[논문]LC-MS/MS 시스템을 이용한 소변 중 N-니트로사민류 분석법 확립

박나연; 정웅; 고영림

doi:10.5012/jkcs.2017.61.2.51

LC-MS/MS 시스템을 이용한 소변 중 N-니트로사민류 분석법 확립
Analysis Method of N-Nitrosamines in Human Urine by LC-MS/MS System 원문보기

대한화학회지 = Journal of the Korean Chemical Society, v.61 no.2, 2017년, pp.51 - 56

박나연 (을지대학교 보건환경안전학과) , 정웅 (경희대학교 의과대학 응급의학과) , 고영림 (을지대학교 보건환경안전학과)

초록
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N-니트로사민은 이차 아민과 아질산이 산성조건 하에서 니트로소화 반응을 통해 생성되는 니트로소 화합물이다. 약 300여종이 존재하며, 그 중 90%가 동물실험을 통해 발암성이 있음이 확인되었다. 1987년 IARC에서 NDMA와 NDEA를 Group 2A로 지정하였고, NDPA, NDBA, NPYR, NPIP, NMOR을 Group 2B로 지정하였다. 본 연구에서는 N-니트로사민류의 생물학적 모니터링을 위하여 소변 중 N-니트로사민류의 분석법을 확립하였다. 소변시료는 고체상추출(Solid phase extraction, SPE)을 통하여 전처리 한 후, LC-(APCI)-MS/MS를 이용하여 정량분석 하였다. 확립된 분석법의 정확도는 85.8~110.2% 이었고, 정밀도는 1.1~10.5%로 나타났다. 검출한계는 0.0002 (NDBA) ~ 0.0793 (NDMA) ng/ml 이었고, 검량선 회귀식의 상관계수($r^2$)은 0.999 이상으로 우수한 직선성을 보여주었다. 실제 소변 중 N-니트로사민류의 평균 농도는 NDMA 2.645 mg/g creatinine, NDEA 0.067 mg/g creatinine, NMEA 0.009 mg/g creatinine, NDBA 0.011 mg/g creatinine, NPIP 0.271 mg/g creatinine, NPYR 0.413 mg/g creatinine 이고, NDPA와 NMOR은 검출되지 않았다. 추후 N-니트로사민류의 인체 노출량 평가 및 위해평가를 위한 기기분석방법으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

N-nitrosamines are the nitroso compounds which are produced by nitrosation reactions of the secondary amine and nitrite under acidic conditions. Approximately 300 species of N-nitrosamine have been tested for carcinogenicity in laboratory experiments, with 90% of them demonstrated carcinogenic effects different animal species, including higher primates. In 1978, IARC classified NDMA and NDEA as Group 2A, and NDPA, NDBA, NPIP, NPYR and NMOR as Group 2B. In this study, we established pretreatment and analytical method for N-nitrosamines (NDMA, NDEA, NMEA, NDPA, NDBA, NPIP, NPYR and NMOR) in human urine for biological monitoring of N-nitrosamines. The analytes were extracted using solid phase extraction (SPE), then quantitative analysis was performed by LC-(APCI)-MS/MS. The accuracies of the established method were between 85.8~108.7% and precisions were lower than 20%. The limit of detection (LOD) were between 0.0002 (NDBA) and 0.0793 (NDMA) ng/ml. The linearity obtained was satisfying for the 8 N-nitrosamines, with a coefficient of determination ($r^2$) higher than 0.999. The mean concentrations of N-nitrosamines in the urine were 2.645 mg/g creatinine for NDMA, 0.067 mg/g creatinine for NDEA, 0.009 mg/g creatinine for NMEA, 0.011 mg/g creatinine for NDBA, 0.271 mg/g creatinine for NPIP and 0.413 mg/g creatinine for NPYR. NDPA and NMOR were not detected. It can be used as a instrumental methodology for evaluation and risk assessment of human exposure to N-nitrosamines for the further research.

