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문제 정의
- 이와 같은 결과는 GO가 인슐린 분비장애에 의한 제2형 당뇨병 환자들의 치료제로써의활용과 동시에 제1형 당뇨에도 가능성이 있을 것이라 사료된다. 다만, 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 질환이기에 기전에 차이가 있어 추후 심도있는 연구를 통해 확인해 보고자 한다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, GO는 제 2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 통해 안전하고 당뇨의 대표적 증상인 혈당과식이량, 체중을 감소시키며 콜레스테롤 개선 효능을 통해 동맥경화지수와 심혈관 위험지수를 낮추며 인슐린을 증가시키는 것을 입증함으로써 제2형 당뇨병 및 당뇨에 의한 합병증 개선에 효과적인 처방임을 입증하였다.
- 따라서 본 실험에서는 제 2형 당뇨모델로 알려진 db/db 마우스에 加味玉女煎의 경구 투여가 혈당 및 체중, 식이량의변화, ALT와 AST 등의 간 기능, 인슐린 농도 및 지질 대사에 미치는 영향 등에 있어 유의한 결과를 나타내었기에 임상에서의 활용성을 제고함과 동시에 향후 보다 효과적이고 안전한한의학적 경구혈당강하제 개발을 위한 기초적 자료를 제공하고자 하였다.
- 본 연구에서는 db/db 마우스에서 加味玉女煎 (GO)의 지질대사 개선 및 항당뇨 효능을 객관적으로 검증하기 위하여, 간 및 신 기능, 체중 및 식이량, 혈당 등의 변화, 콜레스테롤 및 동맥경화지수, 심혈관 위험지수, 인슐린에 미치는 영향을 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- db/db mouse의 기원으로 알려진 C57BL/6 마우스를 정상군으로 분류하였으며, 당뇨 발생 모델로 알려진 db/db mouse를 대조군과 실험군으로 그룹당 8마리씩 나누었다. 실험동물은 대조군과 실험군의 혈당체크 후 그룹을 배분하였으며, 실험 시작 시 정상군의 혈당은 145.
- 2주간의 안정기 이후 8주령부터 동물 실험을 진행하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22 ±2℃, 1일 중 12시간은 200-300Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 본 실험은 대전대학교 동물실험윤리 위원회의 승인 (승인번호 DJUARB2015-034)을 받아 동물윤리준칙에 의거하여 실험하였다.
- . 따라서 본 연구에서는 db/db 마우스를 활용하여 가미옥녀전 (GO)의 경구 투여가 체중, 식이량, 혈당 등의 변화 및 콜레스테롤, 동맥경화지수, 심혈관 위험지수, 인슐린에 미치는 영향 등을 확인하였다.
- 및 혈압에 효능이 있음을 밝혀내었다. 본 시료인 加味玉 女煎은 여기에 당뇨병의 주된 범주인 消渴의 증세에 활용되는 黃連, 梔子, 玄參을 가미한 처방으로 항당뇨 및 지질대사 기능에 대해 유효하리라 사료되어 선정하게 되었다.
- 이때, 혈당의 수치가 낮거나 높은 모델은 에테르를 이용하여 폐사하였다. 실험 시작 8 주령부터 실험 종료인 12주령까지 대조군에는 증류수를, 실험군에는 GO를 매일 1회, 오전 10시에 200㎕씩 경구 투여하였다. GO 투여량은 성인 체중 60kg을 기준으로 한 후 마우스 체중 30g으로 기준하여 산출하였다.
- 실험 종료 후 ethyl ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 3, 000rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 분리한 후, Rat/Mouse Insulin ELISA kit을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 코팅 된 Insulin plate에 washing 완충 용액을 이용하여 세척하고 100㎕의 biotin conjugate와 10㎕의 standard, 혈청을 넣은 뒤 2시간 동안 반응시켰다.
- 실험동물은 2주간의 안정기를 가지면서 순화를 시켰으며, 안정기 및 실험기간에 모든 실험군에는 일반 사료 (Altromin CO., Germany)를 자유식이 하며 물을 충분히 공급하였다. 2주간의 안정기 이후 8주령부터 동물 실험을 진행하였다.
- 실험동물은 대조군과 실험군의 혈당체크 후 그룹을 배분하였으며, 실험 시작 시 정상군의 혈당은 145.3±17.4㎎/㎗, 대조군은 281.7±78.9㎎/㎗, GO 200㎎/㎏ 투여군 (이하, GO)은 280.8±78.7㎎/㎗이였다. 이때, 혈당의 수치가 낮거나 높은 모델은 에테르를 이용하여 폐사하였다.
