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문제 정의
- 본 연구에서는 번식시기와 비 번식시기를 포함하여 동면 여부에 따른 암컷과 수컷 남생이의 계절적 체내 성호르몬 변화를 측정하고 산란기를 전후 하여 암컷 내 여포와 알의 발달과정을 추적하였다. 또한, 암컷과 수컷 사이의 구애행동을 포함하는 행동적 상호작용을 연구하여, 남생이의 기초 번식생리 자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구에서는 번식시기와 비 번식시기를 포함하여 동면 여부에 따른 암컷과 수컷 남생이의 계절적 체내 성호르몬 변화를 측정하고 산란기를 전후 하여 암컷 내 여포와 알의 발달과정을 추적하였다. 또한, 암컷과 수컷 사이의 구애행동을 포함하는 행동적 상호작용을 연구하여, 남생이의 기초 번식생리 자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- 검사를 진행하는 동안, 초음파기계의 probe의 접근이 제한적이어서 한 번에 확인할 수 있는 개체 내 여포와 난각이 형성된 알의 수가 제한적 이었다. 또한 가능한 중복으로 헤아리는 것을 방지하기 위하여 여포와 난각이 형성된 알의 수를 각각 최대 3개까지 헤아렸다. 파악된 여포와 알의 최대 장경을 각각 0.
- 0-4300 pg/㎖ 혈장 이었다. 사람 성호르몬 항체가 신뢰성 있게 거북류의 호르몬을 측정한다는 사전연구가 있었지만(Tunsaringkarn et al., 2013), 남생이의 호르몬을 분석하기 이전에 붉은귀거북 암컷의 혈청의 농도를 다양하게 희석하여 신뢰성 있게 estradiol이 측정되는지를 먼저 확인한 후 실험을 진행하였다.
- 암컷의 난소에서 여포(follicle)와 알의 성숙과정을 서울 동물원에서 사육중인 등갑에 나타난 나이테와 출생기록에 근거하여 약 10살 이상의 성체들 중 동면을 수행한 암컷 3개체와 동면을 하지 않은 암컷 3개체를 각각 대상으로 초음파 검사를 이용하여 추적하였다. 초음파 검사는 동면한 남생이들이 동면에서 깨어난 후인, 2015년 4월 12일부터 시행하였는데, 약 2주 간격으로 2015년 11월 22일까지 시행하였다.
- 추가로 실험초기 단계에서 남생이 호르몬의 분석 시, 별도로 샘플을 준비하여 암컷 estradiol과 수컷 testosterone의 분석내변이계수(intra-assay coefficient of variation)와 분석간변이계수(inter-assay coefficient of variation)의 값을 각각 Schultheiss and Stanton (2009)의 방식으로 구하여, 호르몬 분석의 분석 내와 분석간 신뢰성 정도를 결정하였다. 자료의 분석에서는 동면을 수행한 암컷과 동면을 하지 않은 수컷이 각각 3마리이지만, 동면을 하지 않은 암컷과 동면을 수행한 수컷이 각각 1마리로 매우 적은 대상개체수를 고려하여 SPSSPC(ver. 21.0)를 이용하여 기술통계만을 수행한 후, 년 중 수컷과 암컷 성호르몬의 변동 경향을 동면 여부를 고려하여 그래프로 표시하였다.
- 암컷의 난소에서 여포(follicle)와 알의 성숙과정을 서울 동물원에서 사육중인 등갑에 나타난 나이테와 출생기록에 근거하여 약 10살 이상의 성체들 중 동면을 수행한 암컷 3개체와 동면을 하지 않은 암컷 3개체를 각각 대상으로 초음파 검사를 이용하여 추적하였다. 초음파 검사는 동면한 남생이들이 동면에서 깨어난 후인, 2015년 4월 12일부터 시행하였는데, 약 2주 간격으로 2015년 11월 22일까지 시행하였다. 연구기간동안 암컷이 알을 낳는 경우, 산란한 개체, 산란일, 알의 개수를 기록하였으며, 2015년 11월 22일 이후에도 연구대상 암컷이 알을 낳는 경우, 같은 정보를 기록하였다.
