경위에서 특이 병변의 유무를 관찰하였다. 혈관 내막 비후도 측정은 I-Solution lite (Innerview Co.
- 동맥의 개선을 직접 확인하고자 H&E 염색을 실시하였다. 대조군의 동맥조직 (B)에서는 혈관 내막의 비후도가 정상군 (A)에 비해 확연히 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, AT100 투여군 (C)과 AT300 투여군 (D)에서는 혈관 내막의 비후도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 부추 추출물을 LDLr KO 마우스 모델에 경구 투여한 후, 죽상경화증 예방효과를 연구한 결과는 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 분리한 혈장 (plasma)에서 지질함량의 지표인 총콜레스테롤 (total cholesterol, TC), High-density lipoprotein (HDL), 중성지방(triglyceride, TG), 혈당(glucose)의 함량을 생화학 자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다. Low-density lipoprotein (LDL)의 수치는 Iranian (2008) Formula for LDL Cholesterol을 이용하여 계산하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다.
- 실험 종료 후 각 실험동물로부터 분리한 혈장 (plasma)에서 간 기능의 지표인 ALT 및 AST를 생화학 자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 실험이 끝난 동물은 희생 3시간 전 절식시킨 후 각 실험동물의 간, 신장 조직 및 피하 (subcutaneous), 부고환 (epididymal), 신장 주변 (kidney leaf), 내장 (intraabdominal)의 지방조직을 혈액 채취 후 부위별로 즉시 적출하여 무게를 측정하였다.
대상 데이터
- LDLr KO 마우스 6주령 수컷을 Jackson Lab. ((주)중앙실험동물, 서울)에서 분양받아 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
- 충남 금산군 추부면에서 생산된 신선 부추 Allium tuberosum (AT)를 10kg 구매하여 건조하였다. 건조한 500g을 한일분쇄기 (FM-700SS, 한국)로 분쇄하여 환류추출기 (heating Mantle, MS-DM609/20L)에 넣고 45℃에서 70% 에탄올을 2L 가하여 60분 추출한 후 다시 70%에탄올 2L를 가하여 같은 조건으로 60분 동안 재탕하였다.
데이터처리
- All data are expressed means±SEM, n=6 mice per group. Results were assessed by one-way ANOVA followed byTukey Multiple Comparison test (a, b, cp<0.05).
- All data are expressed means±SEM, n=6 mice per group. Results were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey Multiple Comparison test (a, bp <0.05).
- All data are expressed means±SEM, n=6 mice per group. Results were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey Multiple Comparison test (a, bp <0.05).
- All data are expressed means±SEM, n=6 mice per group. Results were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey Multiple Comparison test.
- All data are expressed means±SEM, n=6 mice per group. Results were assessed by one-way ANOVA followed byTukey Multiple Comparison test (a, b, cp<0.05).
- All data are expressed means±SEM, n=6 mice per group. Results were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey Multiple Comparison test (a, bp <0.05).
- 모든 수치는 평균±표준오차 (Mean±SE)로 표시하였으며, SPSS (22.0 for Windows program)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Tukey Multiple Comparison test로 사후검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 유의수준 p-value<0.
이론/모형
- 분리한 혈장 (plasma)에서 지질함량의 지표인 총콜레스테롤 (total cholesterol, TC), High-density lipoprotein (HDL), 중성지방(triglyceride, TG), 혈당(glucose)의 함량을 생화학 자동 분석기 (Hitachi-720, Hitachi Medical, Japan)를 이용하여 측정하였다. Low-density lipoprotein (LDL)의 수치는 Iranian (2008) Formula for LDL Cholesterol을 이용하여 계산하였다.
- 병변의 유무를 관찰하였다. 혈관 내막 비후도 측정은 I-Solution lite (Innerview Co., 한국) 프로그램을 이용하였다.
성능/효과
- 1. 체중 변화와 식이효율 측정 결과 대조군에 비해 모든 투여군에서 감소하는 경향을 보였다.
- 2. 간 및 신장 조직과 내장 지방 무게를 측정한 결과 모든 투여군에서 감소하는 경향을 보였고 피하, 부고환, 신장 주변 지방의 경우 AT300 투여군은 유의성 있게 지방 무게를 감소시켰다 (p<0.05).
- 3. 간 기능 지표인 ALT와 AST를 측정한 결과, ALT의 경우 모든 투여군에서 유의성 있는 감소를 보였고 (p< 0.05), AST 측정 결과 투여군 모두에서 대조군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다.
- 4. 혈장 내 지질함량을 평가한 결과, AT300 투여는 체내 총콜레스테롤과 혈당 수치를 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- 5. 간 조직과 대동맥을 분석한 결과, 대조군의 간 조직에서 지방 방울과 지방 조직의 축적을 관찰하였으며 대동맥의 경우 혈관 내막의 비후도과 확연히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 대조군과 비교했을 때 AT300 투여군의 간 조직과 대동맥은 정상군과 유사한 모습을 보였다.
