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문제 정의
- 이에 따라 심혈관 질환을 예방에 필수적인 고혈압 관리를 위하여 천연약물에 대한 관심 또한 증가되고 있는 실정이다26). 따라서 이번 연구에서는 토끼 경동맥 절편을 이용하여 산수유의 혈관이완 효과 및 혈관내피세포에 미치는 영향을 조사함으로써 고혈압 조절을 통한 심혈관질환 관리에 있어 산수유 사용에 대한 과학적 근거를 제시하고자 하였다.
- 이에 저자는 토끼의 경동맥 적출혈관을 이용한 organ bath study를 통하여 혈관내피세포에서 분비되는 NO 및 prostacyclin, EDHF를 중심으로 한 산수유의 혈관이완효과에 대한 연구를 진행함으로써 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 내피세포 부착 실험절편과 내피세포 제거 실험절편에 모두 phenylephrine(PE, 5×10-6 M)을 투여하여 수축을 유발시킨 다음 산수유 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0 ㎎/㎖)로 투여하여 내피세포 존재 여부에 따른 혈관의 수축 변화를 기록하였다.
- 내피세포 의존성 이완효과의 기전을 확인하기 위하여 내피세포부착 실험절편에 PE를 투여하여 수축을 유발시킨 후 산수유 추출물(1.0 ㎎/㎖)을 투여하여 이완효과 변화를 기록하였다. 동일 실험절편을 1시간 동안 회복시킨 다음 blocker로 작용하는 indomethacin(IM, 10-5 M), tetraethylammonium chloride(TEA, 10-4 M), Nω-nitro-L-arginine(L-NNA, 10-4 M), methylene blue(MB, 10-5 M)을 각각 15분 동안 전처치하고 PE로 수축을 유발시킨 후 산수유 추출물(1.
- 0 ㎎/㎖)을 투여하여 이완효과 변화를 기록하였다. 동일 실험절편을 1시간 동안 회복시킨 다음 blocker로 작용하는 indomethacin(IM, 10-5 M), tetraethylammonium chloride(TEA, 10-4 M), Nω-nitro-L-arginine(L-NNA, 10-4 M), methylene blue(MB, 10-5 M)을 각각 15분 동안 전처치하고 PE로 수축을 유발시킨 후 산수유 추출물(1.0 ㎎/㎖)을 투여하였을 때의 이완효과 변화를 기록하여 blocker 전처치 전후를 비교하였다.
- 먼저 산수유의 이완효과가 세포질 내 Ca2+ 농도 증가를 억제하고, proteinkinase A(PKA)를 활성화하여 myosin light chain kinase를 억제함으로써 해면체 평활근 이완 및 혈관 확장 작용 유발하는 cAMP를 생성28)하는 PGI2와 연관된 것인지 알아보기 위해 내피세포의 arachidonic acid로부터 PGI2가 생성되는 기전을 차단하는 COX inhibitor인 indomethacin(IM)을 처치29)하여 실험하였다. 산수유 추출물 1.
- 본 연구에서는 각 channel을 통한 Ca2+의 세포외 유입과 산수유 추출물의 혈관이완작용과의 상관성을 알아보기 위해 Ca2+–free krebs-ringer solution에서 PE로 수축을 유발시킨 후 Ca2+ 1 mM을 투여해보았다. Ca2+ 투여로 인한 수축의 증가는 산수유를 전처치한 경우에서 산수유를 전처치하지 않은 경우보다 유의성 있게 감소되었다(Table 6, Fig.
- 산수유의 혈관이완효과가 평활근세포에서 K+ 통로를 개방함으로써 K+의 세포외 유출로 초래되는 과분극을 통하여 이완을 발생시키는 EDHF와 연관된 것인지 알아보기 위하여 K+ channel blocker로 알려진 TEA30-32)를 이용하여 막전압의 과분극을 차단하였다. 그 결과 TEA를 전처치 유무와 관계없이 산수유 추출물에 의한 유의성 있는 이완효과가 나타났으나, TEA를 전처치한 경우 TEA를 전처치하지 않은 경우와 비교하여 이완효과가 유의하게 억제되었다(Table 3, Fig.