- 추가로 실험초기 단계에서 남생이 호르몬의 분석 시, 별도로 샘플을 준비하여 암컷 estradiol과 수컷 testosterone의 분석내변이계수(intra-assay coefficient of variation)와 분석간변이계수(inter-assay coefficient of variation)의 값을 각각 Schultheiss and Stanton (2009)의 방식으로 구하여, 호르몬 분석의 분석 내와 분석간 신뢰성 정도를 결정하였다. 자료의 분석에서는 동면을 수행한 암컷과 동면을 하지 않은 수컷이 각각 3마리이지만, 동면을 하지 않은 암컷과 동면을 수행한 수컷이 각각 1마리로 매우 적은 대상개체수를 고려하여 SPSSPC(ver.
- 추출된 호르몬은 삼광의료재단에서 Electrochemilumiescence immunoassay (ECLIA)방식으로 COBAS 6000 automated analyzer (Roche Diagnostics International Ltd.)를 이용하여 남생이의 성호르몬을 분석하였는데, 남생이에 특화된 암컷 estradiol과 수컷 testosterone 항체가 개발되어 있지 않아 호르몬 항체로는 각각 사람 호르몬의 항체인 Elecsys cobas estradiol-E2 (#03000079-122, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)와 testosterone kit (#11776061-122, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하였다. Testosterone의 측정 가능 범위는 0.
- 추출의 전체 과정은 위에서 기술한 지질성 호르몬의 추출과정을 동일하게 적용하였다. 추출로부터 얻어진 호르몬은 삼광의료재단에 의뢰하여 호르몬 양을 분석하고, 이를 바탕으로 호르몬 추출 효율성을 계산하였다.
- 측정된 자료의 분석에 있어, 여포와 난각이 형성된 알의 최대 측정 수를 개체 당 3개로 한정한 것을 고려하여, 우선 해당 검사 일 당 각 3개체로부터 관찰된 여포와 알의 수를 각각 최대 3에 대한 비율로 환산하여 분석하였으며, 관찰된 여포와 알의 최대 장경의 경우는 개체 당 평균값을 산출하였다. 동면 여부를 고려할 때, 실험에 사용한 암컷의 수가 3마리로 한정적임을 고려하여, 자료의 통계분석은 SPSSPC(ver.
- 행동자료의 분석을 위해서는 매일 24시간 동안 기록된 비디오를 재생시키면서 암컷과 수컷이 상호작용하는 경우, 이를 추출하여 분석하였다. 분석의 대상으로 삼은 암·수간의 상호행동으로는 상대방 머리에 자신의 머리를 부딪치거나, 상대개체의 서혜부에 자신의 코를 가까이 대는 행동, 상대개체를 몸으로 미는 행동을 상호행동의 경우로 포함하였다.
대상 데이터
- 2014년 11월부터 2015년 11월까지 암·수 각 4개체 총 8개체의 남생이로부터 총 72회의 혈액 샘플을 확보하였다.
- 분석의 대상으로 삼은 암·수간의 상호행동으로는 상대방 머리에 자신의 머리를 부딪치거나, 상대개체의 서혜부에 자신의 코를 가까이 대는 행동, 상대개체를 몸으로 미는 행동을 상호행동의 경우로 포함하였다.
- 서울동물원 내 남생이 야외방사장(390㎝×155㎝, 연못 390㎝×190㎝)에 남생이 암컷 6마리와 수컷 1마리를 합사하여 사육하면서 2014년 10월 22일부터 2015년 12월 22일까지 이들의 상호행동을 비디오로 촬영하였다.
