3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A 환원효소의 억제제로 알려진 statin은 고지혈증 치료제로 널리 사용되고 있고, 또한 다양한 암에서 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다. 최근 연구에서는 reactive oxygen species (ROS)가 세포사멸 신호에 중요한 역할을 한다고 보고하였지만, rosuvastatin에 의한 ROS 생성의 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포를 이용하여 rosuvastatin에 의한 세포사멸 경로를 확인하였다. 세포독성, 세포사멸과 ROS의 생성을 측정하기 위해서 MTT assay, annexin V/PI 염색과 DCFH-DA염색을 통해 flow cytometry에 의해 측정하였다. 본 연구의 결과에서, rosuvastatin은 농도와 시간 의존적으로 세포 생존율 감소와 세포형태변화를 확인할 수 있었다. Flow cytometry 분석을 통해 세포주기와 apoptosis를 확인하였고 Western blotting assay를 통하여 PARP와 procaspase-3가 감소되는 것을 통해 apoptosis를 재확인 할 수 있었다. 또한 rosuvastatin은 농도 의존적으로 ROS 생산을 증가하였고, ROS 생성 저해제인 N-acetylcysteine (NAC) 처리를 통해 ROS와 apoptosis가 회복되었다. 따라서 rosuvastatin이 ROS 생성을 통해 apoptosis를 유도한다는 것을 알 수 있었고, 이는 인간 전립선 암세포에 대한 항암치료제로서의 가능성을 제시한다.
3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A 환원효소의 억제제로 알려진 statin은 고지혈증 치료제로 널리 사용되고 있고, 또한 다양한 암에서 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다. 최근 연구에서는 reactive oxygen species (ROS)가 세포사멸 신호에 중요한 역할을 한다고 보고하였지만, rosuvastatin에 의한 ROS 생성의 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포를 이용하여 rosuvastatin에 의한 세포사멸 경로를 확인하였다. 세포독성, 세포사멸과 ROS의 생성을 측정하기 위해서 MTT assay, annexin V/PI 염색과 DCFH-DA염색을 통해 flow cytometry에 의해 측정하였다. 본 연구의 결과에서, rosuvastatin은 농도와 시간 의존적으로 세포 생존율 감소와 세포형태변화를 확인할 수 있었다. Flow cytometry 분석을 통해 세포주기와 apoptosis를 확인하였고 Western blotting assay를 통하여 PARP와 procaspase-3가 감소되는 것을 통해 apoptosis를 재확인 할 수 있었다. 또한 rosuvastatin은 농도 의존적으로 ROS 생산을 증가하였고, ROS 생성 저해제인 N-acetylcysteine (NAC) 처리를 통해 ROS와 apoptosis가 회복되었다. 따라서 rosuvastatin이 ROS 생성을 통해 apoptosis를 유도한다는 것을 알 수 있었고, 이는 인간 전립선 암세포에 대한 항암치료제로서의 가능성을 제시한다.
Statins, the inhibitors of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, are widely used in treatments of hypercholesterolemia and newly known as anti-cancer effect of various cancer cells. Recently, several studies suggested that reactive oxygen species (ROS) play a critical role on ce...
Statins, the inhibitors of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, are widely used in treatments of hypercholesterolemia and newly known as anti-cancer effect of various cancer cells. Recently, several studies suggested that reactive oxygen species (ROS) play a critical role on cell death signaling. However, mechanism of ROS by rosuvastatin is currently unclear. This study aimed to explore the molecular mechanism of apoptosis by rosuvastatin in human prostate cancer PC-3 cells. Cell viability and apoptosis-related protein expression were measured by MTT assay and western blotting, respectively. In addition, the levels of apoptosis and ROS were analyzed. The results showed that rosuvastatin dramatically reduced cell viability in a dose- and time-dependent manner. We confirmed that rosuvastatin induced apoptosis through reduction of procaspase-3 and cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) in PC-3 cells. In addition, rosuvastatin stimulated ROS production in a dose-dependent manner and pre-treatment with N-acetylcysteine (NAC), a ROS scavenger, significantly recovered rosuvastatin-induced ROS and apoptosis. Thus, we concluded that rosuvastain induces apoptosis through generation of ROS in human prostate cancer PC-3 cells and provides a promising approach to improve the efficacy of cancer therapy.
