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문제 정의
- 본 연구에서 개발한 분석법의 유효성을 검정하기 위해 검출한계 평가와 정확도 및 정밀도 확인을 위한 실험을 실 시하였다. 분석법 검증을 위한 실험은 시판 우유에 일정 농도 의 표준물질을 첨가한 시료를 3개 농도(0.
- 정확도 (accuracy)는 회수율(recovery, %)을 이용하여 평가하였으 며, 정밀도(precision)는 7번 반복 측정한 분석결과의 상대 표준편차(RSD, %)를 이용하였다. 본 연구에서 우유를 통해 얻어진 분석법이 실제 모유에 적용가능한지를 검증하는 실험을 실시하였다. 냉동되어 있는 모유 시료는 분석하기 전에 꺼내어 실온에서 녹인 후, 동질화시켜 사용하였다.
제안 방법
- 모유 중 파라벤류 분석법 확립을 위해 본 실험에서는 사 람의 모유와 가장 비슷하며, 비교적 손쉽게 구할 수 있는 시중에서 판매중인 우유를 사용하여 분석법을 확립하였 다. 또한, 확립된 분석법의 유효성 검증을 위해 실제 모유 시료 10건을 수집하여 분석하였다. 모유는 수유 후 남는 잉여 모유를 수집하였으며, 모든 대상자가 동의서에 서명 Figure 1.
- 모유 중 파라벤류 분석법 확립을 위해 본 실험에서는 사 람의 모유와 가장 비슷하며, 비교적 손쉽게 구할 수 있는 시중에서 판매중인 우유를 사용하여 분석법을 확립하였 다. 또한, 확립된 분석법의 유효성 검증을 위해 실제 모유 시료 10건을 수집하여 분석하였다.
- 따라서 저농도로 존재하는 모유 중 파라벤류 분석을 위해 검출한계가 낮고 정확도와 정밀도 가 높은 분석법 확립이 필요하다. 본 연구는 LC-MS/MS 시스템을 이용하여 모유를 통한 영아의 파라벤류 노출을 평가할 수 있는 분석법 개발을 위 해, 시판 우유를 이용하여 4종의 파라벤류 동시 분석법을 확립하고, 실제 모유를 이용하여 분석법의 유효성 검증을 실시하였다.
- 본 연구에서 개발한 분석법의 유효성을 검정하기 위해 검출한계 평가와 정확도 및 정밀도 확인을 위한 실험을 실 시하였다. 분석법 검증을 위한 실험은 시판 우유에 일정 농도 의 표준물질을 첨가한 시료를 3개 농도(0.2, 5, 20 ng/mL)로 각각 7개씩 준비하고, 각 시료를 동일한 전치리 방법으로 추출하여 LC-MS/MS 시스템으로 정량분석 하였다. 검출 한계 (Limit of Detection, LOD)는 7번 반복 측정하여 얻어 진 값의 표준편차(SD)에 3.
- 0*75 mm, Phenomenex, USA) 을 사용하였으며, HPLC의 유량은 400 卩L/min으로 유지하 였다. 이동상 용매 A는 0.1% 아세트산이 포함된 증류수, B는 0.1% 아세트산이 포함된 아세토니트릴을 사용하였으며, 경사용매법(gradient mode)으로 분리하였다. 이동상 용매의 조건은 B(30%)에서 시작하여 10분에 B(55%), 13분에 B (90%)로 증가시 켰으며, 3분 동안 유지하고 다시 B(30%)가 되도록 하였다(Table 1).
- 냉동되어 있는 모유 시료는 분석하기 전에 꺼내어 실온에서 녹인 후, 동질화시켜 사용하였다. 전처리 및 분석은 확립된 방법을 적용시켰으며, LC-MS/MS 시스템으로 정량분석 하였다. 결과 및 고찰 분석법 검증 결과 파라벤류의 LOD는 각각 MP 0.
- 파라벤류 분리 및 검출을 위해 고성능 액체크로마토그 래 피(1100 serise, Agilent Technologies, Palo Alto, Calif, USA)와 API 4000(Applies Biosystems, Foster City, CA, USA) 질량분 석기를 이용하였다. 분석대상물질의 분리에 사용된 컬럼은 Synergi 4U Fusion-RP(80A, 2.
- Representative MS/MS spectrum of propyl paraben. 표준물질을 첨가하여 동일한 방법으로 전처리 과정을 거 친 후, LC-MS/MS 시스템을 통해 정량분석 하였다. 정확도 (accuracy)는 회수율(recovery, %)을 이용하여 평가하였으 며, 정밀도(precision)는 7번 반복 측정한 분석결과의 상대 표준편차(RSD, %)를 이용하였다.
대상 데이터
- 분석에 사용된 표준물질은 MP는 Supelco 人KBellefOnte, PA, USA)에서 구입하였고, EP, PP, BP는 Fluka 사(Steinheim, Gemany)의 제품을 사용하였다. 내부표 준물질(Internal Standard, IS)로 사용된 4종 MP-d4, EP-d4, PP-d4, BP-d4는 CND ISOTOPES사(Montreal, Quebec, Canada) 에서 구입하여 사용하였다. 액체상 추출과 HPLC 이동상에 사용된 증류수, 아세토 니트릴(ACN), 메틸-1-부틸에터 (MTBE)는 Burdick&Jackson 사(Muskegon, MI, USA)에서 구입하였으며, 모유의 단백질, 지방 가수분해를 위한 프로테아제(3.
- 모유 중 파라벤류 분석대상물질은 MP, EP, PP, BP이며, 분 자구조는 Fig. 1과 같다. 분석에 사용된 표준물질은 MP는 Supelco 人KBellefOnte, PA, USA)에서 구입하였고, EP, PP, BP는 Fluka 사(Steinheim, Gemany)의 제품을 사용하였다.