- 8주간에 걸쳐 실험한 결과 대조군에 비해 AT100 투여군과 AT300 투여군에서 체중감소를 경향을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1).
- ALT 측정 결과 대조군 (62.60±20.64IU/L)은 정상군 (23.75±0.83IU/L) 에 비해 62.1% 증가하였고 AT100 투여군 (14.75±2.80IU/L, p<0.05)과 AT300 투여군 (17.60 ±1.28IU/L)은 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였다.
- AST 측정 결과 정상군 (109.75±8.82IU/L)에 비해 대조군 (148.60±35.96IU/L)이 증가하였고 AT100 투여군 (99±14.25IU/L)과 AT300 투여군 (80.40±7.87 IU/L) 은 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다(Fig. 3).
- HDL-cholesterol의 측정 결과 모든 군에서 개선 효과를 확인할 수 없었다(Fig. 4).
- LDLr KO 마우스의 부위별 지방 무게 측정 결과 피하지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 77% 증가하였고 (p<0.05), AT100과 AT300 투여군은 대조군에 비해 각각 35.9%와 62.5% 감소하였다 (p<0.05). 부고환지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 76.
- TC 측정 결과 대조군 (1116.20±133.71mg/dl, p<0.001)은 정상군 (339.75±55.09mg/dl)에 비해 약 329% 증가하였고 AT300 투여군 (781.20±64.50mg/dl)은 대조군에 비해 약 30% 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4).
- 스트레스, 고지방식이나 알콜로 인하여 간 조직에 손상이 발생하면 ALT와 AST 효소는 혈액 중 그 수치가 증가한다22). 간 기능의 지표로 ALT와 AST를 측정한 결과, ALT는 약물 투여군 모두 대조군에 비해 감소하였고, AST는 약물 투여군 모두 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과 부추 추출물의 투여는 간조직의 손상을 어느 정도 보호할 수 있는 것으로 생각된다.
- 이러한 결과 부추 추출물의 투여는 간조직의 손상을 어느 정도 보호할 수 있는 것으로 생각된다. 간과 대동맥의 조직병리학적 변화를 확인한 결과, 정상군에 비해 대조군의 간 조직에서 지방방울과 지방 조직의 축적이 뚜렷하게 나타났으며 동맥의 경우 혈관 내막의 비후도과 확연히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 대조군과 비교했을 때 AT300 투여군은 정상군과 유사한 모습을 보였다.
- . 그 결과 체중과 식이효율 변화에 있어서, 대조군에 비해 약물투여군 모두 체중과 식이효율에 감소하는 경향을 보였다. 실험 그룹별 간, 신장 및 지방 무게 변화는 정상군에 비해 대조 군에서 유의성 있는 증가를 보였다.
- 간 조직 무게의 증가는 고지방 섭취 시 지방대사가 일어나지만 정상적으로 중성지방이 제거되지 않아 지방이 쌓이면서 간 조직의 무게가 증가한 것으로 생각된다. 그리고 피하, 부고환, 신장주변 그리고 내장 지방의 무게 또한 대조군과 비교하여 약물투여군 모두 지방무게 감소를 나타내었다. 과다한 지방질의 축적은 혈액순환장애를 일으키고 이로 인하여 죽상경화증을 초래할 수 있다20-21).
- 05). 내장지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 57.1% 증가를 보였고 (p<0.05), AT100과 AT300 투여군은 대조군에 비해 각각 25.7%와 51.4%의 감소를 나타내었다(Table 2).
- 대조군 (1155.59±206.49mg/dl)은 정상군 (129.47± 25.78mg/dl, p<0.001)에 비해 LDL-cholesterol 함량이 약 893% 증가하였다. 그러나 AT300 투여군 (693.
- 67mg/dl)은 유의성 있는 증가를 보였다. 대조군에 비해 AT100 투여군 (154.75±4.74mg/dl)은 감소하는 경향을 보였고 AT300 투여군 (119.80±16.86 mg/dl)은 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4).
- 본 연구에서 실험한 동물들의 혈장 내 지질함량을 살펴보면 정상군에 비해 대조군의 총콜레스테롤, 중성지방 및 LDL-콜레스테롤의 함량이 유의적으로 증가하였다. 대조군에 비해 약물 투여군 모두 지질함량이 감소하였지만 특히 AT300 투여군이 AT100 투여군보다 더 큰 감소를 나타내었다. 또한 정상군에 비해 대조군은 혈당 함량이 유의적으로 증가하였으며, 대조군에 비해 AT300 투여군에서 유의적인 감소를 나타냈다.
- 실시하였다. 대조군의 동맥조직 (B)에서는 혈관 내막의 비후도가 정상군 (A)에 비해 확연히 증가한 것을 관찰할 수 있었으며, AT100 투여군 (C)과 AT300 투여군 (D)에서는 혈관 내막의 비후도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 AT300 투여군은 정상군과 유사한 모습을 보였다(Fig.