Statins, the inhibitors of 3-hydroxy 3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, are widely used in treatments of hypercholesterolemia and newly known as anti-cancer effect of various cancer cells. Recently, several studies suggested that reactive oxygen species (ROS) play a critical role on cell death signaling. However, mechanism of ROS by rosuvastatin is currently unclear. This study aimed to explore the molecular mechanism of apoptosis by rosuvastatin in human prostate cancer PC-3 cells. Cell viability and apoptosis-related protein expression were measured by MTT assay and western blotting, respectively. In addition, the levels of apoptosis and ROS were analyzed. The results showed that rosuvastatin dramatically reduced cell viability in a dose- and time-dependent manner. We confirmed that rosuvastatin induced apoptosis through reduction of procaspase-3 and cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) in PC-3 cells. In addition, rosuvastatin stimulated ROS production in a dose-dependent manner and pre-treatment with N-acetylcysteine (NAC), a ROS scavenger, significantly recovered rosuvastatin-induced ROS and apoptosis. Thus, we concluded that rosuvastain induces apoptosis through generation of ROS in human prostate cancer PC-3 cells and provides a promising approach to improve the efficacy of cancer therapy.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 rosuvastatin이 인간 전립선암 세포 주인 PC-3 세포에 미치는 항암효과의 분자 생물학적 기전에 대하여 조사하였고, 그 중 ROS가 apoptosis 유발에 어떠한 영향을 미치는지도 조사하였다.
제안 방법
24시간 후, 약물 처리된 PC-3 세포를 회수하여 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하고 70% ethanol을 넣어 4℃에서 12시간 고정한 후, RNase A를 37℃에 반응 시켰 다. 1시간 후, DNA staining dye인 propidium iodide (PI)로 염색하여 flow cytometry (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.
1% Tween-20]를 이용하여 실온에서 2시간 blocking 하였다. 1차 antibody는 4℃에서 12시간 반응하였으며, 2차 항체는 상 온에서 2시간 반응하여 Enhanced Chemilluminescence (ECL) (iNtRON Biotechnology, Inc., Korea) 시약을 이용하여 발색하 고, fluorescence scanner (LAS-3000, Fuji Film, Tokyo, Japan) 을 이용하여 확인 하였으며, Multi Gauge V3.0 software를 이용하여 분석하였다.
PC-3세포 를 1×105 cells/well으로 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, rosuvastatin을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처 리하여 배양하였다. 24시간 후, 세포를 모은 다음 PBS로 세척 하고, cell pellet을 annexin V/PI 시약과 1x binding buffer를 사용하여 20분간 염색 시킨 후, 염색된 세포는 flow cytometry 를 이용하여 분석하였다.
PC-3 세포를 1×105 cells/well으로 6-well plate에 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, rosuvastatin을 다양한 농도별로 처리하였다. 24시간 후, 세포를 분리하여 PBS로 세척한 뒤, 10 μM의 DCFH-DA를 처리하여 37℃에서 30분간 염색 후 flow cytometry를 사용하여 측정하였다. ROS 생성을 억제하기 위하여 ROS scavenger로 알려진 NAC를 1시간 전처리 하였다.
0), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 20 mg/ml aprotinin, 50 μg/ml leupetin, 1 mM benzaidine, 1 mg/ml pepstain]를 첨가하여 4℃에 30분간 반응시킨 후, 원심 분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. Bradford법을 이용하여 정량 한 뒤, 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate–poly- acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 전기 영동으로 분리한 후, 분리된 단백질을 polyvinylidene di- fluoride (PVDF) membrane으로 transfer 하여 5% skim milk 가 함유된 TBS-T buffer [20 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20]를 이용하여 실온에서 2시간 blocking 하였다. 1차 antibody는 4℃에서 12시간 반응하였으며, 2차 항체는 상 온에서 2시간 반응하여 Enhanced Chemilluminescence (ECL) (iNtRON Biotechnology, Inc.
24시간 후, 세포를 분리하여 PBS로 세척한 뒤, 10 μM의 DCFH-DA를 처리하여 37℃에서 30분간 염색 후 flow cytometry를 사용하여 측정하였다. ROS 생성을 억제하기 위하여 ROS scavenger로 알려진 NAC를 1시간 전처리 하였다.
Rosuvastatin에 의한 PC-3 세포증식억제 현상이 세포주기 변화와 관련이 있는지 확인하기 위해, PC-3 세포에 rosuvasta- tin을 농도별로 처리하여 48시간 후에 PI 염색을 통해 세포주 기 변화를 flow cytometry로 측정하였다[11, 30]. Fig.
Rosuvastatin에 의한 ROS 생성이 apoptosis와 연관이 되어 있는지 확인하기 위하여 ROS scavenger인 NAC를 이용하여 annexin V/PI double statining으로 apoptosis를 확인하였다. 먼저, NAC를 1시간 전처리 한 후 48시간 동안 80 μM rosuvas- tatin을 처리하였을 때, rosuvastatin 단독으로 처리 한 apop- tosis의 비율은 30.
Rosuvastatin에 의한 apoptosis 유도를 확인하기 위하여 annexin V/PI detection kit을 이용하여 측정하였다. PC-3세포 를 1×105 cells/well으로 6-well plate에 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, rosuvastatin을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처 리하여 배양하였다.