- 실험 대상 개체들의 혈청 내 성호르몬을 분석하기 위하여, 2014년 11월부터 동면기인 12-2월을 제외하고 2015년 10월까지 공히 매월 마지막 주에 1㎖를 주사기(바늘 26게이지)를 이용하여 모든 6개체의 추골하정맥동으로부터 각각 1㎖의 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 SST Tube(SST Ⅱ Advance Plus Blood Collection Tubes.
- 서울동물원 내 남생이 야외방사장(390㎝×155㎝, 연못 390㎝×190㎝)에 남생이 암컷 6마리와 수컷 1마리를 합사하여 사육하면서 2014년 10월 22일부터 2015년 12월 22일까지 이들의 상호행동을 비디오로 촬영하였다. 실험에 사용한 총 7마리 중, 암컷 3마리와 수컷 1마리는 위에서 서술한 성호르몬 분석에도 이용된 개체였다. 행동 녹화 중, 2015년 6월부터 2015년 8월 사이에는 연구기관의 기기적 문제로 인하여 비디오를 촬영하지 못하여, 해당기간에는 상호행동을 분석할 수 없었다.
- 암컷과 수컷 남생이의 성호르몬을 측정하기 위하여 문화재청과 환경부의 허가를 받아 과천시에 위치한 서울동물원에서 사육중이며, 서울동물원의 생명윤리위원회로부터 사용에 관한 연구승인(2014-0001)을 받은 나이가 약 15년 이상인 성체 암컷 3개체(동면 개체), 수컷 1개체(비동면 개체)와 원주에 위치한 국립공원연구원에서 사육중인 암컷 1개체(동면 개체), 수컷 3개체(비동면 개체)를 이용하였다. 나이는 등갑에 나타난 나이테와 출생기록을 토대로 추정하였다.
- 초음파 검사는 서울동물원 동물병원에서 수의사가 진행하였으며, 초음파 기계로는 Logiq Book XP(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 사용하였다. 초음파 기계의 probe로는 8C-RS probe(4-10MHz)를 사용하였다.
- 혈청으로부터 호르몬 추출 효율성을 검정하기 위해서 상용 17β-estradiol (E8875, Sigma)를 사용하였다.
데이터처리
- 측정된 자료의 분석에 있어, 여포와 난각이 형성된 알의 최대 측정 수를 개체 당 3개로 한정한 것을 고려하여, 우선 해당 검사 일 당 각 3개체로부터 관찰된 여포와 알의 수를 각각 최대 3에 대한 비율로 환산하여 분석하였으며, 관찰된 여포와 알의 최대 장경의 경우는 개체 당 평균값을 산출하였다. 동면 여부를 고려할 때, 실험에 사용한 암컷의 수가 3마리로 한정적임을 고려하여, 자료의 통계분석은 SPSSPC(ver. 21.0)를 이용하여 기술통계만을 수행한 후, 년 중 여포와 알의 발달 변동 경향을 동면여부를 고려하여 그래프로 표시하였다.
- 그리하여, 모든 개별행동은 행동이 1회 관찰되는 경우 각각 1점을 받았으며, 월별로 이를 종합하여 암컷이 수컷에게와 수컷이 암컷에게 상호행동하는 횟수와 수컷이 암컷에게 구애하는 횟수로 정리하였다. 자료의 통계분석은 SPSSPC(ver. 21.0)을 이용하여 기술통계만을 수행한 후, 계절적 상호행동의 변동을 그래프로 표시하였다.
이론/모형
- 혈청으로부터 지질성인 성호르몬을 추출하기 위해서는 Velloso et al. (1998)의 방법을 따랐다. 각 샘플별로 미리 준비한 15㎖ tube에 0.
