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문제 정의
- 꼼치는 침 성 부착 난을 낳고, 치어기(14 mm 전후) 이후에 배지느러미가 흡반으로 변형되어(Okiyama, 1988) 해류에 의한 확산 정도가 다소 미약할 것으로 추정되므로 지역 집단을 형성할 가능성이 높다고 판단된다. 따라서 본 연구는 우리나라 3개 해역(동해, 서해, 남해)에 서식하는 꼼치를 대상으로 분자 및 형태 분석을 통해 지역 집단간 차이 유무를 파악하고자 한다.
제안 방법
- (1996) 의 L-GLUDG (5′-TGA CTT GAA RAA CCA YCG TTG-3′)와 H-CB3 (5′-GGC AAA TAG GAA RTA TCA TTC-3′) primer를 이용하였다. 10X PCR buf- fer 3 μL, 2.5 mM dNTP 2.4 μL, GluDGD primer 1 μL, CB3 primer 1 μL, Ex-Taq DNA polymerase 0.1 μL (GnP, Korea) 를 섞은 혼합물에 total DNA 3 μL를 첨가한 후, 총 30 μL가 될 때까지 3차 증류수를 넣고 Thermal cycler (Bio-rad MJ mini PTC-1148, USA)를 이용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. Initial denaturation 94℃에서 5분; PCR reaction 35 cycles (denaturation 94℃에서 1분, annealing 59℃에서 1분, extension 72℃에서 1분); final extension 72℃에서 5분 실시하였다.
- Genomic DNA는 99% 에탄올에 보관된 꼼치의 근육조직을 Chelex 100 resin (Bio-rad, USA) 150 μL에 넣은후, Thermal cycler (Bio-rad MJ mini PTC-1148, USA)를 이용하여 60℃와 99℃에 각각 20분, 25분간 두었다. 추출된 Genomic DNA는 4℃에서 냉장보관하였다.
- 계수형질 4개, 계측형질 20개는 Nakabo (2002)의 방법에 의거 측정하였다. 계측형질은 버니어캘리퍼스로 0.1 mm 단위까지 측정하였고, 계측치는 로그 변환 후 주성분분석(PCA) 및 정준 판별분석(CDA)을 통해 지역집단의 분리 여부를 파악하였다. 각 지느러미 기조수 및 척추골수는 radiograph (SOFTEX HA-100, Japan)를 이용하여 측정하였으며 비모수검정법인 Kruskal-Wallis test를 통해 지역 집단간 차이 유무를 파악하였다.
- , 2011)에서 Kimura- 2-Parameter모델(Kimura, 1980)을 이용하여 구하였다. 분지도 는 최소근접네트워크(Minimum spanning network)를 이용하여 작성하였고 bootstrape 1,000번 수행하였다. 외집단은 Liparis liparis (EU492094)로 설정하였다.
- 정제는 ExoSAP-IT (United States Biochemical Corporation, USA)를 이용하였다. 염기서열은 ABI 3730XL sequencer (Applied biosystems Inc., USA)에서 ABI Bigdye terminator cycle sequencing ready reaction kit v3.1 (Applied Biosysterms Inc., USA)를 이용하여 얻었다.
- 지역 집단간 유전적 분화 정도를 나타내는 고정지수(FST) 는 Rice (1989)의 방법으로 구하였고, 이때 유의성 검증을 위해 1,000번의 bootstrap을 실시하였다. 지역 집단의 유전적 다양성이 중립성과 개체군 평형을 따르는지 알기 위해 Tajima’s D (Tajima, 1989) 및 Fu’s Fs (Fu, 1997) 테스트를 실시하였다. 또한, 집단 크기의 변천 역사는 Rogers and Harpending (1992)의 Mismatch distribution 분석을 통해 추정하였고, 집단의 팽창 시기는 Li (1997), 팽창 전후의 집단크기는 Rogers and Harpend- ing (1992)의 방법을 따라 계산하였다.
대상 데이터
- 2011년 1월부터 2012년 12월까지 동해(경상북도 포항), 서해 (충청남도 보령), 남해(경상남도 진해)에서 총 90개체를 채집하여 형태 및 분자 분석을 실시하였다(Fig. 1). DNA분석용 근육은 99% 에탄올로 고정시킨 후 -20℃에서 냉동 보관하였으며, 어체는 5% 포르말린에 7일간 고정시켰다가 3일간 흐르는 물로 세척한 후 70% 에탄올에 넣어 보관하였다.