- 실험절편은 내피세포가 부착된 실험절편과 내피세포가 제거된 실험절편으로 구분하여 제작하였고, 내피세포는 가는 솜 막대로 문질러 제거하였다.
대상 데이터
- 산수유(Corni Fructus, CF) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣은 다음 3시간 동안 가열 추출하였다. 추출액은 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축한 다음 동결건조기로 건조하여 얻은 36.
- 체중 2 kg 내외의 New Zealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)를 사용하였으며, 고형사료와 물을 자유롭게 충분히 섭취하도록 하면서 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 본 동물 실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smeac 14-10-02)하에 실시되었다.
성능/효과
- 또한 산수유의 혈관이완효과는 IM, TEA, L-NNA, MB의 전처치를 통해 유의성 있게 억제되어 나타났다. Ca2+을 제거한 krebs-ringer solution에서 산수유의 전처치는 Ca2+의 첨가에 의한 수축의 증가를 유의성 있게 억제하였다. HUVEC에 산수유 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO 생성량을 측정하였을 때 1000 ㎍/㎖ 농도에서 control에 비해 NO의 생성이 유의하게 증가되었다.
- Ca2+을 제거한 krebs-ringer solution에서 산수유의 전처치는 Ca2+의 첨가에 의한 수축의 증가를 유의성 있게 억제하였다. HUVEC에 산수유 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO 생성량을 측정하였을 때 1000 ㎍/㎖ 농도에서 control에 비해 NO의 생성이 유의하게 증가되었다. 따라서 산수유는 혈관내피세포에서의 NO 생성 및 평활근에서 cGMP를 증가시키고, EDHF를 통해 세포막의 막전압을 과분극시키며, Ca2+ 통로를 차단함으로써 혈관을 이완시키는 것으로 생각된다.
- Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 산수유 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 배양한 후 MTT assay를 시행하여 세포 생존율을 확인한 결과, 산수유 추출물 100, 300, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도에서 모두 세포 생존율에 변화가 없었다(Fig. 7).
- 산수유의 혈관이완효과가 평활근세포에서 K+ 통로를 개방함으로써 K+의 세포외 유출로 초래되는 과분극을 통하여 이완을 발생시키는 EDHF와 연관된 것인지 알아보기 위하여 K+ channel blocker로 알려진 TEA30-32)를 이용하여 막전압의 과분극을 차단하였다. 그 결과 TEA를 전처치 유무와 관계없이 산수유 추출물에 의한 유의성 있는 이완효과가 나타났으나, TEA를 전처치한 경우 TEA를 전처치하지 않은 경우와 비교하여 이완효과가 유의하게 억제되었다(Table 3, Fig. 3).
- 이처럼 혈관내피세포에서 생성된 NO가 평활근 세포에서 cGMP를 증가시키면 proteinkinase G(PKG)가 활성되어 세포외 Ca2+ 유입이 차단되고 평활근 세포의 이완을 통한 혈관이완이 초래된다33,34). 내피세포의 eNOS 효소를 억제하여 NO 생성을 막는 inhibitor인 L-NNA35)와 평활근 세포에서 NO에 의한 cGMP 활성화를 막는 inhibitor인 MB36,37)를 처치한 후 혈관이완정도를 측정한 결과, inhibitor 무처치군과 비교하여 각각 유의성 있게 이완이 억제됨을 확인할 수 있었다(Table 4, Fig. 4, Table 5, Fig.
- HUVEC에 산수유 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO 생성량을 측정하였을 때 1000 ㎍/㎖ 농도에서 control에 비해 NO의 생성이 유의하게 증가되었다. 따라서 산수유는 혈관내피세포에서의 NO 생성 및 평활근에서 cGMP를 증가시키고, EDHF를 통해 세포막의 막전압을 과분극시키며, Ca2+ 통로를 차단함으로써 혈관을 이완시키는 것으로 생각된다.