Reactive oxygen species (ROS)는 세포에서 증식과 분화와 관련이 있으며 과도한 ROS는 세포사멸을 유도한다[2, 25, 29]. 따라서 rosuvastatin 처리에 따른 PC-3 세포의 세포사멸이 ROS 생성과 관련이 있는지 확인하기 위해서 DCFH-DA를 이용하여 flow cytometry로 분석하였다. DCFH-DA는 세포 안 으로 들어가서, ROS와 반응하여 DCF로 전환되어 형광을 나 타냄으로써 ROS 생성량을 측정할 수 있다[17].
따라서 rosuvastatin을 처리하였을 때 세포주기를 sub G1기로 제한함으로써 세포증식을 억 제하는 것을 알 수 있었다[12, 21, 26]. 또한, apoptosis 유도를 확인하기 위해 annexin V/PI double staining을 이용하여 flow cytometry로 측정하였다. Rosuvastatin을 농도별로 48시간 처리한 후 apoptosis를 측정한 결과, rosuvastatin을 10 μM 농도로 처리한 시료에서 4.
세포 내 ROS의 변화를 측정하기 위하여 DCFH-DA를 이용하여 측정하였다. PC-3 세포를 1×105 cells/well으로 6-well plate에 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, rosuvastatin을 다양한 농도별로 처리하였다.
반응이 끝난 후, 상등액을 제거하고 생성된 보라색의 formazan을 DMSO에 250 μl씩 분주하여 96-well plate에 100 μl씩 옮겨서 ELISA reader (VERSAMAX micro- plate reader, Molecular Devices, Toronto, Canada)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포형태 변화를 관찰하기 위하여 OLYPUS CKX41/31 도립 현미경(OLYMPUS, Tokyo, Japan)을 이용하여 각 농도에 따른 세포의 형태변화를 400배 배율로 관찰하였다.
최근 연구에서 statin 계열 화합물이 여러 종류의 암세포주 에 대한 항암효과를 나타낸다는 보고가 있었다[1, 7, 27, 35]. 이에 statin 계열의 rosuvastatin (Fig. 1A)을 이용하여 인간전 립선 암세포주인 PC-3 세포에 대한 세포독성 및 세포형태 변화를 측정하였다. Fig.
대상 데이터
(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 세포에 처리시 50% methanol로 희석하여 사용하였다. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylte- trazolium bromide (MTT), 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), N-acetylcysteine (NAC) and DMSO는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Annexin V/PI Staining Kit는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Annexin V/PI Staining Kit는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Western blotting에 사용한 Bax, Bcl-2, PARP, caspase-3 and β-actin antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA)에서 구입하였다.
Annexin V/PI Staining Kit는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Western blotting에 사용한 Bax, Bcl-2, PARP, caspase-3 and β-actin antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA)에서 구입하였다.
본 실험에서 사용된 rosuvastatine Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 세포에 처리시 50% methanol로 희석하여 사용하였다. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylte- trazolium bromide (MTT), 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), N-acetylcysteine (NAC) and DMSO는 Sigma Chemical Co.
인간 전립선 암 세포주인 PC-3는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS) (WelGene Inc, Gyeonsan-si, Korea)과 1% penicillin, streptomycin (WelGene Inc.)이 첨가 된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, WelGene Inc.) 배지를 사용하여 5%의 CO2가 포함된 37℃에서 배양하였다.
데이터처리
모든 실험의 결과는 3번 반복 수행하여 얻어진 것으로, 통계 분석은 ANOVA에 의해 분석하여 mean±S.D로 표시하였고, 통계적 유의성은 p≤0.05로 판정하였다.
이론/모형
Rosuvastatin에 의한 apoptosis 관련된 단백질의 발현을 확 인하기 위해 western blotting analysis를 이용하였다. 먼저 다양한 농도로 처리한 PC-3 세포를 모아 PBS로 세척한 후 lysis buffer [15 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7.
[22, 24]. Rosuvastatin이 apoptosis 관련 단백질의 발현을 조절 하는지 확인하기 위해서 western blotting assay를 이용하여 분석하였다. Bcl-2 family 중 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발 현량은 동일하였지만 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현량 은 감소하였다(Fig.
성능/효과
4A와 같이 rosuvastatin을 처리하였을 때 ROS 생성량이 농도 의존적으로 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. ROS 생성량은 대조군 (8.49%)에 비해 80 μM rosuvastatin 처리군(43.72%)은 약 5배 많은 ROS가 생성되었다. 이러한 rosuvastatin에 의한 ROS 생 성이 ROS scavenger인 N-acetylcysteine (NAC)에 의해서 억 제 되는지 확인하였다[23].