성능/효과
- 동면을 하지 않은 암컷의 경우 4월 12일, 25일에는 약 30% 개체에서만 여포가 관찰되었으며, 5월 10일부터 여포의 수가 증가하기 시작하여 6월 6일에는 최고점에 다다랐으며, 이후에는 여포를 가진 개체의 수가 주기적으로 줄어들기는 하였지만 대부분의 기간에 여포들이 관찰되었다(Figure 3A). 관찰되는 난각을 가진 알의 수를 살펴보면, 관찰이 시작된 4월 12일에는 모든 개체에서, 25일에는 70% 개체에서 난각을 가진 알이 관찰되는 반면, 5월 10-6월 6일 사이에는 20%로 감소하였으며, 6월 20일부터 8월 2일 사이에는 알이 전혀 관찰되지 않았다(Figure 3B). 이후 8월 16일부터 다시 난각을 가진 알이 관찰되었으며, 약 20%대에서 알이 지속적으로 관찰되어 연구가 종결된 11월 22일까지 관찰되었다.
- 구애행동들 중 구애, 마운팅, 교미는 각각 서로 다른 수준의 구애행동이 될 수 있지만, 교미의 경우 단 1회만 관찰된 것을 고려하여, 이들 사이의 위계를 다르게 하여 분석하지는 않았다. 그리하여, 모든 개별행동은 행동이 1회 관찰되는 경우 각각 1점을 받았으며, 월별로 이를 종합하여 암컷이 수컷에게와 수컷이 암컷에게 상호행동하는 횟수와 수컷이 암컷에게 구애하는 횟수로 정리하였다. 자료의 통계분석은 SPSSPC(ver.
- 반면, 암컷을 향한 수컷의 행동시도는 동면이 끝난 3월에 소폭 증가를 보인 후 9-10월에 가장 높은 빈도로 나타났다(Figure 5). 더불어서 짝짓기시도를 포함하는 수컷의 구애행동은 9월까지 낮은 수준을 보인 반면, 10월-11월에 높은 빈도를 보였다. 이러한 결과는 암컷에 대한 수컷의 관심이 동면 직후 및 9월-10월에 높게 나타나며, 이러한 암컷과 수컷과의 상호관계를 통하여 실질적인 짝짓기는 동면 전인 10월과 11월에 주로 이루어진다는 것을 보여준다.
- 동면한 암컷과 동면을 하지 않은 암컷에서 여포와 알의 발달 그리고 알의 산란시기를 살펴보면, 동면을 시키지 않는 것이 정상적인 번식주기를 크게 방해할 수 있다는 것을 보여준다. 동면을 수행한 개체는 6-7월에만 알을 산란하는 반면, 동면을 하지 않은 개체는 한 겨울까지 산란이 지속되었으며, 난각을 가지는 알 역시 동면을 한 암컷에서는 알이 발견되지 않는 8월에서 11월 사이에도 지속적으로 관찰되었다.
- 본 연구에서 estradiol 샘플(n=3)을 이용한 지질성 호르몬의 추출 효율은 95.31±7.48% 이었다.
- 암컷의 estradiol 농도에 있어 동면을 하지 않는 암컷의 경우 11월에도 높은 농도의 estradiol을 유지하고 있는 반면, 4월 초봄에 동면개체들보다 낮은 수준의 성호르몬 농도를 보여주고 있는데, 이는 정상적인 동면을 하지 않음에 따라, 겨울철인 11월에는 상대적으로 높은 성호르몬 농도를 유지하고 있지만, 초봄인 4-5월경에 낮은 성호르몬 농도를 초래하는 것으로 보인다. 비록 동면을 하지 않은 암컷과 동면을 수행한 수컷의 샘플수가 각각 1개체로 매우 작지만, 우리의 결과는 정상적인 동면을 수행하지 않는 경우 성호르몬의 정상적 계절적 변동을 방해할 가능성이 있음을 보여준다고 하겠다. 또한, 이러한 결과는 파충류에서 겨울철의 동면이 성호르몬의 정상적인 변동에 중요하다는 이전의 연구들과(Camazine et al.