주제어

표/그림 (6)

그림 Figure 1. The chemical structures of 8 N-nitrosamines.
표 Table 1. Mass spectrometry parameters for the 8 N-nitrosamines and their deuterium labeled internal standards
그림 Figure 2. LC-MS/MS chromatograms of N-nitrosamines.
표 Table 2. Intra-day accuracies and precisions (n=5)
표 Table 3. Inter-day accuracies and precisions (3 days)
표 Table 4. The concentration of N-nitrosamines in the urine (unit: mg/g creatinie)

AI 본문요약
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문제 정의

28−30 N-니트로 사민류는 수용성이 크며, 소변시료의 특성상 LC를 이용한 분석이 유리하므로 본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 분석법을 확립하였다.
본 연구는 소변 중 N-니트로사민류를 추출해내는 전처리법과 각 물질을 분리하기 위한 최적의 LC-MS/MS 시스템의 조건을 확립하였다. 또한, 확립된 분석법의 검증 결과 우수한 직선성과 분석에 적합한 정확도, 정밀도 및 검출 한계를 보였으며, 실제 소변 중 N-니트로사민류 분석을 통해 분석법의 적용성을 검토하였다.
이에 본 연구는 N-니트로사민의 인체노출을 평가하기 위하여 소변 중 N-니트로사민의 전처리 방법과 기기분석 법을 확립하고자 하였다. 본 연구를 통해 확립된 분석법의 검증을 위해 정확도, 정밀도 및 검출한계를 구하고, 실제 소변시료 중 N-니트로사민 노출량을 확인하고자 하였다.
이에 본 연구는 N-니트로사민의 인체노출을 평가하기 위하여 소변 중 N-니트로사민의 전처리 방법과 기기분석 법을 확립하고자 하였다. 본 연구를 통해 확립된 분석법의 검증을 위해 정확도, 정밀도 및 검출한계를 구하고, 실제 소변시료 중 N-니트로사민 노출량을 확인하고자 하였다.

제안 방법

MS/MS를 이용한 정량분석은 APCI positive 모드로 진행하였으며, 질량분석기를 통해 얻어진 N-니트로사민류의 모분자(parent ion, m/z, Q1)와 딸분자(daughter ion, m/z, Q3) 및 필요한 에너지 값은 Table 1에 제시하였다. Curtain gas는 25 psi, Gas 1은 60 psi, NC(nebulizer current)는 3.
0분에 이동상 B 20%로 시작하여 4분까지 이동상 B를 70% 까지 증가시키고, 1분간 유지시켰다. 그리고 8분까지 이동상 B를 90%로 증가시키고 1분간 유지한 후, 9.1분에 초기조건(이동상 B, 20%)으로 되돌린 후 6분간 유지시켰다.
본 연구는 소변 중 N-니트로사민류를 추출해내는 전처리법과 각 물질을 분리하기 위한 최적의 LC-MS/MS 시스템의 조건을 확립하였다. 또한, 확립된 분석법의 검증 결과 우수한 직선성과 분석에 적합한 정확도, 정밀도 및 검출 한계를 보였으며, 실제 소변 중 N-니트로사민류 분석을 통해 분석법의 적용성을 검토하였다. 그 결과, 추후 N-니트로사민류의 인체 노출량 평가 및 위해평가를 위한 기기분석방법으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
준비된 시료에 내부표준물질을 첨가한 후, 본 연구에서 확립된 전처리 과정을 거쳐 정량분석 하여 일내 정확도 및 정밀도를 계산하였고. 이 과정을 3일간 반복하여 3일간 정확도 및 정밀도를 구하였다. 정확도(accuracy)는 회수율 (recovery, %)을 이용하여 평가하였으며, 정밀도는 5번 반복측정한 분석결과의 상대표준편차(RSD, %)를 이용하였다.
인체시료 중 N-니트로사민류의 분석은 주로 소변을 통해 진행되어 왔으며, 액체상 추출(liquid liquid extraction, LLE),¹³ 고체 액체 추출(Solid liquid extraction, SLE),^14,15고체상 추출(solid phase extraction, SPE)¹⁶ 과 같은 전처리 방법을 이용하였으며, GC-MS/MS 및 LC-MS/MS를 이용하여 정량분석 하였다.
정확도(accuracy) 및 정밀도(precision) 평가를 위한 시료는 인공 소변 중 농도가 0.005, 0.05, 0.2, 1 ng/ml가 되도록 표준물질을 첨가하고, 농도별로 각각 5개씩 준비하였다. 준비된 시료에 내부표준물질을 첨가한 후, 본 연구에서 확립된 전처리 과정을 거쳐 정량분석 하여 일내 정확도 및 정밀도를 계산하였고.
제조된 인공 소변은 갈색병에 담아 –20 oC 이하에서 냉동보관 후, 사용 시 해동하여 분석에 사용하였다.
2, 1 ng/ml가 되도록 표준물질을 첨가하고, 농도별로 각각 5개씩 준비하였다. 준비된 시료에 내부표준물질을 첨가한 후, 본 연구에서 확립된 전처리 과정을 거쳐 정량분석 하여 일내 정확도 및 정밀도를 계산하였고. 이 과정을 3일간 반복하여 3일간 정확도 및 정밀도를 구하였다.