- 대조군에 비해 약물 투여군 모두 지질함량이 감소하였지만 특히 AT300 투여군이 AT100 투여군보다 더 큰 감소를 나타내었다. 또한 정상군에 비해 대조군은 혈당 함량이 유의적으로 증가하였으며, 대조군에 비해 AT300 투여군에서 유의적인 감소를 나타냈다. 이와같이 체내 지방축적 및 지질함량을 평가한 결과, AT300 투여는 체내 총콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤 및 지방축적을 감소시킴으로써 죽상경화증을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
- 과다한 지방질의 축적은 혈액순환장애를 일으키고 이로 인하여 죽상경화증을 초래할 수 있다20-21). 본 연구에서 실험한 동물들의 혈장 내 지질함량을 살펴보면 정상군에 비해 대조군의 총콜레스테롤, 중성지방 및 LDL-콜레스테롤의 함량이 유의적으로 증가하였다. 대조군에 비해 약물 투여군 모두 지질함량이 감소하였지만 특히 AT300 투여군이 AT100 투여군보다 더 큰 감소를 나타내었다.
- 05). 부고환지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 76.4% 증가하였고 (p<0.05), AT300 투여군은 대조군에 비해 유의성있게 감소하였다 (p<0.05). 신장 주변 지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 56.
- 식이효율 (FER, %)은 western diet를 먹인 대조군 (5.45 ±1.08%)이 일반 식이를 한 정상군 (3.92±0.55%)에 비하여 증가하였으며 AT100 투여군과 AT300 투여군의 식이 효율이 대조군에 비하여 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2).
- 05). 신장 주변 지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 56.8% 증가하였고(p<0.05), AT100과 AT300 투여군은 대조군에 비해 각각 48.6%와 64.9%의 유의성 있는 감소를 나타내었다 (p< 0.05). 내장지방 무게는 대조군이 정상군에 비해 57.
- 그 결과 체중과 식이효율 변화에 있어서, 대조군에 비해 약물투여군 모두 체중과 식이효율에 감소하는 경향을 보였다. 실험 그룹별 간, 신장 및 지방 무게 변화는 정상군에 비해 대조 군에서 유의성 있는 증가를 보였다. 간 조직 무게의 증가는 고지방 섭취 시 지방대사가 일어나지만 정상적으로 중성지방이 제거되지 않아 지방이 쌓이면서 간 조직의 무게가 증가한 것으로 생각된다.
- 실험결과 간과 신장 조직 무게는 정상군에 비해 대조군에서 유의성 있는 증가를 보였지만 (p<0.05), AT100, 300 투여군은 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다.
- 정상군의 간 조직(A)에서는 간세포가 정상적인 형태를 이루고 있지만 대조군(B)에서 정상군에 비해간 조직에서 지방 조직의 축적과 지방방울 (fat droplets)의 수가 크게 증가하였음을 관찰할 수 있었다. 약물 투여군에서는 지방방울과 지방 조직의 축적 정도가 감소하는 것을 관찰하였고, 특히 AT300 투여군은 정상군과 유사한 모습을 보였다(Fig. 5).
- H&E 염색을 하였다. 정상군의 간 조직(A)에서는 간세포가 정상적인 형태를 이루고 있지만 대조군(B)에서 정상군에 비해간 조직에서 지방 조직의 축적과 지방방울 (fat droplets)의 수가 크게 증가하였음을 관찰할 수 있었다. 약물 투여군에서는 지방방울과 지방 조직의 축적 정도가 감소하는 것을 관찰하였고, 특히 AT300 투여군은 정상군과 유사한 모습을 보였다(Fig.
- 혈장 내 중성지방 함량은 정상군 (113.50±6.60mg/dl, p<0.01)에 비해 대조군 (862.20±217.99mg/dl)은 유의성 있는 증가를 보였고 AT300 투여군 (448.60±93.45mg/dl)은 대조군에 비해 감소하는 경향을 보였다(Fig. 4).
후속연구
- 이러한 실험결과와 부추의 항혈전 및 높은 LDL 산화저해능4-6)을 바탕으로 부추 추출물은 LDLr KO 마우스 모델에서 체내 지방축적 및 지질함량의 감소와 간 및 혈관 내피세포의 기능적 개선을 통해 죽상경화증을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 정상군에 비해 대조군은 혈당 함량이 유의적으로 증가하였으며, 대조군에 비해 AT300 투여군에서 유의적인 감소를 나타냈다. 이와같이 체내 지방축적 및 지질함량을 평가한 결과, AT300 투여는 체내 총콜레스테롤, 중성지방, LDL-콜레스테롤 및 지방축적을 감소시킴으로써 죽상경화증을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 스트레스, 고지방식이나 알콜로 인하여 간 조직에 손상이 발생하면 ALT와 AST 효소는 혈액 중 그 수치가 증가한다22).
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