- 7㎎/㎗이였다. 이때, 혈당의 수치가 낮거나 높은 모델은 에테르를 이용하여 폐사하였다. 실험 시작 8 주령부터 실험 종료인 12주령까지 대조군에는 증류수를, 실험군에는 GO를 매일 1회, 오전 10시에 200㎕씩 경구 투여하였다.
- 월요일에 측정을 실시하였다. 혈당 측정 3시간 전부터 절식시킨 후 꼬리 끝을 절단한 뒤 혈당체크기를 이용하여 혈당을 측정하였으며 식이섭취량 및 체중은 매주 월요일에 g 단위로 측정하였다.
- 혈당 측정은 실험 시작일로부터 실험이 종료되는 주까지 매주 월요일에 측정을 실시하였다. 혈당 측정 3시간 전부터 절식시킨 후 꼬리 끝을 절단한 뒤 혈당체크기를 이용하여 혈당을 측정하였으며 식이섭취량 및 체중은 매주 월요일에 g 단위로 측정하였다.
- 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3, 000rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, ㈜ 옵티팜 (Korea)에 분석 의뢰 하였다.
- 혈중 내 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol 함량을 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하여, 그 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3, 000rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 ㈜옵티팜 (Korea)에 분석 의뢰 하였다.
- 혈청 내 간 기능인 Alanine aminotransferase (ALT), Aspartate aminotransferase (AST)와 신 기능인 creatinine, BUN 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3, 000rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여, ㈜ 옵티팜 (Korea)에 분석 의뢰 하였다.
대상 데이터
- , Germany)를 자유식이 하며 물을 충분히 공급하였다. 2주간의 안정기 이후 8주령부터 동물 실험을 진행하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22 ±2℃, 1일 중 12시간은 200-300Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 본 실험에 사용한 加味玉女煎 (Gamioknyeo-jeon 이하, GO 로 표기)의 구성 약재들은 옴니허브(Korea)에서 구입 하였고, 대전대학교 TBRC-RIC에서 정선 후 사용 하였으며, 그 내용과 분량 (1첩)은 다음과 같다(Table 1).
- 본 실험을 위하여 사용된 대조군과 실험군인 db/db mouse (5주령, 수컷, 20∼27g)와 정상군으로 사용된 C57BL/6mouse (5주령, 수컷, 20∼25g)는 라온바이오(Korea)에서 구입하여사용하였다. 실험동물은 2주간의 안정기를 가지면서 순화를 시켰으며, 안정기 및 실험기간에 모든 실험군에는 일반 사료 (Altromin CO.
- 사용된 시약은 Rat/Mouse insulin ELISA kit (Biovender., CZECH)을 사용하였으며, 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), 환류 추출기 (Mtops, Korea), 동결 건조기 (IlShinBioBase, Korea), 혈당체크기 (Roche, Switzerland) 등을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test 및 ANOVA를 사용하여 통계처리 하였으며 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 동맥경화 지수 (Atherogenic Index, AI)는 Fiordaliso의 계산 법인 AI=([Total-C]- [HDL-C])/[HDL-C] 식을 사용하여 구하였다. 또한, 심혈관위험지수인 CRF (Cardiac Risk Factor)는 Rosenfeld의 계산법에 따라 총 콜레스테롤의 양을 HDL 콜레스테롤의 양으로 나누어 구하였다.
- 구하였다. 또한, 심혈관위험지수인 CRF (Cardiac Risk Factor)는 Rosenfeld의 계산법에 따라 총 콜레스테롤의 양을 HDL 콜레스테롤의 양으로 나누어 구하였다.
성능/효과
- 1. GO 투여군은 db/db 마우스의 혈액 내 ALT, AST, creatinine, BUN 수치에서 모두 정상 범위에서 큰 차이를 나타내지 않아 체내 독성을 유발하지 않았다.
- 2. GO 투여군은 체중, 식이량, 혈당 등이 대조군에 비해 감소하였다.
- 3. GO 투여군은 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤이 대조군에 비해 감소하였으며 HDL 콜레스테롤은 차이가 나타나지 않았다.
- 4. GO 투여군은 동맥경화지수 및 심혈관위험 지수가 대조군에 비해 적게 나타났다.
- 5. GO 투여군은 정상군과 대조군에 비해 인슐린 함량을 증가시켰다.
- GO 투여 종료 후에 insulin 함량을 측정한 결과, 대조군이 21.0±0.9uU/㎖을 나타난 반면, GO는 46.3±2.7uU/ ㎖으로 나타나 유의성 있는 (**:p<0.01) 증가를 나타내었다 (Fig. 4).