- 미토콘드리아 DNA cytochrome b (cytb) 영역을 증폭시키기 위해 Palumbi et al. (1996) 의 L-GLUDG (5′-TGA CTT GAA RAA CCA YCG TTG-3′)와 H-CB3 (5′-GGC AAA TAG GAA RTA TCA TTC-3′) primer를 이용하였다. 10X PCR buf- fer 3 μL, 2.
- 분지도 는 최소근접네트워크(Minimum spanning network)를 이용하여 작성하였고 bootstrape 1,000번 수행하였다. 외집단은 Liparis liparis (EU492094)로 설정하였다. 지역 집단의 전이율 및 전환율은 Arlequin ver 3.
- Initial denaturation 94℃에서 5분; PCR reaction 35 cycles (denaturation 94℃에서 1분, annealing 59℃에서 1분, extension 72℃에서 1분); final extension 72℃에서 5분 실시하였다. 정제는 ExoSAP-IT (United States Biochemical Corporation, USA)를 이용하였다. 염기서열은 ABI 3730XL sequencer (Applied biosystems Inc.
데이터처리
- 1 mm 단위까지 측정하였고, 계측치는 로그 변환 후 주성분분석(PCA) 및 정준 판별분석(CDA)을 통해 지역집단의 분리 여부를 파악하였다. 각 지느러미 기조수 및 척추골수는 radiograph (SOFTEX HA-100, Japan)를 이용하여 측정하였으며 비모수검정법인 Kruskal-Wallis test를 통해 지역 집단간 차이 유무를 파악하였다. 모든 통계 분석은 SPSS ver 12.
- 외집단은 Liparis liparis (EU492094)로 설정하였다. 지역 집단의 전이율 및 전환율은 Arlequin ver 3.5.1.2 (Excoffier et al., 2005)를 사용하여 계산하였고, 염기다양성(π, Nei and Li, 1979) 및 유전자형 다양성(h, Nei, 1987)도 Arlequin 프로그램으로 계산하였다. 지역 집단간 유전적 분화 정도를 나타내는 고정지수(FST) 는 Rice (1989)의 방법으로 구하였고, 이때 유의성 검증을 위해 1,000번의 bootstrap을 실시하였다.
이론/모형
- 계수형질 4개, 계측형질 20개는 Nakabo (2002)의 방법에 의거 측정하였다. 계측형질은 버니어캘리퍼스로 0.
- 지역 집단의 유전적 다양성이 중립성과 개체군 평형을 따르는지 알기 위해 Tajima’s D (Tajima, 1989) 및 Fu’s Fs (Fu, 1997) 테스트를 실시하였다. 또한, 집단 크기의 변천 역사는 Rogers and Harpending (1992)의 Mismatch distribution 분석을 통해 추정하였고, 집단의 팽창 시기는 Li (1997), 팽창 전후의 집단크기는 Rogers and Harpend- ing (1992)의 방법을 따라 계산하였다.
- 미토콘드리아 DNA cytb 영역의 염기서열은 BioEdit ver 7 의 ClustalW (Thompson et al., 1994)를 이용하여 정렬하였다. 유전거리는 Mega 5 (Tamura et al.
- , 1994)를 이용하여 정렬하였다. 유전거리는 Mega 5 (Tamura et al., 2011)에서 Kimura- 2-Parameter모델(Kimura, 1980)을 이용하여 구하였다. 분지도 는 최소근접네트워크(Minimum spanning network)를 이용하여 작성하였고 bootstrape 1,000번 수행하였다.
- , 2005)를 사용하여 계산하였고, 염기다양성(π, Nei and Li, 1979) 및 유전자형 다양성(h, Nei, 1987)도 Arlequin 프로그램으로 계산하였다. 지역 집단간 유전적 분화 정도를 나타내는 고정지수(FST) 는 Rice (1989)의 방법으로 구하였고, 이때 유의성 검증을 위해 1,000번의 bootstrap을 실시하였다. 지역 집단의 유전적 다양성이 중립성과 개체군 평형을 따르는지 알기 위해 Tajima’s D (Tajima, 1989) 및 Fu’s Fs (Fu, 1997) 테스트를 실시하였다.
성능/효과
- 243)가 3개 지역을 분리하는데 가장 기여한 형질이었다(Table 5). CDA 결과 1, 2축으로 3개 지역이 명확하게 구분되었고, 1축으로는 진해가 다른 2개 지역과 잘 분리되었으며, 2축으로는 보령과 포항이 잘분리되었다(Fig. 3).