대상 데이터

LC-MS/MS 분석을 위한 주입량은 10 µl이며, 분리를 위한 이동상은 0.2% TFA 가 함유된 물과 아세토니트릴(B)을 사용하였다.
NDMA, NDEA, NMEA, NDPA, NDBA, NPYR, NPIP 등 N-니트로사민 7종은 EPA 521 nitrosamine mix(2,000 µg/ml), NMOR은 단일물질로 시그마-알드리치에서 구입하였다.
1에 나타내었다. 내부표준물질은 NDMA-d6, NDEA-d10, NMEA-d3, NDPAd14, NDBA-d18, NPYR-d8, NPIP-d10, NMOR-d10을 CDN isotopes(Quebec, Canada)에서 구입하였다. 아세토니트릴 (acetonitrile), 디클로로메탄(dichloromethane, DCM), 헥산 (hexane), 증류수는 Burdick&Jackson사(Muskegon, USA) 제품을 사용하였고, 인공 소변 제조에 사용되는 염화칼륨, 염화나트륨, 우레아, 시트르산, L-아스코르브산, 인산수 소칼륨, 크레아티닌, 수산화 나트륨, 중탄산 나트륨, 황산과 고체상 추출에 사용되는 Supelclean ^TM Coconut Charcoal SPE Tube(2 g/6 ml, Supelco)는 시그마 알드리치사(St Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 연구에서 사용된 분석기기는 고성능액체크로마토 그래피(high performance liquid chromatography, SI-2, Shiseido, Japan)와 탠덤질량분석기(mass spectrometry, triple quad 4500 system, AB SCIEX, USA)를 사용하였다.
아세토니트릴 (acetonitrile), 디클로로메탄(dichloromethane, DCM), 헥산 (hexane), 증류수는 Burdick&Jackson사(Muskegon, USA) 제품을 사용하였고, 인공 소변 제조에 사용되는 염화칼륨, 염화나트륨, 우레아, 시트르산, L-아스코르브산, 인산수 소칼륨, 크레아티닌, 수산화 나트륨, 중탄산 나트륨, 황산과 고체상 추출에 사용되는 Supelclean TM Coconut Charcoal SPE Tube(2 g/6 ml, Supelco)는 시그마 알드리치사(St Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.

데이터처리

이 과정을 3일간 반복하여 3일간 정확도 및 정밀도를 구하였다. 정확도(accuracy)는 회수율 (recovery, %)을 이용하여 평가하였으며, 정밀도는 5번 반복측정한 분석결과의 상대표준편차(RSD, %)를 이용하였다. 본 연구에서는 미국 보건복지부(US Department of Health and Human Services) 산하 FDA가 정의한 분석절차의 검증에서 규정하고 있는 검출한계의 개념을 사용하였다(FDA, 1998).

이론/모형

정확도(accuracy)는 회수율 (recovery, %)을 이용하여 평가하였으며, 정밀도는 5번 반복측정한 분석결과의 상대표준편차(RSD, %)를 이용하였다. 본 연구에서는 미국 보건복지부(US Department of Health and Human Services) 산하 FDA가 정의한 분석절차의 검증에서 규정하고 있는 검출한계의 개념을 사용하였다(FDA, 1998).²³