- GO 투여 종료 후에 간 기능 손상마커인 AST, ALT와 신장기능 손상마커인 creatinine과 BUN을 측정한 결과, AST는 정상군이 116.67±19.70IU/L로 나타난 반면, GO는 101.80 ±6.10IU/L로 나타났으며, ALT는 정상군이 87.14±7.60 IU/L로 나타난 반면, GO는 85.42±2.50IU/L로 나타났다. 또한, Creatininee 정상군이 0.
- GO 투여 종료 후에 혈청 내 total cholesterol과 HDL-cholesterol, LDL-cholesterol을 측정한 결과, total cholesterol 은 대조군이 176.0±6.4㎎/㎗을 나타난 반면, GO는 108.0 ±3.1㎎/㎗으로 나타났으며(Fig. 3A), HDL-cholesterole 대조군이 100.0±4.0㎎/㎗을 나타난 반면, GO는 100.0± 4.5㎎/㎗으로 나타났다(Fig. 3B). 또한, LDL-cholesterole 대조군이 8.
- 50IU/L로 나타났다. 또한, Creatininee 정상군이 0.40±0.01㎎/㎗로 나타난 반면, GO는 0.30±0.02㎎/㎗로 나타났으며, BUNe 정상군이 24.29±3.10㎎/㎗로 나타난 반면, GO는 21.60± 2.80㎎/㎗로 나타났다(Table 2).
- 3B). 또한, LDL-cholesterole 대조군이 8.7±0.7㎎/㎗을 나타난 반면, GO는 6.1±0.5 ㎎/㎗로 감소가 나타나(Fig. 3C), 대조군에 비해 total cholesterol과 LDL-cholesterole 유의성 있는 (***:p< 0.001, *:p<0.05) 감소가 나타났다(Fig. 3A, 3C).
- 01) 감소가 나타났다. 또한, 심혈관 위험지수를 측정한 결과, 대조군이 1.45±0.02로 나타난 반면, GO는 1.08±0.01로 적게 나타났다(Table 4).
- 체내 항상성에 의해 균형을 이루고 있는 체내 지질 균형이 깨어지면 LDL-cholesterol는 증가하고, HDL-cholesterol는 감소하여 동맥경화증, 고혈압 및 심혈관계 질환을 유발한다24). 본 연구에서 GO가 콜레스테롤과 동맥경화지수 및 심혈관 위험지수에 미치는 영향을 확인한 결과, GO는 대조군에 비하여 콜레스테롤의 유의성 있는 감소와 LDL-cholesterol의 감소에 따른 동맥경화지수와 심혈관 위험지수를 감소시켰다. 이와 같은 결과는 GO가 당뇨병의 이상지질혈증을 개선하고 더 나아가 심혈관질환의 주요 위험인자인 이상지질혈증을 개선함으로써 심혈관질환을 예방하고 개선할 수 있음을 시사한다.
- 1%에서 인슐린 분비장애를 보인다는 결과를 제시하였다26). 본 연구에서 GO는 대조군에 비해 insulin의 함량을 유의성 있게 증가 시켜 혈당 감소 결과와 부합되었다. 이와 같은 결과는 GO가 인슐린 분비장애에 의한 제2형 당뇨병 환자들의 치료제로써의활용과 동시에 제1형 당뇨에도 가능성이 있을 것이라 사료된다.
- 이는 한의학에서 말하는 多飮, 多食, 多尿에 해당되는 것으로 당뇨병의 대표적 증상이다. 본 연구에서 GO의 경구 투여 시작부터 종료까지 매주차별로 체중, 식이량, 혈당을 확인한 결과, GO는 대조군에 비해 체중 및 식이량, 혈당을 모두 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 GO가 혈당 조절을 통해 식이량을 감소시키고 이로 인해 체중의 감소가 나타난 것으로 당뇨의 주된 생리적 변화에 있어 효능이 있음을 객관적으로 증명해주고 있다.
- 식이량 섭취에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 실험 시작 8주령에서 244g, 9주령에서 261g, 10주령에서 213g, 11주령에서는 255g, 실험 종료 12주령에서는 235g로 나타난 반면, GO는 실험 시작 8주령에서 231g, 9주령에서 175g, 10주령에서 217g, 11주령에서는 124g, 실험 종료 12주령에서는 196g으로 나타나, GO는 대조군에 비해 식이량 감소가 나타났다(Fig. 1).