- 05). Mismatch distribution 분석 결과에서는 3개의 지역 모두 급격한 팽창 모델을 잘 반영해 주는 것으로 나타났으며(보령: P=0.25, 진해: P=0.11, 포항: P=0.68), 세 집단은 mismatch distribution에서 1 개의 peak를 보였다(Fig. 5).
- 나머지 유전자형(LTcytb4- Ltcytb7)은 각 지역마다 독특하게 가지는 것으로 나타났다. 꼼치 73개체의 염기서열과 외집단인 Liparis liparis (EU492094)와의 염기서열 분석 결과, 꼼치의 종내 유전거리는 0.0-0.3%였고, L. liparis와의 유전거리는 12.3-12.7%의 범위를 나타내었다.
- 꼼치의 계측형질 20개로 주성분분석을 실시한 결과, 세 지역 (보령, 진해, 포항)이 약간중첩되는 경향을 보였으나, 제 2축을 기준으로 보령이 나머지 두 지역(진해, 포항)보다 약간 높은 값을 보이면서 구분되었다(Fig. 2). 반면, 정준판별분석은 세 지역을 명확히 구분지어 주었다(Fig.
- 유전자형 다양도와 염기 다양도가 낮은 집단은 최근 병목현상이 일어난 집단으로 볼 수 있다(Grant and Bowen, 1998). 본 연구에서 보령이 유전자형과 염기 다양 도에서 낮은 값을 나타냈으며, 진해와 포항은 높은 유전자형 다양 도와 낮은 염기 다양도를 나타내어 병목현상이 일어난 뒤 급격한 팽창 사건이 있었음을 알 수 있다(Grant and Bowen, 1998). 일반적으로 미토콘드리아 DNA cytb 영역의 돌연변이율은 100만년당 2%로 알려져 있다(Liu et al.
- 세 지역 집단은 대부분 542번째 염기서열에서 G를 가지고 있었지만, 진해와 포항 9개체에서는 A를 가져 보령과 의미 있는 차이를 보였다. 뿐만 아니라 362번째 염기서열에서도 대부분 T 를 가졌으나 진해와 포항 3개체에서만 C를 가져 역시 보령과 의미 있는 차이를 보였다.
- 4). 세 지역(보령, 진해, 포항)은 모두 LTcytb1이란 거대 유전자형을 공유하고 있으며, 진해와 포항만 LTcytb2의 단일 유전자형을 가졌다. 또한, 진해는 포항과 LTcytb3의 유전자형도 공유하였다.
- 2). 정준판별분석(CDA)을 실시한 결과, 각 지역 집단은 매우 높은 판별적중율(보령과 포항은 96.6%, 진해는 100%)을 보였다. 1축의 고유치는 3.
- 계수형질의 빈도 분포는 Table 2에 나타내었다. 지역 집단간 계수형질 차이 유무를 파악하기 위한 Kruskal-Wallis test 결과, 뒷지느러미 수에서만 유의한 차이를 보였다(P<0.05) (Table 3).
- 253%)이었다(Table 4). 총 20개의 계측형질 중 전장(고유치: 0.936), 체장(0.933) 및 등지느러미 앞길이(0.9358) 가 1축에서 가장 큰 기여율을 나타내었고, 흡반과 항문사이 길이(0.772)가 2축에서 가장 큰 기여율을 나타내었다(Table 4). PCA 결과 1축으로는 3개 지역이 대부분 중첩되어 보였지만 2 축으로는 보령이 나머지 두지역과 약간 구분되었다(Fig.
- 713)을 보였다. 팽창 전 돌연변이 매개변수(θ0)는 세 지역 모두 0 이었지만, 팽창 후 돌연 변이 매개변수(θ1)는 진해와 포항이 99999.0로 최대를 나타내었고, 보령만 0.091로 매우 낮았다(Table 9). Tajima's D test는 세 지역 모두 음의 값을 보였으나, 집단의 급격한 팽창 모델과달랐다(P>0.
- 한국산 꼼치의 유전자형은 7개로, 그 중 LTcytb1이 55개체에서 나타나 가장 우점하였고(75.34%), 이 유전자형은 3 지역(보령, 진해, 포항)에서 모두 발견되었다. 그 다음으로 LTcytb2가 9개체에서 나타나 우점하였는데(25.
후속연구
- 본연구에서 꼼치는 정준판별분석으로 3개 지역집단으로 명확하게 구분되었으므로 3개의 관리단위를 설정할 필요가 있다고 생각되지만, 분자분석 결과에서는 2개 집단(보령 vs. 진해와 포항) 으로 구분되었기 때문에 향후 보다 민감도가 높은 microsatel- lite DNA에 의한 추가 분석이 필요하다.
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