- 1과 같다. 분석에 사용된 표준물질은 MP는 Supelco 人KBellefOnte, PA, USA)에서 구입하였고, EP, PP, BP는 Fluka 사(Steinheim, Gemany)의 제품을 사용하였다. 내부표 준물질(Internal Standard, IS)로 사용된 4종 MP-d4, EP-d4, PP-d4, BP-d4는 CND ISOTOPES사(Montreal, Quebec, Canada) 에서 구입하여 사용하였다.
- 내부표 준물질(Internal Standard, IS)로 사용된 4종 MP-d4, EP-d4, PP-d4, BP-d4는 CND ISOTOPES사(Montreal, Quebec, Canada) 에서 구입하여 사용하였다. 액체상 추출과 HPLC 이동상에 사용된 증류수, 아세토 니트릴(ACN), 메틸-1-부틸에터 (MTBE)는 Burdick&Jackson 사(Muskegon, MI, USA)에서 구입하였으며, 모유의 단백질, 지방 가수분해를 위한 프로테아제(3.5 unit/mg solid)와 리 파아제(700 unit/mg solid), 그리고 글루크로나이드 결합을 가수분해하기 위한 p-glucuronidase 효소는 Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 이용하였다.
데이터처리
- 2, 5, 20 ng/mL)로 각각 7개씩 준비하고, 각 시료를 동일한 전치리 방법으로 추출하여 LC-MS/MS 시스템으로 정량분석 하였다. 검출 한계 (Limit of Detection, LOD)는 7번 반복 측정하여 얻어 진 값의 표준편차(SD)에 3.143을 곱한 값으로 하였고, 정 량한계(Limit of Quantitation, LOQ)는 검출한계 값에 3.3을 곱하여 계산하였다. 파라벤류 4종의 검량선은 우유에 0.
- 표준물질을 첨가하여 동일한 방법으로 전처리 과정을 거 친 후, LC-MS/MS 시스템을 통해 정량분석 하였다. 정확도 (accuracy)는 회수율(recovery, %)을 이용하여 평가하였으 며, 정밀도(precision)는 7번 반복 측정한 분석결과의 상대 표준편차(RSD, %)를 이용하였다. 본 연구에서 우유를 통해 얻어진 분석법이 실제 모유에 적용가능한지를 검증하는 실험을 실시하였다.
성능/효과
- 5 파라벤류는 여성의 유방 조직에서 측정되며,2,6 유 방암 발병률을 증가시키고,7 남성에게서는 남성호르몬의 일종인 테스토스테론의 감소와 정액의 질이 저하된다.8 특 히 영유아 및 태아에게 노출될 경우 생식기 기형, 고환암, 정자 감소, 미성숙, 성조숙증 등 성장발달에 많은 영향을 미친다.9 이러한 위험성이 알려지면서 유럽연합(EU)에서는 소비 자 제품과 관련하여 소비자과학위원회(SCCP)에서 검토된 파라벤 사용에 대한 제한을 설정하고 있다.
- 전처리 및 분석은 확립된 방법을 적용시켰으며, LC-MS/MS 시스템으로 정량분석 하였다. 결과 및 고찰 분석법 검증 결과 파라벤류의 LOD는 각각 MP 0.043 ng/mL, EP 0.019 ng/mL, PP 0.021 ng/mL, BP 0.044 ng/mL이었고, LOQ는 각각 MP 0.142 ng/mL, EP 0.063 ng/mL, PP 0.069 ng/mL, BP 0.145 ng/mL 이었다. 검량선 회귀직선의 결정계수(r2) 값은 0.
- a는 공시료(시판 우유), b는 표준물질 10 ng/mL 를 첨가한 공시료, c 는 실제 모유를 전처리하여 분석한 크 로마토그램이다. 기존에 모유의 분석법과 본 연구에서 제시한 새로운 분 석법의 검출한계를 비교하면, 본 연구와 같거나 동일한 능 력을 가진 분석기기를 사용하였지만, 파라벤류 4종의 검 출한계는 0.1〜0.2 ng/mL 수준이었다.14-以2。이에 반해, 본 연구에서 얻어진 검출한계 값은 0.
- 9999 으로 매우 안정적인 직성성을 나타내었다(Thbe 3). 또한, 정확도는 85.3〜105.9%, 정밀도는 1.2〜7.1%로 안정적인 값을 얻었다(Tbe 4). 본 연구에서 확립된 분석법으로 파라벤류를 분석하기 위한 LC-MS/MS의 크로마토그램은 Fig.
- 999)을 나타내었다. 모유 중 파라벤류 분석결과 한국인 10명의 모유 시료를 수집하여 파라벤류를 분석한 결과 MP는 60%, EP는 70%, PP는 90%의 검출률을 보였고, BP는 모든 시료에서 검출되지 않았다. 모유 중 파라벤류의 평균농도 士 표준편차는 MP 0.
- 또 한 본 연구에서는 모유의 단백질과 지방의 분해를 위해 효 소처리를 하였지만, 기존의 연구들은 단백질 침전,2』4,22 필 터21등만 실시하였다. 본 연구에서 제시한 분석법은 기존 연구들에 비해 낮은 검출한계 값을 얻어 저농도의 인체노 출평가에 적합하며, 분석법의 유효성 검증 결과, 정확도 및 정밀도가 안정적인 값을 보였고, 회귀 직선 또한 뚜렷한 직선성(r2 > 0.999)을 나타내었다. 모유 중 파라벤류 분석결과 한국인 10명의 모유 시료를 수집하여 파라벤류를 분석한 결과 MP는 60%, EP는 70%, PP는 90%의 검출률을 보였고, BP는 모든 시료에서 검출되지 않았다.
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