또한, apoptosis 유도를 확인하기 위해 annexin V/PI double staining을 이용하여 flow cytometry로 측정하였다. Rosuvastatin을 농도별로 48시간 처리한 후 apoptosis를 측정한 결과, rosuvastatin을 10 μM 농도로 처리한 시료에서 4.1%였지만 80 μM의 농도로 처리한 시료에서 30.21%로 apoptosis가 증가되는 것을 확인할 수 있 었다(Fig. 2B). 따라서 이러한 세포주기가 sub G1기로 정체 되 면서 apoptosis가 유도되는 것을 확인할 수 있었다[31].
또한 procaspase-3의 발현감소, 즉 cas- pase-3의 활성화에 의해 PARP의 분절화가 촉진되는 것을 확 인하였다. 따라서 rosuvastatine Bcl-2 family 단백질의 불균 형을 유도하고, caspase-3 의존적 경로를 통하여 apoptosis를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
1C). 따라서 rosuvstatine PC-3 세포에서 세포형태의 변화를 통해 농도 의존적으로 세포독성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
2 μM을 나타냈다. 또한 PC-3 세포에 미치는 형태변화를 관찰하기 위하여 다양한 농도로 rosuvastain을 처리하여 48시간 배양한 후 광학현미경 으로 관찰한 결과, 농도 의존적으로 형태적인 변형 뿐만 아니라 세포 밀도의 감소와 부착력이 떨어져 부유하는 세포들을 확인할 수 있었다(Fig. 1C). 따라서 rosuvstatine PC-3 세포에서 세포형태의 변화를 통해 농도 의존적으로 세포독성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
3). 또한 procaspase-3의 발현감소, 즉 cas- pase-3의 활성화에 의해 PARP의 분절화가 촉진되는 것을 확 인하였다. 따라서 rosuvastatine Bcl-2 family 단백질의 불균 형을 유도하고, caspase-3 의존적 경로를 통하여 apoptosis를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
5A). 또한, NAC를 전처리하여 apoptosis 관련 단백질 변화를 관찰한 결과, procaspase-3, PARP와 같은 apoptosis 관련 단백 질들의 발현량이 회복됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5B). 따라서 이러한 실험결과를 통해 rosuvastatin이 암세포에서 ROS를 생산함으로써 apoptosis를 유도하는 것을 알 수 있었다[6, 9, 10].
Rosuvastatin에 의한 ROS 생성이 apoptosis와 연관이 되어 있는지 확인하기 위하여 ROS scavenger인 NAC를 이용하여 annexin V/PI double statining으로 apoptosis를 확인하였다. 먼저, NAC를 1시간 전처리 한 후 48시간 동안 80 μM rosuvas- tatin을 처리하였을 때, rosuvastatin 단독으로 처리 한 apop- tosis의 비율은 30.21%가 나타났으나, NAC와 병행으로 처리 한 결과 21.43%로 감소함으로써, NAC의 처리가 ROS를 억제 시켜 apoptosis를 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 또한, NAC를 전처리하여 apoptosis 관련 단백질 변화를 관찰한 결과, procaspase-3, PARP와 같은 apoptosis 관련 단백 질들의 발현량이 회복됨을 확인할 수 있었다(Fig.
이러한 rosuvastatin에 의한 ROS 생 성이 ROS scavenger인 N-acetylcysteine (NAC)에 의해서 억 제 되는지 확인하였다[23]. 먼저, NAC를 1시간 전처리 한 후 48시간 동안 80 μM rosuvastatin을 처리하였을 때 ROS의 생성 이 억제 되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 이전 연구에서 도, 암세포에서 ROS의 증가는 apoptosis를 유도한다고 보고되어[18] rosuvastatine ROS를 농도 의존적으로 발생시키고 이후 apoptosis와 관련이 있을 것으로 생각된다.
이러한 ROS는 스트레스가 없는 상황에서 세포 내 신호전달에서 중요한 역할을 하지만, 과다한 양의 ROS는 산화적 스트레스 를 일으켜 DNA 손상, 노화와 apoptosis 등을 일으키게 된다. 본 연구에 사용된 rosuvastatine 고지혈증 치료제로 사용되는 statin 계열 중 하나이고 다른 statin 제제에 비해 우수한 지질농도 감소 효과를 가지고 있다[28]. Statine 3-hydroxy- 3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) 환원효소 억제제 로 HMG-CoA의 결합을 경쟁적으로 저해하여, 콜레스테롤 합 성과정의 HMG-CoA에서 mevalonate로 전환되는 것을 억제 하여 최종적으로 콜레스테롤의 합성을 감소시킨다[14].
후속연구
따라서 이러한 실험결과를 통해 rosuvastatin이 암세포에서 ROS를 생산함으로써 apoptosis를 유도하는 것을 알 수 있었다[6, 9, 10]. 따라서 고지혈증 치료제로 사용하고 있는 rosuvastatin이 항암효과를 가진 약물로서 사용될 수 있는 기초 자료를 제시 할 수 있었다.
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