성능/효과

N(7)-메틸 구아닌은 돌연변이를 유발하지 않지만, O(6)-메틸 구아닌은 DNA의 돌연변이를 유발한다.¹⁰ NDMA 치사량이 투여된 사람의 심근 및 심내막과 위장관에서 출혈이 발견되었고, NDMA가 함유된 음료수를 마시고 급성 간질환과 연관된 오심, 구토와 출혈을 보였으며, 일부는 사망에 이르렀다. NDEA 과다노출로 인해 나타나는 가능한 증상은 신경증상, 구토, 설사, 복부경련, 두통, 발열, 간 비대, 황달, 간, 신장, 폐의 기능 감소 등이 있다.
0267 ng/mL)의 값을 보였으며,^13,15,16 본연구에서 얻어진 검출한계와 비교하였을 때 NDEA. NMEA, NDBA, NDPA, NPIP, NPYR은 선행연구에서 제시한 검출한계 범위에 속하였으며, NDMA와 NMOR은 선행연구들 보다 검출한계가 높았다. 하지만 본 연구에서 실제 소변시료를 분석한 결과와 선행연구에서의 분석결과에서 NDMA는 대부분의 시료에서 검출되었고, NMOR는 대부분의 시료에서 검출되지 않았으므로^31,32 실제 소변시료 분석에는 문제가 없는 것으로 판단된다.
대상자 33명에 대한 소변 중 N-니트로사민의 평균 농도(최소~최대농도)는 NDMA 2.645(0.451~7.435) mg/g creatinine, NDEA 0.067(ND~0.151) mg/g creatinine, NMEA 0.009 (ND~0.058) mg/g creatinine, NDBA 0.011(0.002~0.047) mg/g creatinine, NPIP 0.271(0.009~3.641) mg/g creatinine, NPYR 0.413(0.026~4.079) mg/g creatinine 이고, NDPA와 NMOR은검출되지 않았다(Table 4).
소변시료의 전처리는 주로 액체상 추출(LLE), ¹³ 고체 액체 추출(SLE),^14,15고체상 추출(SPE)¹⁶ 을통해 이루어 졌다. 본 연구에서 전처리 방법을 비교하여 표준물질과 내부표준물질의 회수율이 100%에 근접한 고체상 추출 방법을 택하였다.
본 연구의 결과를 이전 연구결과와 비교하면 NDMA는 대부분의 시료에서 모두 검출되는 양상을 보인다. Seyler TH et al.
999 이상으로 우수한 직선성을 보여주었다. 분석대상물질의 검출한계는 NDMA 0.0793 ng/ml, NDEA 0.0029 ng/ml, NMEA 0.0064 ng/ml, NDBA 0.0002 ng/ml, NPIP 0.0007 ng/ml, NMOR 0.0180 ng/ml, NPYR 0.0212 ng/ml 이었다.
NMEA, NDBA, NDPA, NPIP, NPYR은 선행연구에서 제시한 검출한계 범위에 속하였으며, NDMA와 NMOR은 선행연구들 보다 검출한계가 높았다. 하지만 본 연구에서 실제 소변시료를 분석한 결과와 선행연구에서의 분석결과에서 NDMA는 대부분의 시료에서 검출되었고, NMOR는 대부분의 시료에서 검출되지 않았으므로^31,32 실제 소변시료 분석에는 문제가 없는 것으로 판단된다.

후속연구

또한, 확립된 분석법의 검증 결과 우수한 직선성과 분석에 적합한 정확도, 정밀도 및 검출 한계를 보였으며, 실제 소변 중 N-니트로사민류 분석을 통해 분석법의 적용성을 검토하였다. 그 결과, 추후 N-니트로사민류의 인체 노출량 평가 및 위해평가를 위한 기기분석방법으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	N-니트로사민은 무엇인가?	N-니트로사민은 이차 아민과 아질산이 산성조건 하에서 니트로소화 반응을 통해 생성되는 니트로소 화합물이다. 약 300여종이 존재하며, 그 중 90%가 동물실험을 통해 발암성이 있음이 확인되었다.
	N-니트로사민을 인체 내에서 생성하는 과정은 무엇인가	인간의 위액 내에서 N-니트로사민의 합성되고, 방광이나 구강 내에 세균에 의한 감염이 있을 경우에 세균이 소변이나 타액 중에 존재하는 질산염을 아질산염으로 변화시켜 결국 아질산염과 아민류가 니트로소화 반응을 통해 N-니트로사민을 생성할 수 있다.7−9 NDMA는 체내에서 cytochrome p450에 의해 대사되어 친전자성 디아조늄 양이온을 형성하고, 디아조늄 양이온은 구아닌의 질소 또는 산소와 반응하여 N(7)-메틸 구아닌과 O(6)-메틸 구아닌을 생성한다.
	NDMA가 체내에서 생성하는 DNA돌연변이를 유발하는 물질은 무엇인가?	7−9 NDMA는 체내에서 cytochrome p450에 의해 대사되어 친전자성 디아조늄 양이온을 형성하고, 디아조늄 양이온은 구아닌의 질소 또는 산소와 반응하여 N(7)-메틸 구아닌과 O(6)-메틸 구아닌을 생성한다. N(7)-메틸 구아닌은 돌연변이를 유발하지 않지만, O(6)-메틸 구아닌은 DNA의 돌연변이를 유발한다.10 NDMA 치사량이 투여된 사람의 심근 및 심내막과 위장 관에서 출혈이 발견되었고, NDMA가 함유된 음료수를 마시고 급성 간질환과 연관된 오심, 구토와 출혈을 보였으며, 일부는 사망에 이르렀다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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