- 6). 따라서 산수유의 혈관 이완효과가 세포외 Ca2+ 유입의 차단과 관련되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 2). 따라서 산수유의 혈관이완효과가 PGI2의 작용과 연관되어 있음을 알 수 있었다.
- 5). 따라서 산수유의 혈관이완효과가 내피세포에서의 NO 생성 및 평활근 세포에서의 cGMP 활성과 연관되어 있음을 알 수 있었다.
- 산수유는 PE로 수축시킨 혈관에 대해 유의성 있는 이완효과를 나타내었으며 내피세포를 제거한 경우 산수유의 혈관이완효과는 내피세포를 제거하지 않은 경우에 비해 유의하게 억제되어 나타났다. 또한 산수유의 혈관이완효과는 IM, TEA, L-NNA, MB의 전처치를 통해 유의성 있게 억제되어 나타났다. Ca2+을 제거한 krebs-ringer solution에서 산수유의 전처치는 Ca2+의 첨가에 의한 수축의 증가를 유의성 있게 억제하였다.
- 본 연구에서 PE로 수축시킨 경동맥 절편에 0.1, 0.3, 1.0 ㎎/㎖ 산수유 추출물 처리시 유의성 있는 이완효과가 관찰되었으나, 내피세포를 제거한 경우 유의한 이완효과가 나타나지 않았다(Table 1, Fig. 1).
- 먼저 산수유의 이완효과가 세포질 내 Ca2+ 농도 증가를 억제하고, proteinkinase A(PKA)를 활성화하여 myosin light chain kinase를 억제함으로써 해면체 평활근 이완 및 혈관 확장 작용 유발하는 cAMP를 생성28)하는 PGI2와 연관된 것인지 알아보기 위해 내피세포의 arachidonic acid로부터 PGI2가 생성되는 기전을 차단하는 COX inhibitor인 indomethacin(IM)을 처치29)하여 실험하였다. 산수유 추출물 1.0 ㎎/㎖을 투여하였을 때 IM 전처치 유무와 관계없이 모두 유의성 있는 이완효과가 나타났으나, IM을 전처치한 경우, 처치하지 않은 군에 비해 이완효과가 유의성 있게 억제되었다(Table 2, Fig. 2).
- 산수유는 PE로 수축시킨 혈관에 대해 유의성 있는 이완효과를 나타내었으며 내피세포를 제거한 경우 산수유의 혈관이완효과는 내피세포를 제거하지 않은 경우에 비해 유의하게 억제되어 나타났다. 또한 산수유의 혈관이완효과는 IM, TEA, L-NNA, MB의 전처치를 통해 유의성 있게 억제되어 나타났다.
- 3). 이로써 산수유의 혈관이완효과가 EDHF의 작용과 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다.
- 8). 이를 통해 산수유가 혈관내피세포에서 NO 생성을 증가시킨다는 사실을 알 수 있었다.
- 1). 이를 통해 산수유의 혈관이완효과가 내피세포 의존성임을 확인할 수 있었다.
- 이상의 실험결과를 통해 산수유는 내피세포 의존성 혈관이완효과를 가지고 있으며 그 기전은 EDHF를 통해 막전압을 과분극시키고 NOS로부터 NO의 생성을 도우며, NO-cGMP 경로를 활성화시키고, ROCC와 VDCC 같은 Ca2+ 통로를 차단하여 혈관을 이완시키는 효능을 가지고 있는 것으로 판단된다. 따라서 산수유는 혈관이완효과를 통해 고혈압을 비롯한 심혈관계 질환에 폭넓게 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 실험결과를 통해 산수유는 내피세포 의존성 혈관이완효과를 가지고 있으며 그 기전은 EDHF를 통해 막전압을 과분극시키고 NOS로부터 NO의 생성을 도우며, NO-cGMP 경로를 활성화시키고, ROCC와 VDCC 같은 Ca2+ 통로를 차단하여 혈관을 이완시키는 효능을 가지고 있는 것으로 판단된다. 따라서 산수유는 혈관이완효과를 통해 고혈압을 비롯한 심혈관계 질환에 폭넓게 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
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