- 6㎜까지 자란 후인 6월 초순-7월말 사이에 산란을 하는 것으로 나타났다. 성호르몬의 계절적 변동과 여포와 알의 발달은 암컷의 동면 여부에 큰 영향을 받으며, 동면을 수행하지 않은 암컷의 경우 특별히 알의 정상 발달을 방해하여 불규칙하고 과도하게 연장된 산란시기를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 연구의 결과는 멸종위기종인 남생이를 번식 후 사육하여 야외 개체군 보전 및 복원에 이용하는 경우, 효율적으로 개체들을 번식시키기 위한 매우 중요한 자료로 활용될 것으로 판단된다.
- 48% 이었다. 암컷 estradiol과 수컷 testosterone 호르몬의 각 샘플(n=3)을 이용하여 분석한 분석내 변이계수는 각각 7.96%와 11.09% 이었으며, 분석간 변이계수는 각각 10.40%와 5.86% 이었다.
- 우리의 연구결과를 보면 수컷들의 testosterone의 호르몬 피크는 동면 여부에 따라 각각 8월과 9월 1회 출현하였다. 암컷 estradiol의 농도는 7월부터 높게 증가하기 시작하여 8-10월 사이 동면여부에 상관없이 높은 농도를 유지하고 있어, 암컷과 수컷 남생이들의 성호르몬의 피크시기가 서로 겹치는 것으로 나타났다. 이는 이러한 시기에 암·수간에 구애와 짝짓기 행동이 일어날 수 있음을 의미한다.
- 연구결과 자료들을 종합하면, 수컷 testosterone은 8-9월 사이 최대 농도를 보이며, 암컷의 estradiol은 8-10사이 최대 농도를 보인다. 암·수간의 짝짓기는 봄에도 소규모로 나타날 수 있지만 주로 9-11월 사이에 이루어진다는 것을 보여준다.
- 관찰되는 난각을 가진 알의 수를 살펴보면, 관찰이 시작된 4월 12일에는 모든 개체에서, 25일에는 70% 개체에서 난각을 가진 알이 관찰되는 반면, 5월 10-6월 6일 사이에는 20%로 감소하였으며, 6월 20일부터 8월 2일 사이에는 알이 전혀 관찰되지 않았다(Figure 3B). 이후 8월 16일부터 다시 난각을 가진 알이 관찰되었으며, 약 20%대에서 알이 지속적으로 관찰되어 연구가 종결된 11월 22일까지 관찰되었다. 동면을 하지 않은 암컷은 한 마리가 6월 13일에 10개, 다른 한 마리가 10월 13일에 7개, 나머지 한 마리가 2월 10일에 6개의 알을 각각 산란하여, 산란 기간이 6월부터 2월에 걸쳐 큰 변이를 가지고 나타났다.
- 일반적으로 스테로이드 호르몬의 추출 효율이 70-97% 정도의 효율성을 보이는 것을 고려할 때(Shelby et al., 2000), 본 실험에서 얻은 95% 이상의 추출 효율은 암컷과 수컷의 혈청 내 성호르몬 양을 적절하게 측정할 정도의 호르몬이 추출됐음을 보여준다. 더불어서 지질성 호르몬의 분석내와 분석간 변이계수의 정도가 3-12% 정도 사이를 일반적으로 나타남을 고려할 때(Ott et al.
후속연구
- 성호르몬의 계절적 변동과 여포와 알의 발달은 암컷의 동면 여부에 큰 영향을 받으며, 동면을 수행하지 않은 암컷의 경우 특별히 알의 정상 발달을 방해하여 불규칙하고 과도하게 연장된 산란시기를 보이는 것으로 나타났다. 이러한 연구의 결과는 멸종위기종인 남생이를 번식 후 사육하여 야외 개체군 보전 및 복원에 이용하는 경우, 효율적으로 개체들을 번식시키기 위한 매우 중요한 자료로 활용될 것으로 판단된다.
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