- 우선, 실험 종료 후 혈액으로 ALT, AST, BUN, creatinine 수치에 미치는 영향을 조사한 결과, 정상군 범위에서 큰 차이를 나타내지 않아 GO는 간과 신기능에 영향이 없이 안전한 것으로 나타났다. 이 같은 결과만으로 안전성을 확보하기는 어렵지만, 이미 복용 후 평가된 in-vivo 실험 결과 측면에서는 안전하다고 평가하였다.
- 것으로 나타났다. 이 같은 결과만으로 안전성을 확보하기는 어렵지만, 이미 복용 후 평가된 in-vivo 실험 결과 측면에서는 안전하다고 평가하였다.
- 이상의 결과들로 보아 加味玉女煎은 제2형 당뇨모델인 db/db 마우스에서 지질대사와 항당뇨 및 주된 증상에 대한 감소 효능이 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 치료 기전은 향후 보다 심도있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으로 보이나 이와 같은 결과는 加味玉女煎이 제2형 당뇨병의 치료제로서 우수한 효과가 있으며, 추후 임상적으로 엄격한 기준을 충족한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 다만, 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 질환이기에 기전에 차이가 있어 추후 심도있는 연구를 통해 확인해 보고자 한다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, GO는 제 2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 통해 안전하고 당뇨의 대표적 증상인 혈당과식이량, 체중을 감소시키며 콜레스테롤 개선 효능을 통해 동맥경화지수와 심혈관 위험지수를 낮추며 인슐린을 증가시키는 것을 입증함으로써 제2형 당뇨병 및 당뇨에 의한 합병증 개선에 효과적인 처방임을 입증하였다. 따라서 향후 개별 약재에 대한 효능과 약재간의 상승작용에 대한 보다 심도있는 연구가 필요할 것으로 보이며, 加味玉女煎이 원방인 玉女煎 보다 제2형 당뇨에 대해 더 우수한 효능이 있는지에 대한 구체적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 체중 증가에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 실험 시작 시 39.38±1.05g에서 종료 후 49.25±1.57g로 9.87g 의 증가를 나타낸 반면, GO는 실험 시작 시 41.93±1.84g 에서 종료 후 46.08±3.01g로 4.15g의 증가가 나타나 대조군에 비해 체중의 증가가 적게 나타났다(Table 3).
- 혈당 변화에 미치는 영향을 측정한 결과, 대조군은 실험 시작 8주령에서 281.7±78.9㎎/㎗, 9주령에서 241.7±35.1 ㎎/㎗, 10주령에서 376.3±70.1㎎/㎗, 11주령에서는 396.3 ±58.8㎎/㎗, 실험 종료 12주령에서는 600.0±104.1㎎/㎗ 로 나타나 318.3㎎/㎗의 증가가 나타난 반면, GO는 실험 시작 8주령에서 280.8±78.8 ㎎/㎗, 9주령에서 202.7± 25.4㎎/㎗, 10주령에서 312.8±52.8㎎/㎗, 11주령에서는 383.3±31.3㎎/㎗, 실험 종료 12주령에서는 482.7±66.7 ㎎/㎗로 나타나 201.9㎎/㎗의 증가가 나타나 대조군에 비해 유의성 있는 (*:p<0.05) 혈당 변화를 나타내었다(Fig. 2).
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, GO는 제 2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 통해 안전하고 당뇨의 대표적 증상인 혈당과식이량, 체중을 감소시키며 콜레스테롤 개선 효능을 통해 동맥경화지수와 심혈관 위험지수를 낮추며 인슐린을 증가시키는 것을 입증함으로써 제2형 당뇨병 및 당뇨에 의한 합병증 개선에 효과적인 처방임을 입증하였다. 따라서 향후 개별 약재에 대한 효능과 약재간의 상승작용에 대한 보다 심도있는 연구가 필요할 것으로 보이며, 加味玉女煎이 원방인 玉女煎 보다 제2형 당뇨에 대해 더 우수한 효능이 있는지에 대한 구체적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 치료 기전은 향후 보다 심도있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으로 보이나 이와 같은 결과는 加味玉女煎이 제2형 당뇨병의 치료제로서 우수한 효과가 있으며, 추후 임상적으로 엄격한 기준을 충족한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 GO는 대조군에 비해 insulin의 함량을 유의성 있게 증가 시켜 혈당 감소 결과와 부합되었다. 이와 같은 결과는 GO가 인슐린 분비장애에 의한 제2형 당뇨병 환자들의 치료제로써의활용과 동시에 제1형 당뇨에도 가능성이 있을 것이라 사료된다. 다만, 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 질환이기에 기전에 차이가 있어 추후 심도있는 연구를 통해 확인해 보고자 한다.
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